一种抗菌消炎化合物的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗菌消炎化合物的制备方法，包括：酶解：将紫草粉碎，分散于水中，加入复合酶制剂进行酶解；以质量百分比计，所述复合酶制剂的组成为：纤维素酶，50～80％；果胶酶，15～30％；其余为木聚糖酶；所述复合酶制剂的平均酶活为10000～50000单位；所述复合酶制剂的添加量为紫草质量的0.2～0.8％；碱水提取：酶解后向体系中加入氢氧化钠进行提取，得紫草萃取物；分离纯化：从所述的紫草萃取物中分离纯化得所述的紫草素。本发明公开了生产周期短、步骤少、损耗低、绿色环保的高纯度紫草素生产工艺。
【专利说明】
一种抗菌消炎化合物的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及化合物制备，具体涉及从紫草中提取和纯化紫草素的方法。
【背景技术】
[0002] 紫草素(Shikonin)具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节、杀菌、抗病毒等作用。由于提取技 术和分离纯化成本过高，目前国内以紫草素为原料的新药产品暂未正式进入市场，因此紫 草素提取和纯化技术的突破，是实现该天然产物进一步开发成药物制剂的关键。
[0003]目前市场上能够规模化提供的紫草素仅仅为含量不到0.5 %的粗提物，具有高纯 度(含量达90 %以上）紫草素制备能力的机构寥若星辰，其制备规模仅仅为实验室毫克级。 能够规模化生产的高纯度高收率紫草素是国内外趋之若鸯的亟需品。2015年刘晓华等采用 正交设计，得到优化工艺即为用20倍用量的95%乙醇在60°C浸提两次，时间为4h，提取中发 现温度超过60°C，紫草素的破坏程度较大。与我们试验结果一致，乙醇提取浓缩对紫草素破 坏很大。2010年李根优选出油法提取紫草素的最佳工艺。方法以紫草素的含量为工艺考察 指标，用高效液相色谱建立左旋紫草素含量测定方法，结果选用紫草，加8倍菜籽油，温度 140 °C，加热0.5h为最优提取工艺。结论优选的提取工艺合理、可行，质量可控。但油浸法生 产成本太高。
[0004] 因此提供一种低生产成本，高纯度的紫草素的制备方法都具有较大的现实意义。
【发明内容】
[0005] 为解决上述从紫草中提取紫草素的现有技术存在的问题，本发明人经过大量的生 产实践，终于发明出一种生产周期短、步骤少、损耗低、绿色环保的高纯度紫草素生产工艺。
[0006] -种抗菌消炎化合物的制备方法，包括：
[0007] (1)酶解:将紫草粉碎，分散于水中，加入复合酶制剂进行酶解；
[0008] 以质量百分比计，所述复合酶制剂的组成为：纤维素酶，50~80%;果胶酶，15~ 30% ;其余为木聚糖酶;所述复合酶制剂的平均酶活为10000~50000单位;所述复合酶制剂 的添加量为紫草质量的〇. 2~0.8% ;
[0009] (2)碱水提取:酶解后向体系中加入氢氧化钠进行提取，得紫草萃取物；
[0010] (3)分离纯化:从所述的紫草萃取物中分离纯化得所述的紫草素。
[0011] 紫草经过粉碎可充分提高提取效果，但也不能粉碎太细，否则不好过滤，一般粉碎 至10~40目，优选为20目。
[0012] 本申请采用廉价无污染的水作为提取溶剂，紫草粉碎后分散于水中，一般液料比 (即提取溶剂与原料紫草的体积质量比）为10~16:1，优选为12~14:1。
[0013] 复合酶为一定比例的纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶，可以充分水解紫草的植物细 胞壁纤维和其中的胶质，有利于下一步碱水提取紫草过程中，紫草素的充分释放和溶出。复 合酶制剂的配比为纤维素酶质量分数50~80%，果胶酶质量分数为15~30%，其余为木聚 糖酶，复合酶制剂的平均酶活为10000~50000单位，酶活单位遵从1961年国际酶学会议规 定，是指在特定条件(25°C，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或 是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。优选的，以质量百分比计，所述复合酶制剂的组 成为:纤维素酶，50~65% ;果胶酶，20~30% ;其余为木聚糖酶。复合酶制剂的平均酶活为 35000~45000单位。更优选的，以质量百分比计，所述复合酶制剂的组成为：纤维素酶， 50 % ;果胶酶，30 % ;其余为木聚糖酶。
[0014] 优选的，所述复合酶制剂的添加量为紫草质量的0.2~0.4%，更优选为0.2%。
