固定化蛋白质及其用图

固定化蛋白质及其用图
【专利摘要】本发明涉及一种固定化蛋白质材料，包含通过亲和标记物结合而固定在玻璃材料或有机聚合物上的蛋白质。玻璃材料可以是多孔玻璃材料诸如(混合)控制孔隙度玻璃。本发明还涉及固定化酶材料在化学合成中作为多相生物催化剂的用途。本发明进一步涉及用于将亲和标记的蛋白质固定在玻璃材料或有机聚合物上的方法，并且涉及用于通过将此种蛋白固定在玻璃材料或有机聚合物上来纯化和分离亲和标记的蛋白质的方法。
【专利说明】
固定化蛋白质及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及固定化蛋白质材料，其包含通过亲和标记物结合而被固定在玻璃材料 或有机聚合物上的蛋白质。玻璃材料可以是多孔玻璃材料，诸如(混合)控制孔隙度玻璃。本 发明还涉及固定化酶材料在化学合成中作为多相生物催化剂的用途。本发明进一步涉及用 于将亲和标记的蛋白质固定在玻璃材料或有机聚合物上的方法，并且涉及用于通过将这种 蛋白质固定在玻璃材料或有机聚合物上而纯化和分离亲和标记的蛋白质的方法。
【背景技术】
[0002] 蛋白质是由氨基酸残基的一条或多条直链组成的大生物分子。酶是特定组的蛋白 质，它们在所有活细胞的新陈代谢中充当生物催化剂。因此，酶能够将有机分子转化为不同 的分子。由于每种特定酶的特定三维结构，仅非常少的有机分子会与酶的活性位点以可以 发生转化的方式相互作用。因此，酶通常是高选择性催化剂，并且由于此原因，酶在合成有 机化学中用作催化剂是非常有吸引力的。然而，由于酶是为细胞环境而进化出的生物分子， 因此它们通常不适合其它环境。当在有机溶剂中使用时，酶倾向于聚集且经常展开（即，变 性）。因此，吸引人的是将酶固定在固体载体上并且以这种固定状态将它们用作催化剂，因 为这可以改善酶的稳定性，允许酶正常不能耐受的反应条件并且还有助于从反应混合物的 分离和材料的回收。
[0003] 已经使用不同的技术和不同的固体载体完成了酶在固体载体上的固定化 (Tischer和Wedekind，"Immobilized Enzymes：Methods and Applications"，Topics in Current Chemistry，1999,第200卷，第95-126页；Brena和Batista-Viera， "Immobilization of Enzymes :A Literature Survey^,Methods in Biotechnology： Immobilization of Enzymes and Cells，2006，第二版，第 15-30页）。
[0004] 酶到固体表面的吸附可导致酶与固体载体之间的不期望的相互作用。已经表明， 蛋白质吸附到二氧化硅纳米颗粒可以引起蛋白质的二级结构的变化，这可导致酶的失活 (Lundqvist et al.，Langmuir 2004,第20卷，第 10639-10647页）。因此，重要的是，固体载 体不干扰固定化酶的结构和活性。
[0005] 固定化金属离子亲和色谱（IMAC)是用于纯化蛋白质的技术，其基于蛋白质对金属 离子(诸如?62+、〇! 2+、21!2+、附2+和(：〇2+)的亲和度。金属离子被固定在琼脂糖凝胶上并且可以 选择性吸附含有组氨酸的蛋白质和含有半胱氨酸的蛋白质(Porath et al.，Nature 1975， 第258卷，第598-599页）。这种技术的改进版本使用含有融合聚组氨酸肽的重组蛋白质。由 于与单组氨酸残基相比聚组氨酸肽对于固定化金属离子具有高得多的亲和力，因此能够实 现的纯化水平高得多（Ho chuli等，Nat.Biotec hnol . 1988,第6卷，第1321-1325页； Ljungquist等，Eur · J · Biochem · 1989，第186卷，第563-569页）。虽然该技术能够被成功地应 用在用于纯化和分离蛋白质的色谱程序种，但是凝胶固定化酶不太适合在有机合成中用作 多相催化剂。另外，IMAC技术主要局限于含水条件。
