作为神经氨酸酶抑制剂的2,3-氟化糖苷及其作为抗病毒药物的用图
【专利摘要】提供了用于治疗或预防病毒性感染、特别是病毒性流感的结构通式(I)的化合物。还描述了其药物制剂以及其制备方法。通过抑制还称为病毒唾液酸酶的病毒神经氨酸酶来实现治疗效果。将这些神经氨酸酶归类为病毒酶的GH34族。
【专利说明】作为神经氨酸酶抑制剂的2,3-氟化糖苷及其作为抗病毒药物 的用途
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2009年7月15日提交的题目为"神经氨酸酶抑制剂：用于治疗流感的组 合物和方法"的第61/213,786号美国临时专利申请的权益，其以其整体内容通过引用并入 本文。
技术领域
[0003] 本申请涉及用于治疗或预防病毒性感染的治疗学、它们的用途以及方法。特别地， 本发明涉及用于治疗诸如流感的病毒性感染的化合物、组合物、治疗以及方法。
[0004] 背景
[0005] 流感病毒的感染和侵袭需要宿主细胞表面上中介性的唾液酸残留物。可交换使用 唾液酸和神经氨酸。类似地，可交换使用唾液酸酶和神经氨酸酶。通过病毒与这些唾液酸 (带电荷，9-碳糖类)经由病毒的血凝素蛋白的结合而发生病毒与宿主细胞的初始连接。一 旦在细胞内部，病毒就通过利用宿主细胞机制而复制。然而，为了保持最佳的感染性，病毒 演化为从宿主细胞表面切断唾液酸的神经氨酸酶以帮助病毒逃脱宿主细胞从而感染其它 细胞。不能从宿主细胞表面切断唾液酸导致病毒通过与宿主细胞连接而保留。
[0006] 神经氨酸酶的GH33族包括除了病毒酶(GH34族）之外的所有唾液酸酶。GH33族和 GH34族在结构和序列上不同（对于族分类的背景，参见Cantarel BL.等人（2009);以及 Henrissat B和Davies GJ(1997))。先前的工作表明2,3_二氟唾液酸为GH33神经氨酸酶的 有效抑制剂并且GH33神经氨酸酶通过共价中间体而继续(参见例如，Watts，A.等人(2003); Amaya，Μ· F ·等人（2004); Watts，A.G.和Withers，S · G · (2004); Watts，A.G.等人（2006); Newstead,S.等人（2008) ;Damager，I ·等人（2008);以及Buchini，S.等人（2008)) 〇
[0007] 文献中报道的GH34唾液酸酶（即病毒性唾液酸酶）的最可能的机制是涉及离子对 中间体的机制(von Itzstein M. (2007))〇
[0008] 已知许多化合物抑制神经氨酸酶。一些公知的神经氨酸酶抑制剂为包含唾液酸类 似物的烯烃（例如：那尼纳米韦CAS编号203120-17-6;奥司他韦（特敏福)CAS编号204255- 11-8;以及扎那米韦（瑞乐沙)CAS编号139110-80-8;还参见US5,360，817;以及Ikeda等人 Bioorganic&Medicinal Chemistry (生物有机化学和药物化学）（2006) 14:7893-7897)。已 经证明具有(反应性)氟化物离去基团的氟化的糖衍生物是一系列"保留"糖苷酶的抑制剂 并且通过形成特别稳定的糖基酶中间体而发挥作用（例如，Hagiwara等人（1994);以及 Buchini等人(2008))。这些试剂对它们的靶标酶是非常特异性的，并已经证明是高度生物 有效的并且甚至能够穿过血脑屏障。这类抑制剂在它们的作用方面是机制性的 (mechanism-based)，使病毒耐药性的发展变得困难，由此降低抑制作用的病毒酶中的任何 突变必然降低所述酶对天然底物，即唾液酸的功效，由此不太可能是耐药性的。
[0009] 概述
[0010] 本发明部分基于具有调节神经氨酸酶的本文描述的共价中间体的化合物的偶然 发现。具体地，本文识别的化合物表现出抑制神经氨酸酶，这可用于治疗或预防病毒性感 染。特别地，治疗或预防流感。
[0011] 本文描述的化合物可用于体内或体外研究用途（即非临床）以研究神经氨酸酶抑 制的机制。此外，可单独地或以体内或体外研究用试剂盒的一部分的形式使用这些化合物 以研究使用重组蛋白、病毒菌株、培养基中保持的细胞和/或动物模型的神经氨酸酶抑制。 或者，可将本文描述的化合物与商业包装和/或使用说明结合。
[0012] 本发明还部分基于本文描述的化合物还可用于为研究和治疗用途而体内或体外 调节神经氨酸酶活性的发现。可以有效量来使用化合物从而可调节神经氨酸酶活性。神经 氨酸酶可为病毒性的。神经氨酸酶可为流感神经氨酸酶。特别地，化合物可用于抑制神经氨 酸酶活性。可在用于病毒性感染研究的体内或体外模型中使用化合物调节活性。例如，流感 感染。此外，化合物调节活性可用于治疗或预防病毒性感染。所述病毒性感染可为流感。
[0013] 此外，本发明部分基于3-氟-唾液酸化合物可为GH34唾液酸酶抑制剂的理解，条件 是除了本文描述的合适的立体化学之外，化合物在碳2位置(通式I中的Z位置)具有充分的 离去基团。本文识别的化合物表现出神经氨酸酶的抑制，这可用于治疗或预防病毒性感染。 特别地，治疗或预防流感。
[0014] 根据一个实施方案，提供了具有通式I结构的化合物：
[0016] 其中
[0017] T为(Xf^M^COOHSCOOR1，
[0018] 其中妒为&-2〇直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基，
[0019] 其中所述任选的取代基选自氧基、(^{、(：1』广1、順2、^3!1、30 3!1和^)2中的一种 或多种，并且
[0020] 其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳可任选且独立地被0、N或S取代；
[0021] Z 为F、Cl、Br 或 0S02R2，
[0022] 其中妒为&-2〇直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基，
[0023] 其中所述任选的取代基选自氧基、0!^、(：1』^1、順2、^3!1、303!1和^) 2中的一种 或多种，并且
[0024] 其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳可任选且独立地被0、N或S取代；
[0025] A选自 Η、F、C1、Br、OH、CN、OR3、N〇2、S02R3、SR 3 和 C0R3，
[0026] 其中护为&-2〇直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基，
[0027] 其中所述任选的取代基选自氧基、0!^、(：1』^1、順2、^3!1、303!1和^) 2中的一种 或多种，并且
[0028]其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳可任选且独立地被0、N或S取代；
[0029] D 可选自 Η、F、Cl、Br、OH、CN、OR4、N〇2、S02R4、SR 4和 COR4，条件是 A和 D 可能不都是Η，并 且
[0030] 其中R4可为直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基，
[0031] 其中所述任选的取代基选自氧基、0!^、(：1』^1、順2、^3!1、30 3!1和^)2中的一种 或多种，并且
[0032] 其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳可任选且独立地被0、Ν或S取代；
[0033] Α和D任选地共同形成氧基；
[0034] X 可选自 N3、NH2、NHR5、NHCH3、NHCH2CH3、NHC (NH) NH2、NHC (NH) NHR5、NR5R6 和 NHC (NH) N (R5)R6，
[0035] 其中R5和R6可独立地为C6H 5、8烃基；
[0036] E可选自 NH2、NHC (0) CH3、OR7、NHR7和N(R7) (R8)，
[0037] 其中R7和R8可独立地为&-2〇直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基，
[0038] 其中所述任选的取代基可选自氧基、0!^、(：1』^1、順2、^3!1、30 3!1和^)2中的一 种或多种，并且
[0039] 其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳可任选且独立地被0、N或S取代；
[0040] Q可选自 CH20H、CH2R9、CH(R9) (R10)、C(R9) (R10) (R11)、
[0042] 其中
[0043] R9、R1Q和R11可独立地为CH3或CH 2CH3,并且
[0044] 各个 J和G 可独立地选自 Η、OH、OAc、0C (0) CH3、F、Cl、Br、N〇2、CN、OR12、S02R12、COR 12和 SR12，
[0045] 其中R12可为CH3XH2CH3或CH2CH2CH3;以及
[0046] M可为H、0H、0Ac、0C(0)CH3、NH2、FSC1，&&
[0047] L可为H、0H、0Ac、0C(0)R13SNH2，
[0048] 其中R13可为&-2〇直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基，
[0049] 其中所述任选的取代基可选自氧基、0!^、(：1』^1、順2、^3!1、30 3!1和^)2中的一 种或多种，并且
[0050] 其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳可任选且独立地被0、N或S取代。
[0051] 根据另外的实施方案，提供了具有通式I结构的化合物：
[0053] 其中
[0054] T可为(Xf^M^COOHSCOOR1，
[0055] 其中R1可为&-2〇直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基，
[0056] 其中所述任选的取代基可选自氧基、0!^、(：1、8^1、順2、^3!1、30 3!1和^)2中的一 种或多种，并且
[0057]其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳可任选且独立地被0、N或S取代；
[0058] Z 为F、Cl、Br 或 0S02R2，
[0059] 其中R2可为直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基，
[0060] 其中所述任选的取代基可选自氧基、0!^、(：1』^1、順2、^3!1、30 3!1和^)2中的一 种或多种，并且
[0061] 其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳可任选且独立地被0、N或S取代；
[0062] A可为F 或 C1;
[0063] D可为H;
[0064] X 可选自順2、NHCH3、NHCH2CH3、NHCH2CH2CH3 JHCH2CH2CH2CH3 和 NHC(NH)NH2;
[0065] E可为NH2 或NHC(0)CH3;
[0066] Q可选自：
[0068] 其中
[0069] 各个 J和G 可独立地选自 Η、0H、OAc、0C (0) CH3、F、Cl、Br、N〇2、CN、OR12、S02R12、C0R 12和 SR12，
[0070] 其中R12可为CH3、CH2CH3或CH2CH2CH3,以及
[0071 ] M可为H、0H、0Ac、0C(0)CH3、NH2、FSC1，W&
[0072] L可为H、0H、0Ac、0C(0)R13SNH2，
[0073] 其中R13可为Cho直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基，
