从贻贝中提取天然牛磺酸的方法

从贻贝中提取天然牛磺酸的方法
【专利摘要】本发明涉及从贻贝中提取天然牛磺酸的方法，属于化学提取技术领域。本发明从贻贝中提取天然牛磺酸的方法包含下列步骤：S1利用贻贝制备含牛磺酸的清液；S2将所述清液除蛋白；S3将所述步骤S3的产品进行分离纯化。本发明的有益效果为：原料取用大连地区最普遍贻贝作为原料，价格低廉，属于低端海产品，和方式提取，不存在环境污染的问题。且工艺操作简单，产量大。采用从含牛磺酸量最高的海产品中提取，温继而经过一列的操作后，无有机溶剂残留，做到天然提取。
【专利说明】
从贻贝中提取天然牛磺酸的方法
技术领域
[0001] 本发明属于化学提取技术领域，特别是一种从贻贝中提取天然牛磺酸的方法。
【背景技术】
[0002] 牛磺酸是一种含硫的β氨基酸，具有广泛的生物学功能，主要有促进大脑发育，增 强视力，调节神经传导，促进吸收、消化脂肪，参与胆固醇的代谢，维护心脑血管，内分泌机 能，抗氧化等的作用。因而具有提高记忆力，增强视力，减脂，降低胆固醇，保护心脑血管，抗 衰老，提高免疫力等都具有一定功效。随着对牛磺酸的作用机理的深入研究，其应用也将越 来越广泛。牛磺酸作为人和动物的一种重要营养物质，从天然产物中提取一直备受重视。
[0003] 普通食物中牛磺酸含量极低或还有待发现，但海产品却含有很高的含量。我国海 洋生物资源丰富，例如牡蛎、扇贝、章鱼等海产品中含量丰富，但产品本身价格比较昂贵，如 果从他们中提取牛磺酸则成本较高。本课题通过前期调查研究，发现贻贝、海虹和虾头及虾 的下脚料中同样含有丰富的牛磺酸。这些产品在大连地区广泛存在，且价格低廉。从海产品 中提取牛磺酸的工艺简单而无污染，并且用水产品的下脚料提取牛磺酸又具有环保的意 义，前景非常好。
[0004] 自1950年初以来，在世界上开始人工合成牛磺酸。目前，国内外市场上使用的牛磺 酸有化学合成的牛磺酸和天然牛磺酸，但其中多为化学合成法生产。虽然合成法牛磺酸价 格低廉，但存在原料毒性大，工艺操作复杂，环境污染等问题。随着人民生活水平的提高和 绿色化学的进展，人们越来越提倡使用天然提取的牛磺酸。因此，从天然产物中提取牛磺酸 成为市场迫切需求，具有很大的应用前景。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，将牛磺酸通过除蛋白、脱色、分离纯化等 方法从虾中提取。
[0006] 本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的:从贻贝中提取天然牛磺酸的 方法，包含下列步骤:S1利用贻贝制备含牛磺酸的清液;S2将所述清液除蛋白；S3将所述步 骤S2的产品进行分离纯化。
[0007] 优选地，所述步骤S1包含下列步骤:S1.1将贻贝清洗去壳取出贻贝肉；S1.2将将贻 贝肉放入到组织捣碎机中匀浆;S1.3将匀浆后贻贝肉称重并用3倍质量的水稀释;S1.4调节 pH值;S1.5放入恒温培养箱里进行水提取;S1.6将水提取产物进行过滤，取滤液。
[0008] 优选地，所述步骤S2包含下列步骤:S2.1除酸性蛋白；S2.2除碱性蛋白。
[0009] 优选地，所述步骤S2.1除酸性蛋白采用盐酸将所述步骤S1产物的pH调至3-4,然后 在4500r/min下离心20分钟，并收集上清液。
[0010] 优选地，所述步骤S2.2除碱性蛋白采用氢氧化钠将所述步骤S2.1的产物的pH调至 9-10,在4500r/min下离心20分钟，收集上清液。
[0011] 优选地，所述步骤S3的具体步骤为:S3.1调节所述步骤S2产物的pH到4-5; S3.2将 所述步骤S3.1的产物注入强酸性阳离子树脂交换柱，并采用蒸馏水进行洗脱;S3.3收集吸 光度最高峰值〇. 55左右的部分流出液。
[0012] 优选地，所述步骤S2与所述步骤S3之间存在对所述步骤S2产物进行脱色的步骤。
[0013] 优选地，所述脱色步骤具体包含：向所述步骤S2的产物中加入活性炭进行脱色。