[0015] 另外，适宜的酶解时间和温度有利于充分提取紫草素，所述酶解的时间6~15小 时，酶解的温度35~55°C。优选的，所述酶解的时间6~12小时，酶解的温度35~45°C。更优 选的，所述酶解的时间12小时，酶解的温度45°C。
[0016] 为提高酶解效果，酶解过程中不断搅拌。
[0017] 酶解结束后即可进行碱水提取，氢氧化钠的浓度可以为20% (水溶液），其加入量 为至氢氧化钠的终浓度为〇. 2~0.5M，提取时间1~2h，采用浓适中的碱浓度，可以减少副产 物的产生，提取时间过短，水解不完全，提取时间过长，也会增加副产物，提取可在室温中进 行，并在提取过程中进行搅拌。
[0018] 碱水提取得到紫草素萃取物。由于紫草素属于小极性物质，通常采用有机溶剂提 取，但在碱性条件下，紫草素可以形成可溶性盐，并且紫草素的其他酰基化衍生物也可以在 碱水中全部水解转化为紫草素可溶性盐。
[0019] 所述的分离纯化包括:将所述的紫草素萃取物过滤后经氧化铝柱层析、甲醇解析、 浓缩、干燥得到紫草素粗品，紫草素粗品经乙醇结晶，过滤并干燥后得纯度大于98%的紫草 素纯品。
[0020] 与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
[0021] 本发明先用复合酶制剂酶解处理紫草，降解紫草中的细胞壁纤维素和果胶类物 质，让包裹在其中的紫草素在碱水提取条件下，充分从紫草中释放和溶出，有效缩短了提取 时间，提高了有效成分的提取率，而使用碱水直接提取达不到这样的提取效果;并且碱水条 件下将紫草素衍生物全部转化为紫草，紫草素收率进一步提高;避免使用有机溶剂，减少了 脂溶性杂质的溶出，有利于后续简化纯化工艺。
[0022]本发明采用水作为提取溶剂，无毒，廉价易得。
[0023] 综上所述，本发明通过将以上多项技术进行有效集成，实现了从紫草中提取和纯 化紫草素的低成本、少步骤、低损耗和绿色环保生产，市场竞争力强，应用前景广阔。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
[0025] 纤维素酶:河北百味生物科技有限公司，批号15112586。
[0026] 果胶酶:河北百味生物科技有限公司，批号15100725。
[0027] 木聚糖酶:河北百味生物科技有限公司，批号16041806。
[0028] 实施例1
[0029] (1)原料药材的处理:将原料紫草进行粉碎，粉碎至20目；
[0030] (2)酶解:加入12倍（即液料比为12:1)纯化水和药材质量0.4 %的复合酶制剂进行 酶解，酶解时间1 〇小时，酶解温度45 °C，酶解过程中不断搅拌；
[0031] 复合酶制剂组成为:纤维素酶质量分数60%，果胶酶质量分数为25%，其余为木聚 糖酶，复合酶制剂的平均酶活为45000单位。
[0032] (3)碱水提取:酶解后加入质量分数为20 %的氢氧化钠溶液，至氢氧化钠终浓度为 0.3M，室温搅拌2h提取紫草素，得到紫草素萃取物。
[0033] (4)分离纯化:将萃取物过滤后经6倍量氧化铝柱层析、3倍柱体积的甲醇解析、浓 缩、干燥得到紫草素粗品；紫草素粗品经乙醇三次结晶，过滤并干燥后得纯度98.5%的紫草 素纯品，收率为84.6%。
[0034]本领域人员可以理解："将萃取物过滤后经6倍量氧化铝柱层析、3倍柱体积的甲醇 解析、浓缩、干燥得到紫草素粗品"的含义为:将萃取物过滤后加入到填料为氧化铝的层析 柱中，然后用3倍柱体积的甲醇进行洗脱，洗脱下来的溶液进行浓缩、干燥得到紫草素粗品， 其中，6倍量是指柱体积为上样量的六倍。
[0035] 实施例2
[0036] (1)原料药材的处理:将原料紫草进行粉碎，粉碎至20目；
[0037] (2)微波辅助酶解:加入10倍纯化水和药材质量0.2%的复合酶制剂进行酶解，酶 解时间6小时，酶解温度35 °C，酶解过程中不断搅拌；
[0038]复合酶制剂组成为:纤维素酶质量分数50%，果胶酶质量分数为30%，其余为木聚 糖酶，复合酶制剂的平均酶活为35000单位。
[0039] (3)碱水提取:解后加入质量分数为20 %的氢氧化钠溶液，至氢氧化钠终浓度为 0.2M，室温搅拌lh提取紫草素，得到紫草素萃取物。
[0040] (4)分离纯化:将萃取物过滤后经6倍量氧化铝柱层析、3倍柱体积的甲醇解析、浓 缩、干燥得到紫草素粗品；紫草素粗品经乙醇三次结晶，过滤并干燥后得纯度98.2%的紫草 素纯品，收率为82.3%。
[0041 ] 实施例3
[0042] (1)原料药材的处理:将原料紫草进行粉碎，粉碎至20目；