[0074] 其中所述任选的取代基可选自氧基、0!^、(：1』^1、順2、^3!1、30 3!1和^)2中的一 种或多种，并且
[0075]其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳可任选且独立地被0、N或S取代。
[0076]根据其它实施方案，提供了具有通式I结构的化合物：
[0078] 其中
[0079] T可为(Xf^M^COOHSCOOR1，
[0080] 其中R1可为直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基，
[0081 ] 其中所述任选的取代基可选自氧基、0!^、(：1』^1、順2、^3!1、303!1和^) 2中的一 种或多种，并且
[0082] 其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳可任选且独立地被0、N或S取代；
[0083] Z 可为 F 或 C1;
[0084] A可为F 或 C1;
[0085] D可为H;
[0086] X 可选自順2、NHCH3、NHCH2CH3、NHCH2CH2CH3 JHCH2CH2CH2CH3 和 NHC(NH)NH2;
[0087] E可为NH2 或NHC(0)CH3;
[0088] Q可选自：
[0090] 其中
[0091] 各个J 和G 可独立地选自 H、0H、0Ac、0C(0)CH3、F、Cl、Br、N02、CN，
[0092] Μ可为H、0H、0Ac;W&
[0093] L可为H、0H、0Ac。
[0094] 根据其它实施方案，提供了用于调节病毒神经氨酸酶活性的本文描述的化合物。 病毒神经氨酸酶可为GH34神经氨酸酶。病毒神经氨酸酶活性的调节可为用于治疗动物中的 流感。动物可为哺乳动物。动物可为人。
[0095] 根据其它实施方案，提供了在制备用于调节病毒神经氨酸酶活性的药物中使用的 本文描述的化合物。病毒神经氨酸酶可为GH34神经氨酸酶。病毒神经氨酸酶活性的调节可 为用于治疗动物中的流感。动物可为哺乳动物。动物可为人。
[0096] 根据其它实施方案，提供了用于调节病毒神经氨酸酶活性的本文描述的化合物。 病毒神经氨酸酶可为GH34神经氨酸酶。病毒神经氨酸酶活性的调节可为用于治疗动物中的 流感。动物可为哺乳动物。动物可为人。
[0097] 根据其它实施方案，提供了可包含一种或多种本文描述的化合物和药物可接受的 赋形剂的药物组合物。病毒神经氨酸酶可为GH34神经氨酸酶。病毒神经氨酸酶活性的调节 可为用于治疗动物中的流感。动物可为哺乳动物。动物可为人。
[0098] 根据其它实施方案，提供了用于调节病毒神经氨酸酶活性的本文描述的化合物或 其药物可接受的盐。病毒神经氨酸酶可为GH34神经氨酸酶。病毒神经氨酸酶活性的调节可 为用于治疗动物中的流感。动物可为哺乳动物。动物可为人。
[0099]根据其它实施方案，提供了使用一种或多种本文描述的化合物或其药物可接受的 盐调节病毒神经氨酸酶活性的方法。病毒神经氨酸酶可为GH34神经氨酸酶。病毒神经氨酸 酶活性的调节可为用于治疗动物中的流感。动物可为哺乳动物。动物可为人。
[0100]根据其它实施方案，提供了可包含一种或多种本文描述的化合物或其药物可接受 的盐或其药物组合物的商业包装。商业包装可任选包含化合物或其药物可接受的盐或其药 物组合物在治疗流感中的使用说明。
[0101] T可为C(0)NH2、C00H或C00R1，其中R1可为Ci-20直链、支链或环状的饱和或不饱和的 任选取代的烃基，其中所述任选的取代基可选自氧基、OH、F、Cl、Br、I、NH 2、CN、SH、S03H和N〇2 中的一种或多种。或者，T 可为 C(0)0CH3、C(0)0CH2CH3、C(0)0CH2CH2CH3、C(0)0CH2CH2CH2CH3、C (0) OCH2CH2CH2CH2CH3、C (0) OCH2CH2CH2CH2CH2CH3、C (0) OCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3、C (0) OCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3或C00H。或者，T可为C (0) 0CH3、C (0) OCH2CH3、C (0) OCH2CH2CH3、C (0) OCH2CH2CH2CH3、C (0) OCH2CH2CH2CH2CH3 或 C00H 〇
[0102] A可选自？、(：1、8匕0!1、^01?3、吣2和〇)1?3，其中1? 3可为(：1-2()直链、支链或环状的饱和 或不饱和的任选取代的烃基，其中所述任选的取代基可选自氧基、〇H、F、Cl、Br、I、NH 2、CN、 SH、S03H和N02中的一种或多种，并且其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳可任选且 独立地被0、N或S取代。或者，A可选自F、Cl、Br、OH、CN、0R 3和N〇2，其中R3可为2〇直链、支链 或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基，其中所述任选的取代基选自氧基、〇H、F、Cl、Br、 1、1€12、^3!1、303!1和勵2中的一种或多种，并且其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳 可任选且独立地被〇、N或S取代。或者，A可选自F、Cl、Br、0H、CN和N〇2。或者，A可选自F、C1、 Br、0R3和N〇2，其中R3可为2Q直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基，其中所 述任选的取代基可选自氧基、01^、(：1、8^1、顺 2、^3!1、303!1和勵2中的一种或多种。或者，八 可选自F、C1和0R 3,其中R3可为Cut)直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基，其 中所述任选的取代基可选自氧基、〇^(：1、8^1、順 2、^3!1、303!1和勵2中的一种或多种。或 者，A可为F、C1。或者，A可为F。
[0103] D可选自!1小、(：1、8匕0!1、^01?4、^)2和0)1?4，条件是厶和0可能不都是!1，并且其中1? 4 为Cm直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基，其中所述任选的取代基可选 自氧基、01^、(：1、8^1、顺2、^3!1、30 3!1和勵2中的一种或多种，并且其中所述任选取代的烃 基的零至十个骨架碳可任选且独立地被〇、N或S取代。或者，D可选自H、F、Cl、Br、0H、CN、0R 4、 N〇2和COR4，条件是A和D可能不都是Η，并且其中直链、支链或环状的饱和或不饱和 的任选取代的烃基，其中所述任选的取代基可选自氧基、0H、F、Cl、Br、I、NH 2、CN、SH、S03^P N〇2中的一种或多种。或者，D可选自!^、(：1、8匕0!1和从) 2，条件是4和0可能不都是!1。或者，0可 选自H、F、Cl、Br和OH，条件是A和D可能不都是H。或者，D可选自H、F、Cl和Br，条件是A和D可能 不都是H。或者，D可选自H、F和C1，条件是A和D可能不都是H。或者，D可选自H、F和C1，条件是A 和D可能不都是Η。或者，D可为F或Cl。或者，D可为Η或F，条件是A和D可能不都是Η。或者，D可 为F。或者，D可为Η，条件是A和D不都是H。
[0104] X 可选自 NH2、NHR5、NHCH3、NHCH2CH3、NHC (NH) NH2、NHC (NH) NHR5 和 NR5R6，其中 R5 和 R6 可 独立地为 C6H5、CH2C6H5 或 Ci-8 烃基。或者，X 可选自順2、NHR5、NHCH3、NHCH2CH3、NHC(NH)NH 2 和 NHC (NH)NHR5，其中 R5 可为 C6H5、CH2C6H5 或 Ci-8烃基。或者，X可选自順2、NHR5、NHCH3、NHCH2CH 3 和NHC (NH) NH2，其中 R5 可为 C6H5、CH2C6H5 或 Ci-8烃基。或者，X可选自 NH2、NHR5、NHCH3、NHCH2CH3 和 NHC (NH) NH2，其中 R5 可为 C6H5、CH2C6H5 或 Ci-8烃基。或者，X可选自 NH2、NHR5、NHCH3、NHCH2CH3 和 NHC (NH)NH2,其中R5可为Ci-8烃基。或者，X可选自NH2、NHCH 3和NHC(NH)NH2。或者，X可选自NH2、 NHCH2CH3 和NHC (NH) NH2。或者，X可为NH2 或NHC (NH) NH2。
[0105] E可选自NH2、NHC (0) CH3、OR7、NHR7，其中R7可独立地为Ci- 1Q直链、支链或环状的饱和 或不饱和的任选取代的烃基，其中所述任选的取代基可选自氧基、〇H、F、Cl、Br、I、NH 2、CN、 SH、S03H和N02中的一种或多种，并且其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳可任选且 独立地被0、N或S取代。或者，E可选自NH 2、NHC (0) CH3、0R7和NHR7，其中R7可独立地为&- 10直 链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基，其中所述任选的取代基可选自氧基、 0!^、(：1、8匕1、顺2、^5!1、5〇311和如2中的一种或多种。或者』可选自順2、順(：(0)013和01? 7， 其中R7可独立地为Cho直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基，其中所述任选 的取代基可选自氧基、〇!^、(：1、8^1、順 2、^3!1、303!1和^)2中的一种或多种。或者4可为 NH2或NHC (0) CH3。或者，E可为NHC (0) CH3。
[0106] Q可选自 CH2R9、CH(R9) (R10)、C(R9) (R10) (R11)、
[0108] 其中，R9、R1Q和R11可独立地为CH 3或CH2CH3，并且各个J和G可独立地选自H、0H、OAc、 0(：(0)013小、(：1、8广勵2、^01?12、5〇21?12、0)1?12和51? 12，其中1?12可为013、012〇13或012〇12(：!13;以 及Μ 可为!1、0!1、(^(3、0(：(0)013、顺2』或(：1，以及1^可为!1、0!1、(^(3、0(：(0)1?13或順2，其中1? 13可为 Cho直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基，并且其中所述任选的取代基可 选自氧基、〇!^、(：1、8广1、順 2、^3!1、3〇3!1和勵2中的一种或多种。或者，0可选自：
[0110]各个J 和 G可独立地选自 H、0H、0Ac、0C(0)CH3、F、Cl、Br、N02、CN，]\iSTSH、0H、0Ac、0C (0)CH3、NH2、F或C1，以及L可为!1、0!1、(^(3、0(：(0)1? 13或順2。或者，〇可选自：
[0112] 各个J和G可独立地选自Η、OH、OAc，Μ可为Η、0H或OAc，以及L可为Η、0H或OAc。或者，Q 可为：
[0114] 各个J和G可独立地选自Η、OH、OAc，Μ可为Η、0H或OAc，以及L可为Η、0H或OAc。或者，Q 可为：
[0116] 各个J和G可独立地选自0H、0Ac，M可为0H或OAc，以及L可为0H或OAc。
[0117]根据其它实施方案，提供了制备化合物2的方法：
[0118] 所述方法包括:在MeN02/H20的存在下，使化合物SAN3:
