去甲斑蝥素单酸钠盐衍生物及其抗肿瘤应用
【专利摘要】本发明提供了一种去甲斑蝥素单酸钠盐衍生物，其结构式如式7所示，活性测试证明，本发明设计并合成得到的去甲斑蝥素单酸钠盐衍生物7对于肝癌、胃癌及结肠癌三种具有良好的抑制活性，可望应用于制备上述三种抗肿瘤药物。
【专利说明】
去甲斑蝥素单酸钠盐衍生物及其抗肿瘤应用
技术领域
[0001] 本发明属于新药设计与合成领域，具体涉及一类新型去甲斑蝥素单酸钠盐衍生物 及其抗肿瘤应用。
【背景技术】
[0002] 斑蝥，也写作斑蟊，俗称班苗、西班牙苍蝇等，在我国现存最早的中药学专著《本草 纲目》、《神农本草经》等中都曾有记载。斑蝥是芫菁科昆虫南方大斑蟊或黄黑小斑蟊的干燥 体，属鞘翅目芫菁科昆虫，是我国最早发现的具有抗癌作用的药材之一。斑蝥性辛，热，具有 很强的肾毒性，同时具有破血逐瘀、去除淤积，消肿以及攻毒蚀疮的功效，临床常用于恶疮， 顽癣，狂犬病及癌症肿痛等的治疗。而后的研究表明，斑蝥的体内含有一种倍半萜类衍生 物，称之为斑蝥素(cantharidin，C 1QH1204)，具有较高的抗癌活性，具有非常高的药用价值。 斑蝥素为无色结晶，不溶于冷水，微溶于热水，溶于丙酮和氯仿。斑蝥素主要存在于多种昆 虫中，能使人体皮肤起疱，斑蝥素及其衍生物抗肿瘤的机制主要是抑制蛋白质与酸的合成， 增强机体对肿瘤细胞的杀伤力而达到治疗目的。斑蝥素及其类似物对肝癌，卵巢癌，食道癌 等有良好的疗效，它是通过改变蛋白质的活性，抗肿瘤侵袭转移，引起细胞周期阻滞，抑制 肿瘤生长，从而使得其死亡。其抗肿瘤的机制为通过减少癌细胞对氨基酸的摄取，抑制蛋白 质的合成，刺激淋巴细胞、巨噬细胞、多形核细胞产生白细胞介素，从而提高机体免疫力，同 时杀伤肿瘤细胞而达到治疗目的，与其他的抗肿瘤药物相比，斑蝥素及其衍生物有许多优 点:其在抑制肿瘤的同时，不仅没有免疫抑制的副作用，还能提升机体白细胞等。
[0003] 但斑蝥素对泌尿系统和肠胃系统有较大的毒副作用，斑蝥素既是抗肿瘤的活性成 分，同时也是毒性的主要成分。对其进行恰当的结构修饰，会在保留其抗肿瘤活性的基础 上，大大减低对机体的毒副作用，以去甲斑蝥素衍生物的合成为例。去甲斑蝥素不但保留了 其较强的抗肿瘤活性和升高白细胞的作用，还消除了其对泌尿系统的副作用，后来，以去甲 斑蝥素为先导化合物进行结构改造成为了研究的热点。这种优势在抗肿瘤药物中还是少见 的，所以引起了广泛的关注，陆续合成了许多减少其毒副作用但同时又保留其活性的同类 药物，开发更新高效低毒的衍生物是一个很好的研究方向。
[0004] 对斑蝥素进行结构修饰后用于治疗癌症的衍生物近年来陆续的出现，并开始运用 于临床治疗。如去甲斑蝥素，它比斑蝥素少了两个甲基，其毒性明显减低，而治疗作用却优 于斑蟊素。
[0005] 目前，斑蝥素和去甲斑蝥素都已经应用在临床中，这两个药物都各具有临床特点， 但不足之处是:这两个药物的水溶性都较差，生物利用度不高。从化学结构中看出，斑蝥素 和去甲斑蝥素的结构中均包含了分子内酸酐结构。而斑蝥酸即斑蝥素化合物的酸酐水解后 得到的二元羧酸化合物;斑蝥酸还未被开发成为药物，仅仅是报道了其结构式。
