从蛤蜊中提取天然牛磺酸的方法

从蛤蜊中提取天然牛磺酸的方法
【专利摘要】本发明涉及从蛤蜊中提取天然牛磺酸的方法，属于化学提取技术领域。本发明从蛤蜊中提取天然牛磺酸的方法包含下列步骤：S1利用蛤蜊制备含牛磺酸的清液；S2将所述清液除蛋白；S3将所述步骤S2的产品进行分离纯化。本发明的有益效果为：原料无毒性，易获取，不存在环境污染的问题。且工艺操作简单，产量大。获得的牛磺酸晶体相对于化学合成法产出的具有更高的生物活性。也在一定程度上促进了蛤蜊的深加工，缓解了鲜食蛤蜊过剩和运输困难的情况。
【专利说明】
从蛤蝴中提取天然牛磺酸的方法
技术领域
[0001] 本发明属于天然产物提取技术领域，特别是一种从蛤蜊中提取天然牛磺酸的方 法。
【背景技术】
[0002] 牛磺酸因1827年首先在牛胆汁中发现而得名。它是名贵中药牛黄的主要成分，又 称牛胆碱、牛胆酸或牛胆素。牛磺酸作为一种重要的生物活性物质，一种含硫的非蛋白质氨 基酸，在人体中起着极其重要的作用。自发现以来，牛磺酸作为人体必需的氨基酸营养条 件，越来越受到人们的重视。牛磺酸在人体中的分布十分广泛，牛磺酸能促进大脑发育，神 经传导的调度，支持正常的心脏，肝脏的功效，内分泌，牛磺酸视网膜系统，特殊的生理和药 理作用，具有广泛的应用在医药和食品行业。
[0003] 牛磺酸生产主要有天然物中提取、化工合成和微生物发酵三种方法。陆地动物肝 脏中含有较丰富的牛磺酸，特别是牛的胆汁中的含量高。海洋动物体内含有较多的牛磺酸。 由于牛磺酸在天然生物中较分散、量少，所以人们工业获取牛磺酸主要还是要靠化工合成。 自从1950年世界各国开始进行人工合成牛磺酸的研究，牛磺酸的合成工艺将近十多种，其 中二氯乙烷法、乙醇胺法等化学合成法已工业化。另外据日本专利报道，可用发酵法制取牛 磺酸。牛磺酸的生产厂家主要集中在日本、美国、欧洲等发达国家和地区，其产量在迅速增 加。
[0004] 牛磺酸在水产品中含量非常丰富，且以游离的形式存在，如：墨鱼、章鱼、青花鱼、 虾、牡蛎、蛤蜊等。尤其真蛸类和甲壳类海产品中牛磺酸的含量最多，如:沙虫干、牡蛎和翡 翠贻贝中含量也不少于l〇〇〇〇mg/kg，马氏珠母贝中含量将近13000mg/kg，而章鱼体内含天 然牛磺酸更是高达16000mg/kg，从海产品中提取牛磺酸的工艺简单而无污染，并且用水产 品的下脚料提取牛磺酸又具有环保的意义，前景非常好。
[0005] 自1950年初以来，在世界上开始人工合成牛磺酸。目前，国内外市场上使用的牛磺 酸有化学合成的牛磺酸和天然牛磺酸，但其中多为化学合成法生产。虽然合成法牛磺酸价 格低廉，但存在原料毒性大，工艺操作复杂，环境污染等问题。随着人民生活水平的提高和 绿色化学的进展，人们越来越提倡使用天然提取的牛磺酸。因此，从天然产物中提取牛磺酸 成为市场迫切需求，具有很大的应用前景。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，将牛磺酸通过除蛋白、脱色、分离纯化等 方法从蛤蜊中提取。
[0007] 本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的:从蛤蜊中提取天然牛磺酸的 方法，包含下列步骤:S1利用蛤蜊制备含牛磺酸的清液;S2将所述清液除蛋白；S3将所述步 骤S2的产品进行分离纯化。
[0008] 优选地，所述步骤S1包含下列步骤:S1.1将蛤蜊清洗去壳取出蛤蜊肉；S1.2将蛤蜊 肉放入到组织捣碎机中匀浆;SI. 3将匀浆后蛤蜊肉称重并用3倍质量的水稀释;SI.4调节pH 值;S1.5放入恒温培养箱里进行水提取;S1.6将水提取产物进行过滤，取滤液。
[0009] 优选地，所述步骤S2包含下列步骤:S2.1除酸性蛋白；S2.2除碱性蛋白。
[0010] 优选地，所述步骤S2.1除酸性蛋白采用盐酸将所述步骤S1产物的pH调至3.5,然后 在4500r/min下离心20分钟，并收集上清液。
[0011] 优选地，所述步骤S2.2除碱性蛋白采用氢氧化钠将所述步骤S2.1的产物的pH调至 10,在4500r/min下离心20分钟，收集上清液。
[0012] 优选地，所述步骤S3的具体步骤为：S3.1调节所述步骤S2产物的pH到4.5; S3.2将 所述步骤S3.1的产物注入强酸性阳离子树脂交换柱，并采用蒸馏水进行洗脱;S3.3收集吸 光度最高峰值〇. 55左右的部分流出液。
[0013] 优选地，所述步骤S2与所述步骤S3之间存在对所述步骤S2产物进行脱色的步骤。