[0120]与选择性氟试剂(Selectfluor)反应至少4天以形成化合物1:
[0122] 以及在-30°C至0°C下，使化合物1与三氟化二乙氨基硫(DAST)、CH2CL 2反应。
[0123] 所述方法还可包括：将化合物2与NaOMe和MeOH混合;然后与Pd/C、H2和MeOH混合； 然后与Li0H、H 20和MeOH混合以形成化合物4:
[0125]根据其它实施方案，提供了制备化合物12的方法，所述方法可包括将化合物2:
[0127] 与NaOMe和MeOH混合;然后与AcOH混合直至中性;然后与PMe3、H 20和MeOH混合;然后 在Et3N、MeOH和DMF中与化合物VII:
[0129] 反应以生成化合物VIII:
[0131] 然后使化合物VIII与Li0H、H20和THF反应;然后与Pd/C、H 2、H20和THF反应。
[0132]根据其它实施方案，提供了可选自表2A和表2B所不化合物中的一种或多种的化合 物。
[0133] 附图简述
[0134] 图1显示神经氨酸酶机制。
[0135] 图2显示通过2，3-二氟唾液酸（1)的神经氨酸酶的失活。
[0136] 图3A和3B显示由浓度(3A)表示的通过化合物4的流感唾液酸酶(亚型N9)的时间依 赖性失活(3A)，以及拟一级反应失活动力学常数(k lclbs)与化合物4的浓度的重新绘图（3B)。
[0137] 图4A和4B显示在IV和IN给药之后DFSA-4GU血浆水平。
[0138] 图5A、5B和5C显示在IV和IN给药之后DFSA-4GU气管水平。
[0139] 图6A、6B和6C显示在IV和IN给药之后DFSA-4GU肺部水平。
[0140] 图7显示在IV和IN给药之后扎那米韦肺部水平。
[0141] 图8显示感染有HK1H2N3流感A病毒和使用神经氨酸酶抑制剂治疗的小鼠的生存绘 图。
[0142] 详述
[0143] 如本文使用的，根据本领域技术人员通常的理解使用短语"Cx-y烃基"或"Cx-C y烃 基"，并且通常是指具有包含X至y(具有包含在所述范围内的所有单独的整数，包括整数X和 y)个碳原子的碳骨架或主碳链的化学实体。例如，" Cm烃基"为在其碳骨架或主链中具有 1、 2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的化学实体。
[0144] 如本文使用的，根据本领域技术人员通常的理解使用术语"支链的"，并且通常是 指包含分裂为多于一个连续链的骨架或主链的化学实体。以多于一个方向分裂的骨架或主 链部分可为直链、环状或其任意组合。直链烃基的非限制性实例为叔丁基和异丙基。
[0145] 如本文使用的，根据本领域技术人员通常的理解使用术语"无支链的"，并且通常 是指包含不分裂为多于一个连续链的骨架或主链的化学实体。无支链烃基的非限制性实例 为甲基、乙基、正丙基和正丁基。
[0146] 如本文使用的，根据本领域技术人员通常的理解使用术语"取代的"，并且通常是 指具有由包含一个或多个杂原子的不同化学基团取代的化学基团的化学实体。除非另外规 定，取代的烃基为其中一个或多个氢原子由一个或多个不是氢的原子取代的烃基。例如，氯 甲基为取代的烃基的非限制性实例，更具体地为取代的甲基的实例。氨基乙基为取代的烃 基的另一非限制性实例，更具体地为取代的乙基。本文描述的官能团可由例如而不限于1、 2、 3、4、5、6、7、8、9或10个取代基取代。
[0147] 如本文使用的，根据本领域技术人员通常的理解使用术语"未取代的"，并且通常 是指为烃和/或不包含杂原子的化学实体。未取代的烃基的非限制性实例包括甲基、乙基、 叔丁基和戊基。
[0148] 如本文使用的，当指代化学实体时，根据本领域技术人员通常的理解使用术语"饱 和的"，并且通常是指仅包含单键的化学实体。饱和的化学实体的非限制性实例包括乙烷、 叔丁基和n+h 3。
[0149] 如本文使用的，根据本领域技术人员通常的理解使用术语"卤代的"，并且是指其 中氢原子由诸如氯、氟、碘或溴的卤素原子取代的部分或化学实体。例如，氟化的侧链是指 其中一个或多个氢原子由一个或多个氟原子取代的侧链。
[0150] 饱和的Q-Cn)烃基的非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、仲丙基、正丁 基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、叔戊基、正己基、异己基、1，2_二甲基 丙基、2_乙基丙基、1_甲基_2_乙基丙基、1_乙基_2_甲基丙基、1，1，2_二甲基丙基、1，1，2_二 乙基丙基、1，1-二甲基丁基、2,2_二甲基丁基、2-乙基丁基、1，3-二甲基丁基、2-甲基戊基、 3-甲基戊基、仲己基、叔己基、正庚基、异庚基、仲庚基、叔庚基、正辛基、异辛基、仲辛基、叔 辛基、正壬基、异壬基、仲壬基、叔壬基、正癸基、异癸基、仲癸基和叔癸基。C2-C1Q烯基的非限 制性实例可包括乙烯基、稀丙基、异丙烯基、1-丙稀-2 -基、I-丁烯基、I-丁烯基、I-丁 稀-3-基、2-丁稀-1-基、2-丁稀_2_基、辛烯基和癸烯基。C2 -Ci〇炔基的非限制性实例可包括 乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基和癸炔基。饱和的&_&〇烃 基、C 2-C1Q烯基或C2-C1Q炔基可为例如而不限于由一个或多个独立地为氮、硫或氧的杂原子 中断。
[0151 ] C6-Cio芳基的非限制性实例可包括苯基(Ph)、并环戊二烯基(pentaleny)、讳基、萘 基和奥基。C6-9芳基-Ch烃基可为例如而不限于具有上述任何地方所定义的C6- 9芳基作为取 代基的上述任何地方所定义的&-4烃基。C6-8芳基-C2-4烯基可为例如而不限于具有上述任何 地方所定义的C6-8芳基作为取代基的上述任何地方所定义的C2-4烯基。C6-8芳基-C2-4炔基可 为例如而不限于具有上述任何地方所定义的C6-8芳基作为取代基的上述任何地方所定义的 C2-4炔基。包含一个或多个独立地为氮、硫或氧的杂原子的4元至10元非芳香族杂环基团的 非限制性实例可包括吡咯烃基、吡咯啉基、哌啶基、哌嗪基、咪唑啉基、吡唑烷基、咪唑烷基、 吗啉基、四氢吡喃基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、氧硫杂环戊基、邻苯二甲酰亚胺和琥珀 酰亚胺。包含一个或多个独立地为氮、硫或氧的杂原子的5元至10元芳香族杂环基团的非限 制性实例可包括吡咯基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、噻唑基和噁唑基。
[0152] 包含本文描述的通式的实施方案包括所有可能的立体化学替代物，包括本文例示 或描述的那些。
[0153] 在一些实施方案中，本文描述的化合物或上述其可接受的盐可用于病毒性感染的 全身治疗或预防。在一些实施方案中，本文描述的化合物或上述其可接受的盐可在用于病 毒性感染的全身治疗或预防的药物或组合物的制备中使用。在一些实施方案中，还提供了 本文描述的任何感染的全身治疗的方法。一些实施方案使用包含本文描述的化合物和药物 可接受的赋形剂或载体的组合物。在一些实施方案中，病毒性感染至少部分由流感病毒引 起。还提供了本文描述的任何适应症的治疗方法。这类方法可包括向有需要的个体给予本 文描述的化合物或本文描述的化合物的组合物或有效量的本文描述的化合物或本文描述 的化合物的组合物。
[0154]本文描述的化合物可为游离形式或其盐形式。在一个实施方案中，本文描述的化 合物可为本领域已知的药物可接受的盐形式(Berge等人，J.Pharm. Sci · 1977,66,1)。本文 所使用的药物可接受的盐包括例如具有母体化合物的期望的药理学活性的盐(保留母体化 合物的生物学有效性和/或性质的盐并且其不是生物学不期望和/或其它不期望的盐）。具 有一个或多个能够形成盐的官能团的本文描述的化合物可例如以药物可接受的盐的形式 而形成。包含一个或多个碱性官能团的化合物能够与例如药物可接受的有机酸或无机酸形 成药物可接受的盐。药物可接受的盐可源自例如而不限于乙酸、脂肪酸、海藻酸、天冬氨酸、 抗坏血酸、苯甲酸、苯磺酸、丁酸、肉桂酸、柠檬酸、樟脑酸、樟脑磺酸、环戊丙酸、二乙基乙 酸、二葡萄糖酸、十二烷基磺酸、乙烷磺酸、甲酸、富马酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、甘油磷酸、乙 醇酸、半磺酸(hemisulfonic acid)、庚酸、己酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、2-羟基乙烷磺酸、异 烟酸、乳酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、扁桃酸、甲烷磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、对甲苯磺酸、 烟酸、硝酸、草酸、扑酸、果胶酯酸、3-苯基丙酸、磷酸、苦味酸、庚二酸、特戊酸、丙酸、丙酮 酸、水杨酸、琥珀酸、硫酸、氨基磺酸、酒石酸、硫氰酸或十一烷酸。包含一个或多个酸性官能 团的化合物能够与药物可接受的碱形成药物可接受的盐，所述药物可接受的碱例如而不限 于基于碱金属或碱土金属的无机碱或诸如伯胺化合物、仲胺化合物、叔胺化合物、季胺化合 物、取代的胺、天然存在的取代的胺、环胺或碱性离子交换树脂的有机碱。药物可接受的盐 可源自例如而不限于药物可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳氢酸盐，所述药物 可接受的金属阳离子例如铵、钠、钾、锂、钙、镁、铁、锌、铜、锰或铝、氨、节星、葡甲胺、甲胺、 二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、异丙胺、三丙胺、三丁胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲 基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、哈胺、胆碱、 甜菜碱、乙二胺、葡萄糖胺、葡糖胺(glucamine)、葡甲胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、普鲁卡 因、N-乙基哌啶、可可碱、四甲铵化合物、四乙铵化合物、吡啶、N，N-二甲基苯胺、N-甲基哌 啶、吗啉、N-甲基吗啉、N-乙基吗啉、二环己胺、二苄胺、N，N-二苄基苯乙胺、1-二苯羟甲胺、 N，N'_二苄基乙二胺或聚胺树脂。在一些实施方案中，本文描述的化合物可包含酸性基团和 碱性基团，并可为内盐或两性离子形式，例如而不限于甜菜碱。可通过本领域技术人员已知 的常规方法制备本文描述的盐，例如而不限于通过使游离形式与有机酸、无机酸、有机碱或 无机碱反应，或通过从其它盐进行阴离子交换或阳离子交换。本领域技术人员理解盐的制 备可在化合物的分离和/或纯化过程中原位发生，或者盐的制备可通过使分离和/或纯化的 化合物单独反应而发生。
[0155] 在一些实施方案中，本文描述的化合物及其所有不同形式(例如，游离形式、盐、多 晶型、同分异构形式)可为溶剂加成形式，例如，溶剂化物。溶剂化物包含化学计量或非化学 计量的与化合物或其盐物理缔合的溶剂。溶剂可为例如而不限于药物可接受的溶剂。例如， 当溶剂为水时形成水合物，或者当溶剂为醇时形成醇化物。
[0156] 在一些实施方案中，本文描述的化合物及其所有不同形式(例如，游离形式、盐、溶 剂化物、同分异构形式）可包括晶体和/或无定形形式，例如，多晶型、假多晶型、构象多晶 型、无定形形式或其组合。多晶型包括化合物相同元素组成的不同晶体组合排列。多晶型通 常具有不同的X射线衍射图谱、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶形、光学或电学性质、稳定性 和/或溶解性。本领域技术人员理解包括重结晶溶剂、结晶速率和储存温度的多种因素可能 导致一种晶体形式占优势。