[0014] 优选地，向每100mL所述步骤S2的产物中加入2~3g活性炭。
[0015] 本发明的优点和积极效果是:原料无毒性益获取，不存在环境污染的问题。且工艺 操作简单，产量大。采用从含牛磺酸量最高的海产品中提取，取用大连地区最普遍的贻贝作 为原料。温和方式提取，继而经过一列的操作后，无有机溶剂残留，做到天然提取。
【附图说明】
[0016] 图1为牛磺酸的标准曲线图；
[0017] 图2为pH对牛磺酸提取影响曲线图；
[0018] 图3为酶解时间对牛磺酸提取影响曲线图；
[0019] 图4为酶解温度对牛磺酸提取影响曲线图；
[0020] 图5为各因素效应曲线图；
[0021 ]图6为牛磺酸标准品红外光谱图；
[0022] 图7为实验提取牛磺酸的红外光谱图；
[0023] 图8为牛磺酸标准品核磁共振氢谱图；
[0024] 图9为牛磺酸样品品核磁共振氢谱图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图、通过具体实施例对本发明作进一步详述。以下实施例只是描述性 的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。实施例中所述实验方法如无特殊说 明，均为常规方法;如无特殊说明，所述试剂和器材，均可从商业途径获得。
[0026] 实验试剂
[0028]实验仪器
[0030]标准曲线回归方程的确定
[0031 ]分别取 10mmol/L 牛横酸标准液 OmL、lmL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL，定容至 10mL，各 取一毫升，加入lml显色剂、8ml lmol/L醋酸钠，在400nm下测量0D值，得到标准曲线（如图 1)〇
[0032] 显色剂由10ml lmol/L醋酸钠、0.4ml乙酰丙酮、lml甲醛用去离子水定容至25ml配 制，需临用现配。颜色反应背后的原因是，在含有醋酸钠的溶液中，牛磺酸与乙酰丙酮和甲 醛在高温条件下可以产生N-取代基2，6-二甲基3，5-二乙酰基1，4二氢吡啶。这种配合物能 够呈现出明显的黄色，并且牛磺酸含量越高，则颜色越明显，最大吸收波长为390~400nm。
[0033] 本发明所使用的牛磺酸显色原理为：在醋酸钠存在下，牛磺酸与乙酰丙酮和甲醛 经加热反应生成N-取代基2，6-二甲基3，5-二乙酰基1，4二氢吡啶配合物。该配合物显黄色， 其吸光度与牛磺酸含量在一定范围内成正比，最大吸收波长为390~400nm。
[0034] 实施例1
[0035]步骤1:含牛磺酸清液的制备
[0036]将贻贝肉粉碎，加入纯水，搅拌10min，搅拌器转速30r/min，将经过匀浆的虾肉用 等量体积的水稀释后调节pH值至中性。
[0037] 步骤2:超声破碎
[0038]为方便牛磺酸更好的融入匀浆液中，根据实验组的不同，使用超声波破碎仪分别 进行5min、10min、15min、20min、25min的破碎，利用水循环抽滤机对勾衆液进行过滤，取滤 液。
[0039]步骤3:酶法粗提牛磺酸
[0040] 取破碎好的勾衆液30ml，向其中加入0.5g中性木瓜蛋白酶，混勾后调节pH至指定 值放入指定温度恒温水域锅中，静置20min，中间搅动几次。将提取完成的匀浆液，放入100 摄氏度的水浴锅中加热15min，使木瓜蛋白酶在高温作用下失去活性。
[0041]单因素实验过程中，取三个变量，除上述提到的超声波破碎时间，还有酶提取的温 度和pH，每个变量各设五个水平。经查询，实验所使用的木瓜蛋白酶的使用pH为6~7，使用 温度为55~65°C，我将其pH范围扩至5.5~7.5，并以每相差0.5为一个档进行单因素实验； 将其温度范围扩至45~65°C，并以每5°C为一个档。
[0042]正交实验过程当中，依据钟形曲线，从五个条件设置中选出四个条件，进行三因素 四水平的正交实验。
[0043] 步骤4:除蛋白