[0014] 优选地，所述脱色步骤具体包含：向所述步骤S2的产物中加入活性炭进行脱色。
[0015] 优选地，向每100mL所述步骤S2的产物中加入2~3g活性炭。
[0016] 本发明的优点和积极效果是：原料无毒性，易获取，不存在环境污染的问题。且工 艺操作简单，产量大。获得的牛磺酸晶体相对于化学合成法产出的具有更高的生物活性。也 在一定程度上促进了蛤蜊的深加工，缓解了鲜食蛤蜊过剩和运输困难的情况。
【附图说明】
[0017] 图1为牛磺酸的标准曲线图；
[0018] 图2为牛磺酸标准品红外光谱图；
[0019] 图3为实验提取牛磺酸的红外光谱图；
[0020] 图4为牛磺酸标准品核磁共振氢谱图；
[0021 ]图5为牛磺酸样品品核磁共振氢谱图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图、通过具体实施例对本发明作进一步详述。以下实施例只是描述性 的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。实施例中所述实验方法如无特殊说 明，均为常规方法;如无特殊说明，所述试剂和器材，均可从商业途径获得。
[0023]实验试剂
[0025]实验仪器
[0028] 标准曲线回归方程的确定
[0029] 在7个lO.OmL的容量瓶中依次分别加入1.0mmol/L牛磺酸标准液0mL、lmL、2mL、 4mL、6mL、8mL、10mL，加蒸馏水定容并摇匀，各取1. OmL，加入体积比为2:3的甲醛-乙酰丙酮 1. OmL作为显色剂，8mL 1. Omo 1 /L醋酸钠，置于10 0 °C的水浴中加热15m i η，冷却至室温，于 400nm波长下测定吸光度Α，得到牛磺酸标准曲线数据数据表(如表1所示）。根据表1提供的 数据获得标准曲线(如图1所示），计算其回归方程式。
[0030] 本发明所使用的牛磺酸显色原理为：在醋酸钠存在下，牛磺酸与乙酰丙酮和甲醛 经加热反应生成N-取代基2，6-二甲基3，5-二乙酰基1，4二氢吡啶配合物。该配合物显黄色， 其吸光度与牛磺酸含量在一定范围内成正比，最大吸收波长为390~400nm。
[0031] 表1牛磺酸标准曲线数据
[0032]
[0033] 实施例1
[0034]步骤1:含牛磺酸清液的制备
[0035] 蛤蜊经清洗去壳后，取出蛤蜊肉。将取出的蛤蜊肉放入到组织捣碎机中匀浆，将经 过匀浆的蛤蜊肉放到电子天平上称重并用3倍质量的水稀释后调节pH值至中性，将匀浆液 放入60°C恒温培养箱里静置进行恒温提取，利用水循环抽滤机对匀浆液进行过滤，取滤液。
[0036] 步骤2:除蛋白
[0037]除酸性蛋白：采用5 %的盐酸将滤液的pH调至3.5，然后在4500r/min下离心20分 钟，并收集上清液。
[0038]除碱性蛋白：采用5%的氢氧化钠将已经去除酸性蛋白的上清液的pH调至10,在 4500r/min下离心20分钟，收集上清液。
[0039] 步骤3:脱色
[0040]向收集的上清液中加入适量的活性炭进行脱色，优选方案为每100mL加入2~3g， 将过滤后的溶液pH用5 % HC1调节至4.5，待用。
[0041 ] 步骤4:分离纯化
[0042]吸取8.OmL收集的溶液注入732型强酸性阳离子树脂交换柱，并采用蒸馏水进行洗 脱，洗脱速度在2mL/min，收集吸光度最高峰值0.55左右的部分流出液。
[0043]步骤5:提取量的测定
[0044] 采用甲醛-乙酰丙酮法测定牛磺酸的提取量。取lmL流出液或其稀释液，加 lmol/L 醋酸钠溶液8mL，加入lmL甲醛-乙酰丙酮(V: V = 2:3)作为显色剂，配制1 OmL溶液，在100 °C水 浴中保温15分钟，冷却至室温，在400nm波长处测定吸光度，通过牛磺酸标准溶液吸收曲线 (如图1所示），确定牛磺酸的提取量。
[0045] 步骤6:检测结晶
[0046] 采用紫外分光光度法检测含有牛磺酸的组分，将其放到4°C冰箱中放置2h，得到牛 磺酸粗品结晶。将粗品重新溶解于水，过滤后，再加入无水乙醇，放置于4°C重结晶，将固液 进行分离，如此结晶，再反复重结晶，即可得到纯的牛磺酸晶体。
[0047]单因素实验
[0048]取4支洁净的干燥试管，于每支试管中放入洗脱后所获得的清液2mL，在测得的最 适温度45摄氏度下将溶液调至pH5.5，分别提取4h、6h、12h后，用紫外分光光度计测其400nm 的吸光值。
[0049] 表2考察不同时间对提取结果的影响