[0157] 在一些实施方案中，本文描述的化合物及其所有不同形式(例如，游离形式、盐、溶 剂化物、多晶型)包括异构体，例如几何异构体、基于不对称碳的光学异构体、立体异构体、 互变异构体、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、外消旋体、非对映混合物及其组合， 并且不受为了方便而例示的通式的描述限制。
[0158] 在一些实施方案中，本发明的药物组合物可包含这类化合物的盐，优选包含药物 或生理可接受的盐。药物制剂通常包含一种或多种针对制剂给药方式可接受的载体、赋形 剂或稀释剂，所述制剂给药方式通过注射、吸入、局部给药、灌洗或适用于所选择的治疗的 其它方式。合适的载体、赋形剂或稀释剂包括用于这种给药方式的本领域已知的那些。
[0159] 合适的药物组合物可通过本领域已知的方法进行配制并且其给药方式和剂量由 熟练的医生进行确定。对于肠胃外给药，可将化合物溶解于无菌水或盐水或用于非水溶性 化合物的给药的药物可接受的媒介中，例如用于维生素 K的那些。对于肠内给药，可以片剂、 胶囊剂形式给予化合物或将化合物溶解在液体形式中。片剂或胶囊剂可为肠溶包衣的，或 为缓释剂型。许多合适的剂型为已知的，包括包封待释放的化合物的聚合物或蛋白质微粒、 软膏剂、糊剂、凝胶剂、水凝胶剂或其能用于局部(topically)或局部（locally)给予化合物 的溶液剂。可采用缓释膏药或植入剂以提供延长时间的释放。本领域技术人员已知的许多 技术在Alfonso Gennaro的Remington:the Science&Practice of Pharmacy(雷明屯页：药学 科学与实践），第20版，Lippencott Williams和Wilkins，（2000)中进行描述。肠胃外给药的 剂型可例如包含赋形剂、诸如聚乙二醇的聚亚烷基二醇、植物来源的油或者氢化的萘。可将 生物相容性、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共 聚物用于控制化合物的释放。用于调节化合物的其它可能有用的肠胃外递送体系包括乙 烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透栗、可植入的灌输系统以及脂质体。用于吸入的剂型可包 含诸如乳糖的赋形剂，或可为包含诸如聚氧乙烯-9-月桂醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶 液，或可为用于以鼻滴剂形式给药的油性溶液，或可为凝胶剂。对于鼻内递送，剂型可为专 门制备的。例如，鼻用吸入剂。
[0160]可通过诸如植入物、移植片、假体、支架等医疗装置或器械来给予本发明或用于本 发明的化合物或药物组合物。此外，可设计意图包含并释放这类化合物或组合物的植入物。 实例为适于在一段时间内释放化合物的由聚合物材料制成的植入物。
[0161]本文描述的药物组合物的"有效量"包括治疗有效量或预防有效量。"治疗有效量" 是指在给药时和必需的一段时间内有效以实现期望的治疗效果的量，例如减少的病毒量、 增加的寿命或增加的预期寿命。化合物的治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性 别和体重以及化合物在个体中引起期望反应的能力的因素而变化。可调节给药方案以提供 最佳治疗反应。治疗有效量还为其中治疗有益作用大于化合物毒性或有害作用的量。"预防 有效量"是指在给药时和必需的一段时间内有效以实现期望的预防效果的量，例如不太严 重的感染或延迟感染或不发病、增加的寿命、增加的预期寿命或防止感染的发展。通常，在 疾病之前或疾病的早期阶段在个体中使用预防剂量以使预防有效量可能小于治疗有效量。
[0162] 应注意剂量值可随待减轻的疾病状态的严重程度而变化。对于任何特定的个体， 可根据个体需要和管理或监督组合物给药的人员的专业判断而随时间调整具体的给药方 案。本文所述的剂量范围仅为示例性的，并且不限制可由医师选择的剂量范围。组合物中活 性化合物的量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重的因素而变化。可调整给药方 案以提供最佳的治疗反应。例如，可给予一种丸剂，可随时间给予若干分开的剂量，或者可 根据治疗情况的紧急状况的指示而适当降低或增加剂量。有利的是以易于给药和剂量均匀 的剂量单位形式来配制肠胃外组合物。
[0163] 在一些实施方案中，可例如而不限于与其它治疗方法结合使用本文描述的化合物 及其所有不同形式。
[0164] 通常，在不引起明显毒性的情况下使用本文描述的化合物。能使用标准技术，例 如，通过在细胞培养基或实验动物中测试并测定治疗指数，即LD50(达到总数的50%的致死 剂量)和LD100 (达到总数的100 %的致死剂量)之间的比值来测定本发明化合物的毒性。然 而，在一些环境下，例如在严重的疾病状态下，可能必须给予明显过量的组合物。本文描述 的一些化合物在一些浓度下可能是有毒的。可使用滴定研究来测定毒性和非毒性浓度。可 通过检查特定化合物或组合物穿过细胞系的特异性来评价毒性。如果化合物对其它组织具 有任何影响，那么可以使用动物研究来提供指示。
[0165] 可将本文描述的化合物给予个体。如本文使用的，"个体"可为人、非人灵长类动 物、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等。个体可能疑似患有或处于患有诸如病毒性 感染的感染的风险，或疑似患有或处于患有病毒性感染的风险。特别地，可通过神经氨酸酶 介导感染。诸如流感的病毒性感染的诊断方法以及诸如流感的病毒性感染的临床界定 (clinical delineation)对于本领域技术人员而言是已知的。
[0166]表1:用于神经氨酸酶调节活性而制备和测试的化合物
[0167]表1:2,3-氟化的糖苷
[0170] 表2A具有神经氨酸酶调节活性的化合物
[0171] 表2A:具有神经氨酸酶调节活性的2,3_氟化的糖苷
[0173] 表2B制备并预测具有神经氨酸酶调节活性的化合物
[0174] 图2B: 2，3_氟化糖苷化合物
[0177] 本文描述的化合物还可用于化验或用于研究目的。
[0178] 可使用本文描述的方法合成在本方法中使用的化合物。
[0179] 本文描述了各种替代实施方案或实例。
[0180] 这些实施方案和实例为例示性的并且不应解释为限制本发明的范围。
[0181] Hagiwara等人在先公开的著作（1994)报道了仅作为适度的唾液酸酶抑制剂的3-氟-唾液酸。具体地，他们报道了两种化合物，一种在碳2位置(式I中的位置Z)具有0H基。然 而，0H基不是捕获共价中间体的充分的离去基团。因此，Hagiwara等人的0H化合物(相当于 通式I中Z的C2位置)表现出最小的抑制。此外，Hagiwara等人测试的在C2位置(相当于通式I 中的Z)具有氟(充分的离去基团）的其它化合物不具有正确的立体化学。因此，在Hagiwara 中缺少这些要求的鉴别。
[0182] 一般方法
[0183] 合成
[0184] 用于式I化合物的化学制备的一般方法在下列非限制性例示的方案中进行描述。
[0186] 将选择性氟试剂(3.5 eq.)加入至SAN3(1 eq.)的MeN02/水(3/1~4/1)溶液，并在 室温下将溶液搅拌3天或更多以完成反应(SAN3的合成-Chandler,M.等人，Journal of the Chemical Society-Perkin Transactions 1，1995; 1173-1180)。使用饱和NaHC〇3将反应混 合物淬灭并且使用EtOAc萃取。通过TLC能容易地确定化合物（1)的存在。轴向-F(l)具有比 起始原料低的Rf值，并且赤道-F化合物和任何其它的立体异构体(异头羟基异构体)具有比 起始原料高的Rf值。在 19F NMR实验上的-204ppm处检测出C3位置的氟，并且基于1H-和19F-NMR耦合常数确定立体化学。耦合常数Jh 3/F3 (47.9Hz)和JF3/h4 (31.0Hz)分别指示C3处的氟原 子的轴向构型。
[0187] 表3:使用选择性氟试剂对在C3位置的氟化的检测
[0189]通过TLC上的UV能监测反应的完成，因为在短UV下仅可检测出起始原料。在UV活性 化合物消失时，认为反应完成。
[0191] 在_40°C下，将DAST(1. leq.)滴加至化合物l(leq.)的DCM悬浮液，并将溶液剧烈搅 拌30分钟。在混合物变澄清后，使用饱和NaHC03淬灭反应混合物并使用DCM和EtOAc萃取以 产生化合物2。如果反应混合物在20分钟之后不变澄清，则将反应混合物放置在-10°C的水 浴中，时间为10分钟。
[0192] 在室温下，在MeOH中使用Pd/C将化合物2氢化过夜，然后过滤除去催化剂并向反应 混合物加入6M的NaOMe。然后使用IR120 (H+，强)酸化混合物以去除Na+。过滤除去树脂并且将 滤液蒸发并层析(EtOAc/MeOH/水= 15/2/1)。通过使用茚三酮溶液染色来监测氢化。分离化 合物3和4。
[0193]
[0194] 在室温下，向化合物3的MeCN/水（5/1)溶液加入乙醛（2eq)。在30分钟之后，加入 4eq的NaCNBH 3并在相同温度下将反应混合物搅拌10分钟。使用5 %的柠檬酸淬灭反应混合 物并使用EtOAc/丙酮(9/1)层析。
[0195] 在湿的MeOH中使用6M的NaOMe将单乙酰化的胺(6)脱保护以生成化合物7。
[0197]在室温下，在干燥的EtOH中使用催化的HC1(2M HC1的Et20)将化合物4重新酯化。 将反应混合物放置过夜，然后蒸发。通常加入2eq的HC1。能通过硅胶层析分离乙酯。
[0199]在室温下，在湿的MeOH中使用6M的NaOMe将二氟化的化合物2脱保护，并在使用 IR120(强H+)酸化之后，容易通过硅胶层析纯化化合物8,产率为90%。
[0201]使用Pd/C将叠氮化物2氢化以产生化合物3,然后使NH3(g)冒气泡以去除乙酸盐并 且以良好的产率产生酰胺4。
[0203]为了制备化合物11，在吡啶中使用Ac20将胺3乙酰化，并使用NaOMe选择性去除0-乙酰化物和甲酯。将N-乙酰化的化合物11纯化并且以70 %的产率(三个步骤的总和)获得。
[0205] 在60°C下，在MeOH中使用3,5-二甲基吡唑-1-甲脒和Et3N制备鸟苷酸化的化合物 12，时间为3周。在三周后淬灭反应混合物，并成功回收50 %的起始原料4。以80 %的产率分 离4-鸟苷酸化的12,并在室温下在EtOH中使用催化的HC1重新酯化5小时之后，以80%的产 率产生乙酯13。
[0206]可通过在下列非限制性例示的方案中所述描述的化学方法来制备式I的化合物。
[0208] 2,3-二氟唾液酸的4-氨基衍生物的合成。试剂和条件如下:Ref 1为Chandler等人 (1995)J Chem Soc.Perk.Trans l，1173_1180;(a)4eq的选择性氟试剂，MeN02/水（3/1)，室 温；（b)DAST，DCM，-40 °C ; (c)NaOMe，湿的MeOH，室温；（d) Pd/C，H2，MeOH，室温；（e) EtOH，催化 的HC1，室温；（f)对于4为乙醛，对于5为苯甲醛，NaCNBH3,丙酮，室温；以及(g)3,5-二甲基吡 唑-1-甲脒硝酸盐，Me0H，60°C。
[0209]可替代地通过下列非限制性例示的方案中所描述的化学方法制备在C4位置具有 胺的式I的化合物。
[0211]或者，可通过下列非限制性例示的方案中所描述的化学方法制备在C4位置具有胍 的式I的化合物。