[0044] 取灭酶后的蛤蜊肉匀浆液(提取液），使用循环水真空抽滤装置反复抽滤2~3次至 提取液呈微微发白的清澈溶液。
[0045] 用5%HC1(质量比，下文所提到的所有百分比均为质量比）调节提取液pH至4~5， 常温、4500r/min离心15min。留上清液。
[0046] 上一步中获得的上清液用浓度为5%Na0H调节pH至9~10,并继续在常温条件下、 以4500r/min的速度离心15min。留上清液。
[0047] 步骤5:脱色
[0048]向收集的上清液中加入适量的活性炭进行脱色，优选方案为每100mL加入2~3g， 将过滤后的溶液pH用5 % HC1调节至4.5，待用。
[0049] 步骤6:分离纯化
[0050]吸取8. OmL收集的溶液注入7cm X 60cm强酸性阳离子树脂交换柱，并采用蒸馏水进 行洗脱，洗脱速度在2mL/min，收集吸光度最高峰值左右的部分流出液。
[0051 ]步骤7:提取量的测定
[0052] 采用甲醛-乙酰丙酮法测定牛磺酸的提取量。取lmL流出液或其稀释液，加 lmol/L 醋酸钠溶液8mL，加入1 mL甲醛-乙酰丙酮作为显色齐I」，配制1 OmL溶液，在10 0 °C水浴中保温15 分钟，冷却至室温，在400nm波长处测定吸光度，通过牛磺酸标准溶液吸收曲线（如图1所 示），确定牛磺酸的提取量。
[0053]步骤8:检测结晶
[0054]采用紫外分光光度法检测含有牛磺酸的组分，将其放到4°C冰箱中放置2h，得到牛 磺酸粗品结晶。将粗品重新溶解于水，过滤后，再加入无水乙醇，放置于4°C重结晶，将固液 进行分离，如此结晶，再反复重结晶，即可得到纯的牛磺酸晶体。
[0055]单因素实验
[0056]取50克贻贝肉，加入150克去离子水，放入组织粉粹机制成匀浆液;将匀浆液分成 均等的5份，并依次将匀浆液pH值调成5、5.5、6、6.5、7，温度控制在55 °C，加入浓度为0.6 % 的木瓜蛋白酶，在超声波细胞破碎仪作用下进行细胞破碎提取15min。得出pH对牛磺酸提取 的影响结果如图2所示。
[0057]根据图2及数据分析得pH= 5.5时牛磺酸提取得率最高，在pH5.5以后，牛磺酸的得 率在依次下降。故确定最佳pH条件为5.5。
[0058]取50克贻贝肉，加入150克去离子水，放入组织粉粹机制成匀浆液;将匀浆液分成 均等的5份，并依次设置超声波_酶解破碎时酶解时间为5min、10min、15min、20min、25min， pH控制在5.5，酶解温度为55°C。加入浓度为0.6%的木瓜蛋白酶，在超声波细胞破碎仪作用 下进行细胞破碎提取。
[0059]根据图3可知酶解时间在20min时，牛磺酸的提取率达到峰值，酶解20min以后牛磺 酸得率呈下降趋势，故确定最适酶解时间为20min。
[0060]取50克贻贝肉，加入150克去离子水，放入组织粉粹机制成匀浆液;将匀浆液分成 均等的5份，并依次设置超声波酶解破碎时酶解温度依次为45°C、50°C、55°C、60°C、65°C，pH 控制在5.5，加入浓度为0.6 %的木瓜蛋白酶，在超声波细胞破碎仪作用下进行细胞破碎提 取15min。得酶解温度对牛磺酸提取的影响结果如图4所示。
[0061] 根据图4可知，最初提取时间逐渐延续，牛磺酸的提取得率也随着时间的延续极显 著提高，且60°C前牛磺酸提取得率增加趋势十分明显，当提取时间在60°C时，牛磺酸的提取 得率最大，此后时间再延续，牛磺酸的提取得率均低于60°C时的得率，故选择60°C为最佳提 取时间。
[0062] 正交实验 [0063] 表1实验因素表
[0066]根据设计的正交实验表进行操作，得到正交结果表2。
[0067] 表2正交实验结果直观分析表
[0068]
[0069]根据分光光度法测定牛磺酸的提取量，确定标准曲线方程为￥ = 2.22571_ 0.01857，R2 = 0.99118,可确定材料蛤蜊中所选择的单因素条件符合线性规律，可作为正交 实验的水平条件，确定信息如图5所示。