[0050]
[0051]取4支洁净干燥试管，于每支试管中放入清液2mL，在测得的最适温度45摄氏度下 分别将溶液调至PH4.0，pH5.5，pH7.0提取时间为6h，用紫外分光光度计测其400nm的吸光 值。
[0052]表3考察不同pH对提取结果的影响
[0053]
[0054] 正交实验
[0055]根据上述单因素实验数据设计L33三因素三水平正交试验，如下表：
[0056] 表4正交实验设计表
[0058]表5正交实验结果和分析
[0061]根据正交实验得到最佳提取条件：自溶破壁水提取工艺的最适条件为温度45°C， 提取时间为6h，pH5.5。利用紫外分管光度法测定的牛磺酸得率为0.79%，最大T提取量为每 200克提取到1.58克牛磺酸。
[0062] 红外检测
[0063]在牛磺酸的红外检测实验中，采用了溴化钾压片法，具体实验的实施是参照国家 标准GB/T 6040-2002《红外光谱分析方法通则》进行的。如图2、3所示，比对样品和牛磺酸标 准品的红外吸收峰图片，可获知经无水乙醇处理析出的白色针状晶体就是高纯度天然牛磺 酸。
[0064]核磁检测
[0065]如图4、5所示，核磁共振谱图中出现三个信号，说明有三种不同种类的H，非别是δ 4.646、δ3.296和δ3.132[27 ]经比对，这些数据与标准品相类似，说明从牛磺酸匀浆液中获 取的白色针状晶体为高纯度天然牛磺酸晶体。
【主权项】
1. 从蛤蜊中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，包含下列步骤： Sl利用蛤蜊制备含牛磺酸的清液； S2将所述清液除蛋白； S3将所述步骤S2的产品进行分离纯化。2. 根据权利要求1所述的从蛤蜊中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，所述步骤Sl包 含下列步骤： Sl. 1将蛤蜊清洗去壳取出蛤蜊肉； Sl. 2将蛤蜊肉放入到组织捣碎机中匀浆； SI.3将匀浆后蛤蜊肉称重并用3倍质量的水稀释； SI. 4调节pH值； Sl. 5放入恒温培养箱里进行水提取； Sl. 6将水提取产物进行过滤，取滤液。3. 根据权利要求1所述的从蛤蜊中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，所述步骤S2包 含下列步骤： S2.1除酸性蛋白； S2.2除喊性蛋白。4. 根据权利要求3所述的从蛤蜊中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，所述步骤S2.1 除酸性蛋白采用盐酸将所述步骤Sl产物的pH调至3.5,然后在4500r/min下离心20分钟，并 收集上清液。5. 根据权利要求3所述的从蛤蜊中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，所述步骤S2.2 除碱性蛋白采用氢氧化钠将所述步骤S2.1的产物的pH调至10,在4500r/min下离心20分钟， 收集上清液。6. 根据权利要求1所述的从蛤蜊中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，所述步骤S3的 具体步骤为： S3.1调节所述步骤S2产物的pH到4.5; S3.2将所述步骤S3.1的产物注入强酸性阳离子树脂交换柱，并采用蒸馏水进行洗脱； S3.3收集吸光度最高峰值0.55左右的部分流出液。7. 根据权利要求1-6任一权利要求所述的从蛤蜊中提取天然牛磺酸的方法，其特征在 于，所述步骤S2与所述步骤S3之间存在对所述步骤S2产物进行脱色的步骤。8. 根据权利要求7所述的从蛤蜊中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，所述脱色步骤 具体包含：向所述步骤S2的产物中加入活性炭进行脱色。9. 根据权利要求8所述的从蛤蜊中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，向每IOOmL所 述步骤S2的产物中加入2~3g活性炭。
【文档编号】C07C309/14GK105949090SQ201610559725
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月14日
【发明人】马金龙, 于克春, 刘璇, 孙垚, 严鑫
【申请人】大连民族大学