[0213]或者，可通过下列非限制性例示的方案中所描述的化学方法制备式I化合物。
[0215]或者，可以通过下列非限制性例示的方案中所描述的化学方法制备在Cl位置具有 修饰的式I的化合物。
[0217] 本领域技术人员理解，烃基链长度的变化可通过由1-辛醇(C8-具有8个碳)替换可 替代的醇而实现。例如，在上述方案中的1-辛醇可替换可替代的伯醇，例如其可选自下列中 的一种或多种：丙-1-醇（C3); 丁醇（C4);l-戊醇（C5);l-己醇（C6);l-庚醇（C7);l-壬醇 (C9);l-癸醇(C10);i烷醇(C11);十二烷醇(C12);l-十四烷醇(C14);十六烷醇(C16);十 八烷醇（C18);以及二十烷醇（C20)。类似地，应当理解，可选择该反应的可替代的底物。例 如，可替换化合物12 (DFSA-4GU)或化合物7等，而不是DFSA-4NH2 (化合物4)。
[0218] 此外，可通过下列非限制性例示的方案中所描述的化学方法制备在C1位置具有修 饰的式I化合物。例如，如下所示的乙基5-乙酰氨基-4-脒基_2,3,4,5_四脱氧-3-氟-D-赤 型-β-L-甘露-non-2-ulopyranosylonate氟化物，其还在CUR 1)位置加入乙基。本领域技术 人员理解可通过替换可替代的酸来实现生成的盐的变化，以及可如上所述通过替换可替代 的醇来调整C1位置的烃基的长度。
[0220]或者，可通过在下述非限制性例示的方案中所描述的化学方法制备在环C6位置具 有修饰的式I的化合物。
[0222] 本领域技术人员理解，可通过由原辛酸三甲酯（C8-具有8个碳）或原丁酸三甲酯 (C4-具有4个碳)替换可替代的原酸酯衍生物来实现烃基链长度的变化。例如，可由上述方 案中的原辛酸三甲酯或原丁酸三甲酯替换可替代的原酸酯衍生物，其可例如选自下列中的 一种或多种：原乙酸三甲酯（C2);原丙酸三甲酯（C3);原戊酸三甲酯（C5);原己酸三甲酯 (C6);原庚酸三甲酯(C7);原壬酸三甲酯（C9);原癸酸三甲酯(C10)。类似地，应当理解可选 择该反应的可替代的底物。
[0223] 表征
[0224] (2R，3R) -4-叠氮-4-脱氧-3-氟-7，8，9-三-0-乙酰基-唾液酸甲酯（1)
[0225] ESI-MS m/z 515. l(+Na);19F-NMR(CFCl3,282MHz)S-204.7(dd，J 47.9和31·0Ηζ) NMR(300MHz)S5.32(lH，m);5.14(lH，m);5.00(lH，dd，J 31.4和1.5Hz)，4.86(lH，dd，J 4.5和1.9Hz)，4.25(lH，m)，4.15(lH，m)，4.04(lH，dd，J 12.5和8.5Hz)，3.83(lH，m),3.77 (3H，0Me)，2.02(12H，4s，4Ac)。
[0226] (2R，3R) -4-叠氮-2，4-二脱氧-2，3-二氟-7，8，9-三-0-乙酰基-唾液酸甲酯(2)
[0227] ESI-MS m/z = 517.0(+Na) ;19F-MMR(CFCl3,282MHz)S-123.2(lF，t，8.46Hz)，- 5.10(lH，dd，J 49.4和7·3Ηζ),4.65(lH，dt,28.1和9.4Hz),4.51(lH，m)，4.27(2H，m),3.88 (3H,d,J7.0Hz,0Me),3.39(lH,m),2.10(12H,m,4Ac)〇13C NMR(100ΜΗζ)δ21.6,21.7,21.8, 24.5,49.1,54.7,57.8(dd),62.7,68.5,69.6,71.6(d),78.2,87.5(dd),105.5(dd),165.0 (dd),170.6,171.4,172.2,172.5。
[0228] (2R, 3R) -4-叠氮-2,4-二脱氧-2,3-二氟唾液酸(8)
[0229] ESI-MS m/z = 353.2(-H) ;F-MMR(CFCl3,282MHz)S-122.3(lF，d，J11.3Hz)，-216.4(lF，ddd，J 50.1,29.2和11.3Hz);咕-匪R(300MHz)S5.30(lH，dm，J 50.2Hz),4.34 (lH，t，J 10.8Hz)，4.07(lH，dd，J 29.1和11.2Hz)，3.90(lH，d，J 10.5Hz)，3.74(2H，m)， 3.50(3H,m),1.95(3H,s,Ac)〇13C NMR(100ΜΗζ)δ23.0,45.9(d),61,5(dd),63.9,68.7,71.1, 74.1(d),88.0(dd),106.5(dd),169.2(dd),175.8〇
[0230] (2R, 3R) -4-氨基-2,4-二脱氧-2,3-二氟唾液酰胺(9)
[0231] ESI-MSm/z = 350.1(+Na);19F-NMR(CFCl3,282MHz)S-121.1(lF，d，J8.46Hz)，-219.4(lF,m)； 1H-NMR(300MHz)55.10(lH,dm,J49.3Hz),4.20(lH,t,J 10.8Hz),3.96(lH,d J 10.6Hz)，3.73(2H，m)，3.50(3H，m)，1.95(3H，d，J 1.2Hz，Ac)</3C ΜΚ(100ΜΗζ)δ22·2， 46.1，51·5(dd),63.2,67.5,70.l，74.1，87.0(dd)105.0(dd)，168.2(dd)，175.2。
[0232] (2R，3R) -4-( N-乙酰基)氨基-2，4-二脱氧-2，3-二氟唾液酸（11)
[0233] ESI-MS m/z = 415. l(+2Na) ；19F-NMR(CFC13,282MHz)5-121.8(lF,d,J 11.9Hz),-214.4( IF,m) ； 1H-NMR(300MHz)55.05(1H,d,J50.5Hz),4.50(lH,m),4.18(lH,m),4.05(lH,d J 10.4Hz),3.82(lH,d,J 10.3Hz),3.75(2H m),3.48(2H,m),1.89(3H,s,Ac),1.84(3H,s, 八。）。13<：匪1?(1001泡）321.6,21.8((1)，45.2,50.8(111)，63.1，68.0,70.5,70.6,73.3((1)， 73.5,169.5(dd),174.2,174.8〇
[0234] (2R, 3R) -4-( N-乙基)氨基-2,4-二脱氧-2,3-二氟唾液酸(7)
[0235] ESI-MS m/z = 355.3(-H);19F-MMR(CFCl3,282MHz)S-121.8(lF，d，J11.5Hz)，-216.4(lF,m)； 1H-NMR(300MHz)55.30(lH,dm,J 50.2Hz),4.29(lH,t,J 10.7Hz),3.82(lH,d J 10.6Hz),3.73(2H,m),3.52(3H,m),3.00(2H,m),1.95(3H,s,Ac),1.10(3H,t,J 7.3Hz)〇 13C NMR(100MHz)Sl2.4,23.2,41.3,45.2,58.0(dd)，63.9,64.2(d)，68.7,71.2,74.2(d), 85.5(dd)，107.2(dd)，170.0(dd)，176.1。
[0236] (2R，3R) -4-氨基-2，4-二脱氧-2，3-二氟唾液酸(4)
[0237] ESI-MSm/z = 351.2(+Na);19F-NMR(CFCl3,282MHz)S-122.0(lF，d，J11.3Hz)，- m)，3.45(3H，m)，1.91(3H，dd，J 5.1和υΗζ,Α。）。1% NMR(100MHz)S23.1,46.8,53. l(dd)， 63.9,64.l，68.5,71.4,74.4,89.8(dd)，108.5(dd)，170.4(dd)，176.0。
[0238] (2R，3R) -4-氨基-2，4-二脱氧-2，3-二氟唾液酸乙酯（5)
[0239] ESI-MS m/z = 379.1(+Na) ;19F-匪R(CFCl3,282MHz)S-122.3(lF，d，J 5·6Ηζ)，- m)，4.05(lH，d J 10·4Ηζ)，3·88(3Η m)，3.66(3H，m)，2.10(3H，d，J 1.6Hz，NAc)，1.30(3H， dt，J70.4和7.2Hz)</3C NMR(100MHz)Sl3.4，17.1，22.4,44.6(dd)，52.4(dd),57.7,63.2, 65.0,67.7(d)，70.1(d)，73.3(d)，86.7(dm)，105.1(tm)，167.0(dm)，175.4(d)。
[0240] (2R，3R) -4-脒基-2，4-二脱氧-2，3-二氟唾液酸（12)
[0241] ESI-MS m/z = 370.3(-H);19F-MMR(CFCl3,282MHz)S-121.3(lF，d，J14.4Hz)，-SHJaF.nOjH-NMRUOOMHzMS.OOaH.dmJ 50.2Hz)，4· 19(lH，t，J 8·9Ηζ)，3·81(2Η， m)，3.52(3H，m)，3· 10(lH，q，J 7.3Hz)，1.90(3H，s，Ac)，1· 12(纽，111)。13(：匪R(100MHz)S 22.3,43.5,46.5,55.1,63.9,68.9,71.5,74.2,89.5(dd),107.0(dd),161.5,170.l(dd), 175.8〇
[0242] (2R，3R) -4-脒基-2，4-二脱氧-2，3-二氟唾液酸乙酯（13)
[0243] ESI-MSm/z = 421.4(+Na);19F-NMR(CFCl3,282MHz)S-122.5(lF，d，J12.0Hz)，-216.0(lF,m)； 1H-NMR(300MHz)55.16(lH,dm,J49.5Hz),4.32(2H,m),4.18(2H,m),4.03(lH, d,J 9Hz),3.70(2H,m),3.50(3H,m),3.09(2H,q,J 7.1Hz),1.90(3H,s,Ac),1.23(3H,t,J 6.2Hz)〇
[0245] 辛基5-乙酰氨基-4-氨基-2,3,4,5 ,-四脱氧-3-氟-D-赤型-β-L-甘露-non-2-ulopyranosylonate氟化物的盐酉爱盐
[0246] ESI-MS m/z = 463.3(M+Na) ^H-NMRHOOMHz.OfeODMS.STdH.app dt，J 49.92， 5.04)，4.50-4.44(lH，m),4.38-4.27(2H，m),4.21-4.ll(2H，m),3.80-3.77(lH，m),3.75 (lH,dd,J 6.91,2.30),3.69-3.66(lH,m),3.60-3.55(lH,m),2.04(3H,s),1.80-1.73(2H, m),1.42-1.28(10，m)，0.91(3H，t，J 7.00)。
[0248] 乙基5-乙酰氨基-7，8，9-三-0-乙酰基-4-氨基-2，3，4，5-四脱氧-3-氟-D-赤型-β-L-甘露-non-2-ulopyranosylonate氟化物的盐酉爱盐
[0249] ESI-MS m/z = 483.3(M+H) jH-NMRHOOMHz.CDChWe.ggaH.s)，5·70-5·23(3Η， m),5.02(lH,s),4.61-4.08(6H,m),2.28-1.23(15H,m)〇
[0251] 乙基5-乙酰氨基-4-氨基-2,3,4,5 ,-四脱氧-3-氟-D-赤型-β-L-甘露-11〇11-2-ulopyranosylonate 氣化物
[0252] ESI-MS m/z = 379.1(M+Na) ；1H-NMR(400MHz,D20)55.18(lH,app dj 49.34),4.38 (2H,q,J 7.16),4.20-4.14(lH,m),4.01(lH,dJ10.51),3.87-3.76(2H,m),3.61(lH,dd,J 11.95,5.86),3.55(lH,d,J9.29),3.39(lH,dd,J 30.00,10.96),2.03(3H,s),1.32(3H,t,J 7.16)〇