[0007] 此外，临床上还研究了斑蝥素钠，去甲斑蝥素钠，甲基斑蝥胺等，这些结构改造均 将斑蝥素及去甲斑蝥素的内酸酐环打开，以开环方式存在，从化学结构上看;对应的开环化 合物其相应的溶解度较大，其体内生物利用度也高。对斑蝥素的结构进行修饰，寻找高效低 毒的斑蝥素抗肿瘤药物，具有重要的工业应用价值和广泛的市场前景。申请号为 21^201410163619.4、21^201410163711.0、21^01410163705.5的中国专利公开了制备去甲基 斑蝥素酸盐的方法，迄今，尚未有报道设计并合成开环的去甲斑蝥素单酸钠盐衍生物结构 及合成方法。
【发明内容】
[0008] 为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型去甲斑蝥素单酸钠盐衍 生物、其合成方法及其抗肿瘤应用。为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
[0009] -方面，本发明提供了一种新型的去甲斑蝥素单酸钠盐衍生物，其结构式如式7所 示，
[0011] 另一方面，本发明提供了如上所述的去甲斑蝥素单酸钠盐衍生物7的合成方法，包 括以下步骤：1)、5_烯去甲斑蝥素1与苄醇反应得到5-烯去甲斑蝥素单酸苄酯5,2)、5_烯去 甲斑蝥素单酸苄酯5与氢氧化钠水溶液反应得到5-烯去甲斑蝥素单酸钠盐6,3)、到5-烯去 甲斑蝥素单酸钠盐6在有机溶剂中在催化剂存在下加氢还原得到去甲斑蝥素单酸钠盐7;合 成路线为：
[0012]
[0013] 上述合成方法中，所述步骤3)的催化齐lj选自Pd/C，Pd(0H)2/C，Pt/C或Raney Ni等 氢化催化剂;所述步骤1)的催化剂优选Pd/C或Pd(0H)2/C。
[0014]在上述合成方法中，有机溶剂可以依据反应对温度、溶剂极性的需求，从N，N_二甲 基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氢呋喃或乙醚中选择。例如，所述步骤3)的 采用的反应溶剂为醚类溶剂、卤代烃或醇类溶剂，例如：甲醇、乙醇、丙醇、乙酸乙酯、乙醚、 丙醚、四氢呋喃、二氯甲烷或氯仿等；更优选的，所述步骤3)的采用的反应溶剂为甲醇、乙 醇、丙醇、乙酸乙酯或四氢呋喃。
[0015] 活性测试证明，本发明设计并合成得到的去甲斑蝥素单酸钠盐衍生物7对肝癌、胃 癌及结肠癌三种肿瘤细胞具有良好的抑制活性。因此，本发明的第三方面提供了去甲斑蝥 素单酸钠盐衍生物7用于制备抗肝癌、胃癌及结肠癌三种肿瘤的药物中的用途。
[0016] 术语
[0017]本文中的缩写具有以下含义:小时缩写为h，分钟缩写为min;四氢呋喃缩写为THF， 求，N，N-二甲基甲酰胺缩写为DMF、二甲基亚砜缩写为DMS0;4-二甲氨基吡啶缩写为DMAP在 合成实施例中Μ代表mol/L，分子量缩写为FW。
【具体实施方式】
[0018] 以下将通过具体实施例进一步阐述本发明，但并不用于限制本发明的保护范围。 在不脱离本发明构思的前提下，本领域技术人员可在权利要求范围内对制备方法和使用仪 器作出改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附 权利要求为准。本发明中使用的呋喃，顺丁烯二酸酐，呋喃，四氢呋喃，二氯甲烷等反应试剂 及有机溶剂均来自上海国药集团。除特别说明外，所用试剂均为化学纯。