[0043] (2)微波辅助酶解:加入16倍纯化水和药材质量0.8%的复合酶制剂进行酶解，酶 解时间15小时，酶解温度55 °C，酶解过程中不断搅拌；
[0044] 复合酶制剂组成为:纤维素酶质量分数80%，果胶酶质量分数为15%，其余为木聚 糖酶，复合酶制剂的平均酶活为30000单位。
[0045] (3)碱水提取:解后加入质量分数为20 %的氢氧化钠溶液，至氢氧化钠终浓度为 0.2~0.5M，室温搅拌2h提取紫草素，得到紫草素萃取物。
[0046] (4)分离纯化:将萃取物过滤后经6倍量氧化铝柱层析、3倍柱体积的甲醇解析、浓 缩、干燥得到紫草素粗品；紫草素粗品经乙醇三次结晶，过滤并干燥后得纯度98.6%的紫草 素纯品，收率为81.4%。
[0047] 实施例4
[0048] 改变酶制剂中各酶的含量，其余实施例3,进行紫草素的提取。
[0049] 表 1
[0051 ] 实施例5
[0052] 改变纯化水的加入量，其余制备步骤及参数同实施例3,进行紫草素的提取。
[0053] 表 2
[0056] 实施例6
[0057] 改变复合酶制剂的加入量，其余制备步骤及参数同实施例3,进行紫草素的提取。
[0058] 表3
[0060] 实施例7
[0061] 改变酶解的时间和温度，其余制备步骤及参数同实施例3,进行紫草素的提取。
[0062] 表 4
[0064] 对比例1
[0065] 本实施例为不采用复合酶进行酶解，直接碱水提取，步骤如下：
[0066] (1)原料药材的处理:将原料紫草进行粉碎，粉碎至20目，加入16倍纯化水；
[0067] (2)碱水提取：向体系中加入质量分数为20%的氢氧化钠溶液，至氢氧化钠终浓度 为0.2~0.5M，室温搅拌2h提取紫草素，得到紫草素萃取物。
[0068] (3)分离纯化:将萃取物过滤后经氧化铝柱层析、甲醇解析、浓缩、干燥得到紫草素 粗品；紫草素粗品经乙醇三次结晶，过滤并干燥后得纯度98.6%的紫草素纯品，收率为 34.4%〇
[0069] 本发明按照上述实施例进行了说明应当理解，上述实施例不以任何形式限定本发 明，凡采用等同替换或等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种抗菌消炎化合物的制备方法，其特征在于，包括： (1) 酶解:将紫草粉碎，分散于水中，加入复合酶制剂进行酶解； 以质量百分比计，所述复合酶制剂的组成为：纤维素酶，50~80%;果胶酶，15~30%; 其余为木聚糖酶;所述复合酶制剂的平均酶活为10000~50000单位;所述复合酶制剂的添 加量为紫草质量的0.2~0.8% ; (2) 碱水提取:酶解后向体系中加入氢氧化钠进行提取，得紫草萃取物； (3) 分离纯化:从所述的紫草萃取物中分离纯化得所述的紫草素。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，紫草粉碎至20~40目。3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，液料比为10~16:1。4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以质量百分比计，所述复合酶制剂的 组成为:纤维素酶，50~65 % ;果胶酶，20~30 % ;其余为木聚糖酶。5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述复合酶制剂的添加量为紫草质量 的0.2~0.4% 〇6. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解的时间6~15h，酶解的温度 35 ~55°C。7. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，氢氧化钠在体系中的终浓 度为0.2~0.5M。8. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，碱水提取的时间为1~2h。9. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的分离纯化包括:将所述的紫草 素萃取物过滤后经氧化铝柱层析、甲醇解析、浓缩、干燥得到紫草素粗品，紫草素粗品经乙 醇结晶，过滤并干燥后得所述的紫草素。
【文档编号】C07C46/10GK105949043SQ201610308625
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】杨永安, 魏元刚, 钟慧, 金显友, 易铭, 袁继文
【申请人】江苏耐雀生物工程技术有限公司