[0254] 5-乙酰氨基-4-氨基-9-丁酰基-2,3,4,5,-四脱氧-3-氟-D-赤型-β-L-甘露-non-2-ulopyranosylonate氟化物的盐酉爱盐
[0255] ESI-MS m/z = 421.3(M+Na);1H-NMR(400MHz，Me0D)S5.34(lH，app d，J 51.62)， 4.47(lH,app t,J 10.66),4.36(lH,d,J 10.20),4.16(1H,dd,J 11.42,6.24),4.09-3.97 (3H，m)，3.55(lH，d，J 9.14)，2.34(2H，t，J 7.31)，2.03(3H，s),1.70-1.61(2H，m),0.96 (3H，t，J 7.31)。
[0257] 5-乙酰氨基-4-氨基-9-辛酰基-2，3，4，5，-四脱氧-3-氟-D-赤型-β-L-甘露-non-2-ulopyranosylonate氟化物的盐酉爱盐
[0258] ESI-MS = 匪R(400MHz，Me0D)S5.35(lH，app d，J 45.84)， 4·58-4.28(2H，m)，4·23-3.88(4H，m),3.63-3.50(lH，m),2.48-2.26(2H，m)，2.15-1·94(3Η， m),l.72-1.54(2H,m),l.51-1.14(8H,m),l.03-0.88(3H,m)〇
[0260] 乙基5-乙酰氨基-4-脒基-2,3,4,5 ,-四脱氧-3-氟-D-赤型-I3-L-甘露-non-2-ulopyranosylonate氟化物的盐酉爱盐
[0261] ESI-MS = 匪R(300MHz,D20)S5.16(lH，app d，J 49.5Hz), 4.32(2H,m),4.18(2H,m),4.03(lH,d,J 9Hz),3.70(2H,m),3.50(3H,m),3.09(2H,q,J 7.1Hz)，1.90(3H，s)，1.23(3H，t，J6.2Hz)。
[0262] 酶动力学
[0263] 所有实验在包含0.1 %的BSA的pH值为7.6的20mM的Tris/50mM的CaCl2缓冲液中进 行。比色皿具有lcm的路径长度并在与循环水浴连接的Cary 4000或Cary 300 UV/可见光分 光光度计中使用。使用程序GraFit 4.0(Erithacus软件)分析数据。在几种浓度的灭活剂的 存在下，通过在30°C下预孵化酶进行时间依赖性失活。通过向包含0.5mM 4-三氟甲基伞形 酮唾液酸(CF3MUSA)的检验溶液加入等分的失活混合物以合适的时间间隔来测定残留的酶 活性。通过检测在385nm下吸光度的初始线性增加来测定动力学参数。将在各个时点下的初 始速率绘图为时间的函数以获得时间依赖性指数衰减曲线，使用下列方程式从所述时间依 赖性指数衰减曲线获得各个失活浓度的ki obs :
[0264] (速率)t=(速率)t=〇e(ki °bs *)+偏移量。
[0265] 使用偏移量，因为速率不衰减为零。通过将1^ -与灭活剂浓度绘图为下列方程式 来确定失活速率常数(k〇和灭活剂的可逆分离常数(Kd):
[0266] ki obs = ki[I]/(Kd+[I])〇
[0267] 在[I]〈〈Kd的情况下，通过将数据拟合为下列方程式来确定二级速率常数(lu/Kd):
[0268] ki 〇bs = ki[I]/Kd〇
[0269] 通过将失活的酶溶液（50μ1)应用于Amicon? 10K过滤器(Millipore?)以去除过 量的灭活剂来进行时间依赖性的再活化。在4 °C下，使用150yL的缓冲液将过滤器洗涤5次。 通过向包含0.5mM CF3MUSA的检验溶液加入等分的洗提酶以时间间隔来检验酶活性。通过 将活性与时间数据直接拟合成一级方程式来确定各个受体浓度下的再活化的一级速率常 数(krclbs)。尝试进行再活化实验，但随时间推移没有检测出显著的酶活性，这表明唾液酸酶 中间体的水解非常缓慢。通过将数据拟合成下列方程式来确定K 1:
[0270] Ki = Kd(khyd/ki) 〇
[0271] 流感抗病毒活性的细胞检验
[0272] 使用细胞检验来测试化合物的抗病毒活性，其由连续2倍稀释的抗病毒化合物组 成（在用于大量测试病毒足够体积-每个病毒60yL的MegaVir培养基中从1: 2稀释至1: 4096 )，向其加入特异性流感病毒的100个传染单位，并将制剂转移至微滴定板中的单层 MDCK细胞。在96孔微滴定板上进行检验。监测所述板在感染后3至5天的流感细胞病变效应 的发展。通过抑制细胞病变效应的发展测定抗病毒活性。将单层未受损时的化合物的最高 稀释视为终点。将扎那米韦用作阳性对照。
[0273] 稀释液制备：
[0274] 1.在干净的96孔微滴定板上的A行中，制备用于大量测试病毒足够体积(每个病毒 60yL)的MegaVir培养基中从1:2稀释至1:4096的2-倍连续稀释的抗病毒化合物。
[0275] 2.将55yL的2-倍稀释系列转移至96孔微滴定板中干净的行。
[0276] 3.向55yL的稀释系列加入55yL的稀释的流感病毒(每25yL的IOOTCIDm下）。还向阳 性对照孔加入病毒。
[0277] 4.向现在的110yL混合物加入55yL的4X TPCK-治疗的胰蛋白酶。还向阳性对照和 阴性对照孔加入胰蛋白酶。混合孔。
[0278] 5.在MegaVir培养基中还针对接种病毒制备从1:2稀释至1:256的2-倍连续稀释液 用于反滴定。
[0279]板接种：
[0280] 6.在包含位于约200yL的MegaVir培养基中的融合单层的MDCK细胞的96孔微滴定 板中，将75yL的混合物转移至2个分别的行作为重复。
[0281] 7.将50yL的阳性对照和25yL的阴性对照转移至各个孔。
[0282] 8.还将25yL的病毒反滴定液转移至重复中。
[0283] 9.因此在各个孔中：
[0284] a.样品：25yL化合物+25yL病毒+25yL胰蛋白酶
[0285] b.阳性对照:25yL病毒+25yL胰蛋白酶(没有化合物）
[0286] c.阴性对照:25yL胰蛋白酶(没有化合物或病毒）
[0287] d.反滴定液：25yL病毒
[0288] 10.在⑶2恒温器中，在37 °C下，将板孵化3天，然后在第3天和第5天观察细胞病变 效应的出现。
[0289]体内药代动力学(PK)特性研究 [0290]剂量给药
[0291] 静脉内（IV)注射-使用28G针，将小鼠注射所需的体积以基于各个小鼠的体重而向 动物给予规定的剂量(mg/kg)。注射体积为200yL/20g小鼠。在IV注射期间使小鼠短暂受限 制约1分钟。通过将动物在加热灯下保持1-2分钟实现静脉扩张。
[0292] 鼻内（IN)给药-使用2%的异氟烷和2L/02/min麻醉小鼠直至缺少脚趾捏反射。将 动物限制在垂直位置并使用微量移液管向动物的各个鼻孔逐渐灌输10yL化合物每15g体 重。在灌输过程期间使小鼠短暂受限制约20秒，并调节释放速率以使小鼠吸入化合物而不 形成气泡。将小鼠以倒立姿势放回麻醉室时间为另外2分钟或直至呼吸恢复正常。
[0293]药代动力学取样
[0294] 将小鼠单独称重并根据体重平均分组。将小鼠 （n = 20/组和n = 4/时间点）注射在 剂量给药部分所描述的测试物品。
[0295] 血液采集:在研究分组表中所示的时间点下采集血液。对于血液库，通过⑶2吸入 来终结小鼠并通过心脏穿刺采集血液。在最后呼吸时，从吸入室移除小鼠并使用25G针通过 心脏穿刺采集约500yL至700yL的血液并放置在合适的EDTA微量采集管中。将各个管倒置数 次以保证血液和Η)ΤΑ均匀混合从而避免凝固。将血液样品在冰上储存直至采集特定时间点 的所有样品，然后进一步处理以生成血浆。
[0296] 血衆制备：在4°C下，通过在2500rpm下将样品离心15分钟制备血衆（rpm基于 Beckman GH 3.8A转子，RCFavg 250xg)，然后用吸液管吸出并放在冰上带标签的小瓶中，然 后在-80 °C下冷冻。在干冰上运输样品。
[0297] 组织采集:在血液采集之后，获得气管和肺组织。简言之，切开颈部的腹侧以暴露 甲状腺和胸骨甲状肌。将肌肉轻轻地梳理开以暴露喉部和气管，使用止血钳A以闭合气管 (邻近喉部），然后将气管恰好在喉部和整个气管的后部切开，去除支气管树以及所连接的 肺。从肺中分离气管。组织未在盐水中洗涤。将各个组织样品转移至冰上各个带标签的小瓶 中，然后在80 °C下冷冻。在干冰上运输样品。
[0298] 动物的观察
[0299] 在测试化合物给药后的前两小时内连续监测小鼠的毒性急性症状。对于处于最后 时间点（7天）的小鼠组，在致死和组织采集之前每天2X次监测小鼠。在研究过程中，每周一、 周三和周五检测各个小鼠的体重。
[0300]数据采集
[0301]如在实验设计:药代动力学取样中描述的血液采集的实际时间（时间为天）、体重 和行为参数。
[0302]采集下列记录：
[0303] ?根据体重手动随机选择
[0304] ?个体体重 [0305] ?观察结果 [0306] ?评论
[0307] ?血液和组织采集的实际时间
[0308] ?组织样本的特性
[0309] ?与动物的任何早期终止有关的原因/调查结果
[0310] 动物观察结果
[0311] 药物诱导的应激评价-在预治疗和治疗期间，每天至少一次，若认为需要每天多次 观察给药后所有动物的死亡率和发病率。特别地，不健康的症状基于体重减轻、食欲变化和 诸如改变步态、嗜睡和应激的总表现的行为变化。当观察到重度毒性症状时，将动物致死 (C0 2室息)并进行剖检以评价毒性的其它症状。检查下列器官:肝脏、胆囊、脾、肺、肾、心脏、 肠、淋巴结和膀胱。还观察任何其它异常发现。
[0312]出于人道原因将垂死的动物致死，并且致死决定由动物护理技师和研究主管判 断。将这些发现记录为原始数据，并在第二天记录死亡时间。
[0313]流感的体内小鼠模型 [0314] 动物
[0315]将流感小鼠模型用于本研究。6至7周大的雌性小鼠（Balb/C-小家鼠），以每个小鼠 1250pf u给予小鼠适应性HK1流感病毒。挑战剂量为在体内滴定研究中确定的3 X LD50。在水 平2容器中饲养动物。
[0316]研究中的活性顺序
[0318]鼻内剂量给药
[0319]使用2%的异氟烷和2 L/02/min麻醉小鼠直至缺少脚趾捏反应。将动物限制在垂 直位置并使用微量移液管向动物的各个鼻孔逐渐灌输l〇yL化合物。在灌输过程期间使小鼠 短暂受限制约20秒，并调节释放速率以使小鼠吸入化合物而不形成气泡。将小鼠以倒立姿 势放回麻醉室时间为另外2分钟或直至呼吸恢复正常。
[0320]鼻内病毒接种
[0321 ]使用2%的异氟烷和2 L/02/min麻醉小鼠直至缺少脚趾捏反应。将动物限制在垂 直位置并使用微量移液管向动物的各个鼻孔逐渐灌输l〇yL的包含3000pfu流感A病毒，A/ HK/1/68(H3N2)的病毒制剂(全部接种体为1250pfu每只动物）。在无血清DMEM中以悬浮液形 式制备病毒。在灌输过程期间使小鼠短暂受限制约20秒，并调节释放速率以使小鼠吸入化 合物而不形成气泡。将小鼠以倒立姿势放回麻醉室时间为另外2分钟或直至呼吸恢复正常。 [0322]数据采集 [0323]采集下列记录：
[0324] ?根据体重手动随机取样
[0325] ?个体体重
[0326] ?观察结果
[0327] ?评论
[0328] ?与动物的任何早期终止有关的原因/发现结果 [0329]药物或疾病诱导的应激评价
[0330]在治疗期间每天两次且此后每天一次观察给药后所有动物的死亡率和发病率。不 健康的症状包括体重减轻、食欲变化、呼吸困难和诸如改变步态/姿态、嗜睡和应激的总表 现的行为变化。在重度疾病症状（由> 15 %的体重减轻确定)时，称为动物的终点并将动物致 死(C〇2室息）。