[0019] 合成路线为：
[0021] 上述合成路线的各步骤反应，可以用色谱法、液质连用谱来监控反应进程。色谱法 中，可适用薄层色谱TLC还可用气相色谱法或液相色谱法如HPLC代替等。
[0022]实施例1.5-烯去甲斑蝥素1的制备
[0023]从试剂瓶中取出一定量的顺丁烯二酸酐，置于干燥的研体中研细，再用电子天平 称取研细的顺丁烯二酸酐12.021g，置于干燥的三口烧瓶中，塞上塞子，再加乙醚搅拌，在乙 醚量为90mL时顺丁烯二酸酐完全溶解。待顺丁烯二酸酐完全溶解后，用滴液漏斗缓慢加入 13mL呋喃，用时13min。控制温度在38 °C开始反应。反应lh后溶液出现白色固体，且时间越长 白色固体越多。反应至24h后抽滤，得白色固体的化合物1，即5-烯去甲斑蝥素。干燥称重为 17.46g，收率85.8%。熔点：122~123°C，比移值Rf :0.52(展开剂为石油醚：乙酸乙酯=3:
[0024]实施例2.5-烯去甲蝥素单酸苄酯5的制备
[0025] 步骤：称取5-烯去甲斑蝥素3g(C8H6〇4，18.06mmol)，溶于二氯甲烷30ml中，加入 2 · 81ml苄醇（27 · 09mmol，1 · 5e · q·)和DMAP 220 · 63g( 18 · 06mmol，0 · lequ·)，室温下搅拌反应 3天，反应结束后溶剂中出现白色固体产物，抽滤，真空干燥，得到5-烯去甲蝥素单酸苄酯5 的固体产物2.538g，产率为51.24% /HNMI^DMSO-ds): δ: 12.43(s，lH)，7.31-7 ·35(ι?，5H)， 6.43(d，J = 4Hz，2H)，4.92-5.10(m，4H)，2.76(t，J = 8Hz，2H) .13CNMR(DMS〇-d6)J :173.07， 171.93，137.15，136.97，128.79，128.40,80.49,80.15,66.30,47.14,46.41.
[0026] 实施例3.5-烯去甲斑蝥素苄酯钠盐6的制备
[0027] 步骤:取5-稀去甲蜜素单酸节酯]^(〇151114〇5,3.65_31)，溶于351111甲醇中，加入氢 氧化钠153mg(3.83mmol)，室温下搅拌反应，反应结束后，减压除去溶剂，以甲醇为洗脱液过 硅胶柱，点板，收集显色样品，旋蒸干燥，得到固体产物1. 〇75g(296.4)，产率为99 %，Rf = 0.71(展开剂为石油醚：乙酸乙酯=3:1)，咕匪1?(020)^:7.25-7.28(111，5!1)，6.30((1，1 = 36Hz，2H)，4.90(dd，J = 12Hz，12Hz，4H)，2.64(dd，J = 8Hz，4Hz，2H).13CNMR(D2〇):S:178.71， 175.11，137.03，135.38，128.62，128.37，128.27,81.02,79.74,67.12,49.64,46.10.