[0070] 根据直观分析表中数据可知，酶解温度、PH、破碎时间的极差依次减小，说明酶解 温度、pH、破碎时间对牛磺酸提取实验的影响顺序依次为酶解温度〉pH>破碎时间。根据表确 定最佳提取条件为pH为5.5，超声波-酶解破碎时间为20min，破碎温度为60 °C。
[0071] 红外检测
[0072] 在牛磺酸的红外检测实验中，采用了溴化钾压片法，具体实验的实施是参照国家 标准GB/T 6040-2002《红外光谱分析方法通则》进行的。如图6、7,比对样品和牛磺酸标准品 的红外吸收峰图片，可获知经无水乙醇处理析出的白色针状晶体就是高纯度天然牛磺酸。 [0073]核磁检测
[0074]如图8、9,所示，核磁共振谱图中出现三个信号，说明有三种不同种类的H，非别是δ 4.646、δ3.296和δ3.132[27 ]经比对，这些数据与标准品相类似，说明从虾匀浆液中获取的 白色针状晶体为高纯度天然牛磺酸晶体。
【主权项】
1. 从贻贝中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，包含下列步骤： Sl利用贻贝制备含牛磺酸的清液； S2将所述清液除蛋白； S3将所述步骤S2的产品进行分离纯化。2. 根据权利要求1所述的从贻贝中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，所述步骤Sl包 含下列步骤： Sl. 1将贻贝清洗去壳取出贻贝肉； Sl. 2将贻贝肉放入到组织捣碎机中匀浆； SI.3将匀浆后贻贝肉称重并用3倍质量的水稀释； SI. 4调节pH值； Sl. 5放入恒温培养箱里进行水提取； Sl. 6将水提取产物进行过滤，取滤液。3. 根据权利要求1所述的从贻贝中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，所述步骤S2包 含下列步骤： S2.1除酸性蛋白； S2.2除喊性蛋白。4. 根据权利要求3所述的从贻贝中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，所述步骤S2.1 除酸性蛋白采用盐酸将所述步骤Sl产物的pH调至3-4,然后在4500r/min下离心20分钟，并 收集上清液。5. 根据权利要求3所述的从贻贝中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，所述步骤S2.2 除碱性蛋白采用氢氧化钠将所述步骤S2.1的产物的pH调至9-10,在4500r/min下离心20分 钟，收集上清液。6. 根据权利要求1所述的从贻贝中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，所述步骤S3的 具体步骤为： S3.1调节所述步骤S2产物的pH到4.5; S3.2将所述步骤S3.1的产物注入强酸性阳离子树脂交换柱，并采用蒸馏水进行洗脱； S3.3收集吸光度最高峰值0.55左右的部分流出液。7. 根据权利要求1-6任一权利要求所述的从贻贝中提取天然牛磺酸的方法，其特征在 于，所述步骤S2与所述步骤S3之间存在对所述步骤S2产物进行脱色的步骤。8. 根据权利要求7所述的从贻贝中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，所述脱色步骤 具体包含：向所述步骤S2的产物中加入活性炭进行脱色。9. 根据权利要求8所述的从贻贝中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，向每IOOmL所 述步骤S2的产物中加入2~3g活性炭。
【文档编号】C07C309/14GK105949089SQ201610556023
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月14日
【发明人】马金龙, 于克春, 刘璇, 孙垚, 严鑫
【申请人】大连民族大学