[0331]出于人道原因将垂死的动物致死，并且致死决定由动物护理技师和研究主管判 断。将这些发现记录为原始数据，并在第二天记录死亡时间。 实施例
[0332] 参照下列非限制性实施例描述其它实施方案。
[0333] 实施例1:病毒唾液酸酶检验
[0334] 如机制性抑制剂所预期的，并且如图3A和B的化合物4所示的，用不同浓度的各个 化合物孵化的流感唾液酸酶导致了酶活性的时间依赖性降低。图3A和3B显示化合物4导致 的流感唾液酸酶（亚型N9)的时间依赖性失活。用指示浓度的化合物4孵化酶，并用0.5mM CF3MUSA检验等分。由指示浓度(3A)下的化合物4导致失活，并重新绘制拟一级失活动力学 常数(ki obs)与化合物4浓度(3B)的图谱。
[0335] 除化合物8之外，在30°C下，所有3-氟唾液酸氟化物表现出对流感唾液酸酶的优异 失活特性，并对于所有胺衍生物(化合物4、7、9、11和12)将唾液酸酶的完全失活的半衰期估 算为约lOmin(在表4中概括）。有趣地是，4-氨化的化合物4和4-脒化的化合物12表现出良好 的失活值(对于化合物4，ki/Kd = 25min-VM-1，并且对于化合物12，ki/Kd = 24min-VM-1)。此 外，在测定化合物4的失活唾液酸酶完全再活化的半衰期为4.8h并测定化合物12的失活唾 液酸酶完全再活化的半衰期为6.7h时，化合物4和12在相同温度下在缓冲溶液中表现出缓 慢的再活化。因此，3-氟唾液酸酶中间体非常稳定地阻滞流感唾液酸酶的活性位，并且其有 效的K iS在纳摩尔范围内（对于化合物4为93nM，并且对于化合物12为70nM)。
[0336] 由于唾液酸酶中间体的快速水解，因此在3 0 °C下不能检测2，3 -二氟唾液酸 (23DFSA)和4-叠氮化合物8的失活参数。因此，在4°C下检测这两种抑制剂的动力学值，并给 出估算的失活数值。在4°C下测定化合物23DFSA的ki/Kd值为Νθπ?ηΛιΤ 1，并且4-叠氮化合 物8和4-胺化合物4表现出低26倍的动力学值(对于化合物8为ki/KdiTAmirTViT 1，并且对 于化合物4为7.βπ?ηΛιΤ1)。尽管4-胺衍生物表现出较低的失活动力学值，但显示这些化合 物由于其非常缓慢的再活化而成为比4-羟基化衍生物(23DFSA)更好的抑制剂。
[0337]表4:流感唾液酸酶与3-氟唾液酸氟化物的反应的动力学参数。a
[0340] 3所有实验均在3(TC下的包含0.1%BSA的pH为7.6的20mM TRIS/50mM CaCl2缓冲液 中进行^在代下采集动力学值。ND =未测定的。
[0341 ]实施例2:人唾液酸酶检验
[0342] 将含有人唾液酸酶的不同浓度的各个化合物孵化导致即使在非常高的化学物浓 度(1 OmM)下人唾液酸酶仍没有失活，这表明化合物对流感唾液酸酶的特异性。
[0343] 实施例3:使用流感A菌株的细胞保护检验
[0344] 对比扎那米韦和/或2,3-DFSA测试候选抑制剂(化合物4、5、7-9和11-13)对两种流 感A菌株的细胞病变效应(CPE)。重要的是注意，尽管本细胞保护检验是抗病毒活性的良好 定性指示剂，但结果常是变化的（如通过其它所指出的，Tisdale M. (2000))并在进行定量 分析时小心操作。
[0345] 表 5 化合物对流感 A/Brisbane/10/2007(H3N2)的活性
[0346]
[0347] 表 6 化合物对流感 A/Denver/1/57(H1N1W^&_
[0350]表7化合物4和12对多种流感A病毒和耐奥司他韦菌株(OsR)的活性
[0352] 在一些菌株上在不同天进行多次实验
[0353] A:单一的检测;B:二次检测的平均值;e:六次检测的平均值
[0354]表7显示融合单层的MDCK细胞免受细胞病变病毒感染5天时间内的抗病毒的浓度 (μΜ)〇
[0355] 实施例4:使用流感Β菌株的细胞保护检验
[0356] 对比扎那米韦测试候选抑制剂对两种流感Β菌株的细胞病变效应(CPE)。重要的是 注意，尽管本细胞保护检验是抗病毒活性的良好定性指示剂，但结果常是变化的（如通过其 它所指出的，Tisdale Μ. (2000))并在进行定量分析时小心操作。
[0357] 表8化合物对流感B/HongKong/5/72的活性
[0359] 表9化合物对流感B/Florida/04/06的活性
[0360]
[0361] 实施例5:体内药代动力学(PK)特性研究
[0362] 研究的目的是评价与扎那米韦相比的通过鼻内途径的新型氟唾液酸化合物 (DFSA-4GU)的药代动力学特性，并且比较当在Balb/C小鼠（小家鼠）中通过鼻内和静脉内途 径给药时的DFSA-4GU的药代动力学特性。
[0363] 表10研究参数
[0364]
[0365] 进行PK研究以评价通过IN和IV途径给药的小鼠的DFSA-4Gu，并评价通过IN途径给 予的扎那米韦，所有均处于lmg/kg的单一剂量。获得DFSA-4GU的组织水平和血浆水平，并获 得扎那米韦的肺组织水平。通过两种途径，水平随着所有组织中的明显的一级动力学下降。 通过IN途径进行的DFSA-4GU和扎那米韦的比较显示使用两种试剂观察到肺中可比较的化 合物暴露。
[0366] 计算的PK参数
[0367] 在使用单一的lmg/kg剂量鼻内给药后，计算DFSA-4GU和扎那米韦的PK参数。
[0368] 表11A计算的PK值
[0370]在使用单一的lmg/kg剂量静脉内给药后，计算DFSA-4GU的PK参数。
[0371] 表11B计算的PK值
[0372]
[0373] 在鼻内给药后化合物的表观半衰期比静脉内给药后的表观半衰期长。同样地，与 静脉内给药相比，DFSA-4GU的表达为AUC的所述暴露通过鼻内给药在气管和肺中增加，肺的 AUC 比（IN/IV) = 9 · 3，气管的 AUC 比（IN/IV) = 17 · 0。
[0374] 在鼻内给予扎那米韦和DFSA-4GU后肺部的AUC相似，AUC(肺）（扎那米韦/DFSA-4Gu) = 1.07。在鼻内给药后，两种试剂在肺部的表观半衰期也相似。
[0375] 实施例6:流感感染的体内鼠模型
[0376] 在流感(HK1)的小鼠模型中测试扎那米韦、DFSA-4GU和DFSA-4NH2的体内功效。将 化合物与扎那米韦相比，由此动物在感染前接受单一的鼻内剂量的药物，并在总共六天内 每天两次接受后续剂量。将由感染导致的死亡率设定在15%体重减轻，此后将动物致死。与 未治疗的对照组相比，在接受lmg/Kg剂量的DFSA-4⑶和扎那米韦的组中动物的存活显著延 长。类似地，与未治疗的对照组相比，使用DFSA-4NH2治疗一定程度上延长了存活。然而，药 物治疗没有阻止死亡，因为所有治疗的动物最后均达到由流感导致的终点。尽管这些结果 是有希望的，但是不同病毒菌株或增加剂量的药物的使用可改变存活。
[0377] 表12实验组和治疗
[0378]
[0379] t对于各个健康对照组(表6中的第6组和第7组)的原方案要求N=3。在研究的执行 中，在这些组中使用N=5,增加总动物数至60。
[0380] 表13在感染后的第3、4、5、6、7和8日，动物的存活率。表13显示各个组中剩余的动 物数。除了第6组和第7组(n = 5)外所有组N=10。
[0381]
[0382]
[0383] 表14在感染后的第4日（上午)每组的平均％体重减轻。选择该时间点，因为许多动 物接近于达到终点，但大多数组仍具有10只动物。
[0384]
[0385] 1通过学生的T试验确定P-值，其中将各个组与未治疗的第7组的平均值单独比较。 将低于0.05的P-值视为统计学显著的。
[0386] 对于上述结果和方案的可能改变，可调整不同病毒菌株、不同终点或增加的药物 剂量的使用。例如，适应诸如A/PR/8/34的病毒菌株的另一小鼠可能产生不同的结果。而且， 15%的体重减轻的终点可能太低，由此动物在减轻20%或更多后仍可恢复。例如，Bantia等 人(2001)报道了扎那米韦治疗的动物在大于20%体重减轻后的恢复。类似地，可能需要较 高剂量的药物以实现完全保护。例如，Levena等人(2001)，在他们观察到保护作用之前，作 者要求扎那米韦的剂量在l〇mg/kg/day和50mg/kg/day。
[0387] 本发明描述的氟化的化合物分类是一系列糖苷酶的抑制剂，并对其靶标酶具有特 异性。这些化合物在其抑制作用方面是机制性的。它们像正常底物一样与酶结合并像天然 底物一样进行第一步的催化（中间体形成），但然后仅非常缓慢地进行第二步(通过水解周 转）。重要地，该机制性抑制应该使病毒的耐药性形成更困难。由于抑制剂是机制性的，因此 任何降低抑制的病毒酶的突变都必然降低酶对天然底物的功效。图2显示通过3-氟唾液酸 氟化物的神经氨酸酶抑制的实例(注意：由于端基异构的羧酸酯，因此唾液酸酸值不同于正 常糖的酸值)。
[0388] 氟唾液酸在两个主要方面与扎那米韦和奥司他韦根本不同。扎那米韦和奥司他韦 是由于其扁平、环状构象而与酶活性位非常紧密相互作用的可逆结合抑制剂。它们的结合 方式可能模仿了水解过程中糖的过渡态构象。因此，它们是过渡态模拟物。相比之下，氟唾 液酸不含双键，由此采取常规的椅型构象。它们与酶反应好像它们是底物并与活性位亲核 试剂形成共价键，并且仅非常缓慢地水解成产物。它们从形成的中间体的长寿命性质获得 它们非常高的功效。
[0389]由于该完全不同的作用方式，结合胺或胍取代基增加其功效是不明显的，因为在 两种情况下糖环具有非常不同的构象:在两种情况下，胺/胍以非常不同的方式存在，因此 可能非常不同地相互作用。甚至更重要地，氟唾液酸的主要功效源自相对长寿命的共价中 间体的形成。根本不明显的是结合4-胺/胍代替4-羟基减慢该中间体的水解(去糖基化)比 其减慢所述中间体的形成(糖基化)更多，因此中间体的寿命越长，抑制剂的功效越高。 [0390]尽管本文公开了本发明的各种实施方案，但根据本领域技术人员的公知常识在本 发明的范围内可进行许多改变和修改。这样的修改包括对本发明任何方面的已知等效物的 替代从而以基本相同的方式实现相同的结果。数值范围包括确定范围的数字。本文所用的 词语"包括(comprising)"是开发式术语，基本等同于短语"包括，但不限于"，并且词语"包 括(comprises)"具有相应的含义。除非上下文另外明确规定，如本文使用的单数形式"a( - 个)"、"an(-个)"和"the(所述)"包括复数参照物。因此，例如，提及"一个事物"包括多于一 个这样的事物。本文参考文献的引用并非承认这样的参考文献是本发明的现有技术。
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【主权项】