[0028] 实施例4.去甲斑蝥素单酸钠盐7的制备
[0029]取5-烯去甲斑蝥素苄酯钠盐615 · 8mg(C15H13Na05，FW296 · 25，2 · 08mmol)，加入5ml 甲 醇40ml水使其溶解，加入61.58mg钯碳，真空除去烧瓶中空气，通入氢气，室温下搅拌反应， 反应结束后抽滤除去钯碳，减压除去溶剂，干燥，得到产物242.5mg，产率为56.05 %，々NMR (CD3OD)+D2〇J:4.65(s，2H)，2.81(s，2H)，1.50(dd，J = 8Hz，4Hz，2H)·
[0030] 实验例5.去甲斑蝥素单酸钠盐7的抗肿瘤活性测试
[0031] 细胞株和溶剂
[0032] 人肝癌细胞HEPG2，
[0033] 人胃癌细胞BGC803，
[0034] 人结肠癌细胞SW480，
[0035] 人胰腺癌细胞PANK-1，
[0036] 细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640中培养基，
[0037] 溶剂：二甲亚砜(简称为DMS0)。
[0038] CCK-8染色法检测细胞抗肿瘤活性实施方案
[0039] 本试验按照SRB方法，以斑蟊素为阳性对照，DMS0溶剂为空白对照，进行了浓度为 50nnmol/mL的去甲斑蝥素单酸钠盐衍生物7对肝癌细胞HEPG2、人胃癌细胞BGC803、结肠癌 细胞SW480及人胰腺癌细胞PANK-1的三种肿瘤细胞的抑制活性测试。
[0040]具体测试方案为：选用待测肿瘤活细胞比例达90%以上的细胞进行实验。细胞增 殖抑制试验采用EnoGeneCell? Counting Kit-8(简称为CCK-8)细胞活力检测试剂盒。细胞 消化、计数、制成浓度为1 X 105个/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入1 OOyL细胞悬液(每孔1 X104个细胞）；96孔板置于37°C，5%C02培养箱中培养24小时；每孔加入100yL相应的含药 物的培养基，作用浓度为50yMol/L(g卩：微摩尔/升），同时设立阴性对照组，溶媒对照组，阳 性对照组（阳性对照分别选用斑蝥素和喜树碱），每组5复孔;96孔板置于37°C，5%⑶2培养 箱中培养72小时后;每孔加入10yL CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4小时，用酶标仪 测定在450nm处的吸光值（简称0D值），计算各个化合物对人肝癌细胞HEPG2、人胃癌细胞 BGC803及人结肠癌细胞SW480肿瘤细胞的抑制率。
[0042]实验结果详见表1。
[0043]表1、去甲斑蝥素单酸钠盐衍生物7对于三种肿瘤细胞的抑制活性
[0045]由表1可知，在50nmol/L的相当低的作用浓度下，本发明合成得到的去甲斑蝥素单 酸钠盐衍生物7对人肝癌细胞HEPG2、人胃癌细胞BGC803及人结肠癌细胞SW480三种肿瘤细 胞具有一定的抑制效果，可将其用于制备抗肝癌的候选药物。
【主权项】
1. 一种去甲斑蝥素单酸钠盐衍生物，其结构式如式7所示，2. 如权利要求1所述的去甲斑蝥素单酸钠盐衍生物7的合成方法，包括以下步骤：1)、5_ 烯去甲斑蝥素1与苄醇反应得到5-烯去甲斑蝥素单酸苄酯5,2)、5_烯去甲斑蝥素单酸苄酯5 与氢氧化钠水溶液反应得到5-烯去甲斑蝥素单酸钠盐6,3)、到5-烯去甲斑蝥素单酸钠盐6 在有机溶剂中在催化剂存在下加氢还原得到去甲斑蝥素单酸钠盐7;合成路线为：3. 如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述步骤3)的催化剂选自包括Pd/C，Pd (OH)2/C，Pt/C或Raney Ni等在内的氢化催化剂;所述步骤1)的催化剂优选Pd/C或Pd(OH)2/ C〇4. 如权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述步骤3)的催化剂选Pd/C或Pd (OH) 2/ C〇5. 如权利要求2-4任意一项所述的合成方法，其特征在于，所述步骤3)的采用的反应溶 剂为醇类溶剂、酯类溶剂、醚类溶剂或卤代烃。6. 如权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述步骤3)的采用的反应溶剂为甲醇、 乙醇、丙醇、乙酸乙酯或四氢呋喃。7. 权利要求1所述的去甲斑蝥素单酸钠盐衍生物7用于制备肝癌、胃癌及结肠癌三种抗 肿瘤药物的用途。
【文档编号】C07D493/08GK105949214SQ201610451349
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】赵长阔, 王先恒, 贾佳, 罗灿敏
【申请人】遵义医学院