1.通式I的化合物：其中 T为C (0) NH2、COOH 或COOR1， 其中#为(^2()直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基， 其中所述任选的取代基选自氧基、〇!^、(：1、8^1、順2、^3!1、303!1和^) 2中的一种或多 种，并且 其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳任选且独立地被〇、N或S取代； Z 为F、Cl、Br 或 0S02R2， 其中1?2为(^2()直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基， 其中所述任选的取代基选自氧基、〇!^、(：1、8^1、順2、^3!1、303!1和^) 2中的一种或多 种，并且 其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳任选且独立地被〇、N或S取代； A选自 Η、F、C1、Br、OH、CN、OR3、N〇2、S02R3、SR 3 和 COR3， 其中妒为(^2()直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基， 其中所述任选的取代基选自氧基、〇!^、(：1、8^1、順2、^3!1、303!1和^) 2中的一种或多 种，并且 其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳任选且独立地被〇、N或S取代； D选自 Η、F、C1、Br、OH、CN、OR4、N〇2、S02R4、SR 4和C0R4，条件是A和D不都是Η，以及 其中妒为(^2()直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基， 其中所述任选的取代基选自氧基、〇!^、(：1、8^1、順2、^3!1、303!1和^) 2中的一种或多 种，并且 其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳任选且独立地被〇、Ν或S取代； Α和D任选地共同形成氧基； X选自順2、NHR5、NHC (NH) NH2、NHC (NH) NHR5、NR5R6、NHC (NR6) NR5 和 NHC (NH) N (R5) R6， 其中R5和R6独立地为C6H5、烃基； E选自 NH2、NHC (0) CH3、OR7、NHR7 和N (R7) (R8)， 其中R7和R8独立地为&-2〇直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基， 其中所述任选的取代基选自氧基、〇!^、(：1、8^1、順2、^3!1、303!1和^) 2中的一种或多 种，并且 其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳任选且独立地被〇、N或S取代； Q选自 CH2OH、CH2R9、CH(R9) (R1Q)、C(R9) (R1Q) (R11)、 其中R9、R1Q和R11独立地为CH3或CH2CH3,以及 各个 J 和 G独立地选自 Η、OH、OAc、0C (0) CH3、F、Cl、Br、N〇2、CN、OR12、SO2R12、COR 12 和 SR12， 其中R12为CH3、CH2CH3或CH2CH2CH3,以及 M为H、0H、0Ac、0C(0)CH3、NH2、FSC1，&& L为H、0H、0Ac、0C(0)R13SNH2， 其中妒3为&-2〇直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基， 其中所述任选的取代基选自氧基、〇!^、(：1、8^1、順2、^3!1、303!1和^)2中的一种或多 种，并且 其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳任选且独立地被〇、N或S取代。2.通式I的化合物：其中 T为C (0) NH2、C00H 或C00R1， 其中妒为&-2()直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基， 其中所述任选的取代基选自氧基、〇!^、(：1、8^1、順2、^3!1、303!1和^)2中的一种或多 种，以及 其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳任选且独立地被〇、N或S取代； Z为F或C1; A为F或C1; D为H; X选自順2、NHCH3、NHCH2CH3 JHCH2CH2CH3、NHCH2CH2CH2CH3 和 NHC(NH)NH2; E 为順2 或 NHC(0)CH3; Q选自：其中 各个J 和 G独立地选自 H、0H、0Ac、0C(0)CH3、F、Cl、Br、N02、CN， Μ为 H、OH、OAc;W& L为H、OH、OAc。3. 如权利要求1所述的化合物，其中T为COOH或COOR1， 其中#为(^2()直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基， 其中所述任选的取代基选自氧基、〇!^、(：1、8^1、順2、^3!1、303!1和^) 2中的一种或多 种。4. 如权利要求1或3所述的化合物，其中T为C(0)0CH3、C(0)0CH2CH3、C(0)0CH 2CH2CH3、C (0)0CH2CH2CH2CH3、C(0)0CH2CH2CH2CH2CH3、C(0)0CH2CH2CH2CH2CH 2CH3、c(o) OCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3、C (0) OCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH^^5. 如权利要求1、3至4中任一权利要求所述的化合物，其中A选自F、Cl、Br、OH、CN和N〇2。6. 如权利要求1、3至5中任一权利要求所述的化合物，其中A选自F、C1和OR3， 其中妒为(^2()直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基， 其中所述任选的取代基选自氧基、〇!^、(：1、8^1、順2、^3!1、303!1和^) 2中的一种或多 种。7. 如权利要求1、3至6中任一权利要求所述的化合物，其中A为F或C1。8. 如权利要求1至7中任一权利要求所述的化合物，其中A为F。9. 如权利要求1、3至8中任一权利要求所述的化合物，其中D选自H、F、Cl、Br、OH、Cr^P NO2,条件是A和D不都是Η。10. 如权利要求1、3至9中任一权利要求所述的化合物，其中D选自H、F和Cl，条件是Α和D 不都是H。11. 如权利要求1、3至10中任一权利要求所述的化合物，其中D为F或C1。12. 如权利要求1、3至11中任一权利要求所述的化合物，其中D为H，条件是A和D不都是 H〇13. 如权利要求1、3至12中任一权利要求所述的化合物，其中X选自NH2、NHR5、NHCH 3、 NHCH2CH3、NHC (NH) NH2、NHC (NH) NHR5、NHC (NR6) NR5 和 NR5R6，其中 R5 和 R6 独立地为 C6H5、CH2C6H5 或&-8烃基。14. 如权利要求1、3至13中任一权利要求所述的化合物，其中X选自NH2、NHCH3、NHCH 2CH3 和nhc(nh)nh2〇15. 如权利要求1、3至14中任一权利要求所述的化合物，其中X为NH2或NHC (NH) NH2。16. 如权利要求1、3至15中任一权利要求所述的化合物，其中E选自NH2、NHC (0) CH3、OR7、 NHR7, 其中R7独立地为Cho直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基， 其中所述任选的取代基选自氧基、〇!^、(：1、8^1、順2、^3!1、303!1和^) 2中的一种或多 种，以及 其中所述任选取代的烃基的零至十个骨架碳任选且独立地被〇、N或S取代。17. 如权利要求1、3至16中任一权利要求所述的化合物，其中E为NH2或NHC (0) CH3。18. 如权利要求1、3至17中任一权利要求所述的化合物，其中E为NHC (0) CH3。19. 如权利要求1、3至18中任一权利要求所述的化合物，其中Q选自CH2R9、CH(R9) (R1())、C (R9)(R10)(Rn)、其中 R9、R1Q和R11独立地为CH3或CH 2CH3,以及 各个 J 和 G独立地选自 Η、OH、OAc、0C (0) CH3、F、Cl、Br、N〇2、CN、OR12、S02R12、COR 12 和 SR12， 其中R12为CH3、CH2CH3或CH 2CH2CH3,以及 M为H、0H、0Ac、0C(0)CH3、NH2、FSC1，&& L为H、0H、0Ac、0C(0)R13SNH2， 其中妒3为&-2〇直链、支链或环状的饱和或不饱和的任选取代的烃基，以及 其中所述任选的取代基选自氧基、〇!^、(：1、8^1、順2、^3!1、303!1和^) 2中的一种或多 种。20. 如权利要求1、3至19中任一权利要求所述的化合物，其中Q选自： u i各个J 和 G独立地选自 H、0H、0Ac、0C(0)CH3、F、Cl、Br、N02、CN， Μ为H、0H、0Ac、0C(0)CH3、NH2、FSC1，&& L为Η、OH、OAc、OC (0) R13 或 NH2。21. 如权利要求1、3至20中任一权利要求所述的化合物，其中Q选自：各个J和G独立地选自Η、OH、OAc， Μ为Η、OH或OAc，以及 L为H、OH 或 OAc。22. 如权利要求1、3至21中任一权利要求所述的化合物，其中Q为各个J和G独立地选自Η、OH、OAc， M为H、0H或OAc，以及 L为H、OH 或 OAc。 23 ·如权利要求1、3至22中仟一 ^/刺耍龙所彳术的仆合物.I由0为 各个J和G独立地选自0Η、OAc，Μ为OH或OAc，以及 L 为 OH 或 OAc。24. -种或多种权利要求1-23中任一权利要求所述的化合物在用于调节病毒神经氨酸 酶活性的用途。25. 如权利要求24所述的用途，其中所述病毒神经氨酸酶为GH34神经氨酸酶。26. 如权利要求24或25所述的用途，其中所述调节病毒神经氨酸酶活性为用于治疗人 个体中的流感。27. 用于调节病毒神经氨酸酶活性的一种或多种权利要求1-23中任一权利要求所述化 合物。28. 如权利要求27所述的化合物，其中所述病毒神经氨酸酶为GH34神经氨酸酶。29. 如权利要求27或28所述的化合物，其中所述调节病毒神经氨酸酶活性为用于治疗 人个体中的流感。30. 包含权利要求1-23中任一权利要求所述的化合物和药物可接受的赋形剂的药物组 合物。31. 用于调节病毒神经氨酸酶活性的权利要求30所述的药物组合物。32. 如权利要求31所述的药物组合物，其中所述病毒神经氨酸酶为GH34神经氨酸酶。33. 如权利要求31或32所述的药物组合物，其中所述调节病毒神经氨酸酶活性为用于 治疗人个体中的流感。34. 使用一种或多种权利要求1-23中任一权利要求所述的化合物或其药物可接受的盐 调节病毒神经氨酸酶活性的方法。35. 如权利要求34所述的方法，其中所述病毒神经氨酸酶为GH34神经氨酸酶。36. 如权利要求34或35所述的方法，其中所述调节病毒神经氨酸酶活性为用于治疗动 物中的流感。37. 如权利要求36所述的方法，其中所述动物为人。38. 包含一种或多种权利要求1-23中任一权利要求所述的化合物或其药物可接受的盐 的商业包装。39. 制备化合物2的方法：所述方法包括： 在MeN02/H20的存在下，使化合物SAN3:与选择性氟试剂反应至少4天以形成化合物1:化令、物1 在-30 °C至0 °C下，使化合物1与三氟化二乙氨基硫(DAST)、CH2CL2反应。40. 如权利要求39所述的方法，其还包括： 将化合物2与NaOMe和MeOH混合； 然后与Pd/C、H2和MeOH混合； 然后与Li OH、H20和MeOH混合以形成化合物4:v F 化合物4。41. 制备化合物12的方法：所述方法包括： 将化合物2:与NaOMe和MeOH混合； 然后与AcOH混合直至中性； 然后与PMe3、H20和MeOH混合；以及 然后在Et3N、MeOH和DMF中与化合物VII:反应以生成化合物VIII:使化合物VIII与Li0H、H20和THF反应； 然后与Pd/C、H2、H20和THF反应。42.化合物，其选自下列中的一种或多种：
【文档编号】C07D309/14GK105949158SQ201610285580
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2010年7月15日
【发明人】斯蒂芬·威瑟斯, 安德鲁·格雷厄姆·沃茨, 金珍孝, 汤姆·温尼克斯
【申请人】不列颠哥伦比亚大学