[0006] 在制备多相催化剂的尝试中，已经应用基于頂AC的亲和标记物结合原理来将聚组 氨酸标记的酶固定在改性的二氧化娃上(Cassimjee等，Biotechnol .Bioeng. 2008,第99卷， 第712_716页；Cassimjee等，Biotechno 1. J. 2011，第6卷，第463-469页）。这对于南极假丝酵 母脂肪酶B(CalB)的效果很好，但是发现其它较不稳定的酶在二氧化硅的存在下失活，特别 是在有机溶剂的存在下。在文献中已知的是，二氧化硅纳米颗粒对于蛋白质具有失稳效应 (Lundqvist等，Langmuir 2004,第20卷，第10639-10647页）。
[0007]控制孔隙度玻璃(CPG)是已经用于酶的固定化的另一种材料。通常使用3-氨基丙 基三乙氧基硅烷处理CPG，此后使用戊二醛作为交联剂，使得酶通过存在于酶表面上的赖氨 酸残基结合到氨基丙基-CPG。这导致酶非特异性地结合到CPG，常伴随有酶活性的损失。这 种方法的另一缺点是，待固定的酶在固定步骤之前必须从其它酶中纯化，从而避免不同酶 的混合物固定至CPG上。
[0008] 还已经公开了使用有机钛酸酯（〇找311〇1:;^3仙七6)(1]3 4,632,904)或使用多糖层 和 1，Γ -二羰基二咪唑将酶固定在CPG上（Rogalski等，J ·Mol · Catal · B: Enzym· 1999，第6卷， 第29-39页）。
[0009] Ellgstrom等（Angew.Chem. Int ·Ed. 2013，第52卷，第14006 -14010页）公开了复合 催化剂，其中将南极念珠菌脂肪酶B和纳米钯物质共同固定到介孔二氧化硅的隔室中。
[0010] 在化学工业中将酶作为催化剂（即生物催化剂)使用是实现更高可持续性、更少毒 性废物和更高成本效益的关键。然而，酶的高成本以及在将酶固定到固体载体上之后频繁 观察到的活性损失是这一发展中的障碍。允许酶再利用的用于酶固定的标准化且一般可行 的程序将是高度期望的。尽管在最近几年取得了进展，但是仍然没有用于通过酶的固定化 而制备多相催化剂的通用且简单的方法。因此，仍然存在对于改进的用于将酶固定在固体 载体上的方法，以及对于能够应用于含水和有机反应条件的有机合成中的稳定的多相生物 催化剂的需要。
【附图说明】
[0011 ]图1显示了使用聚组氨酸(polyhistidine，多组氨酸)标记的酶和作为螯合金属的 Co2+，由氨基-(Hyb)CPG到固定化的酶CPG-材料的制备。基团R是适合的连接基，并且因 CPG产 品而不同。示意性地描绘了钴离子到2,4_二羟基苯基残基和聚组氨酸标记的酶的螯合。
[0012] 图2显示了使用聚组氨酸标记的酶、Co2+作为螯合金属以及钯作为金属纳米颗粒， 由氨基-(Hyb)CPG到含有CPG材料的固定化酶和金属纳米颗粒的制备。基团R是适合的连接 基，并且因 CPG产品而不同。示意性地描绘了钯纳米颗粒到CPG材料的结合以及钴离子到2， 4-二羟基苯基残基和聚组氨酸标记的酶的螯合。
【具体实施方式】
[0013] 已经令人惊奇地发现，通过亲和标记物结合将蛋白质固定在多孔玻璃材料或多孔 有机聚合物上，获得了在固定化蛋白质的稳定性方面具有改进性能的固定化蛋白质材料， 并且其中，维持了蛋白质的生物功能。发现固定化酶的制剂具有高催化活性，这使得它们在 生物催化中是有用的。
[0014] 根据本发明，通过结合到附着到多孔玻璃材料或多孔有机聚合物的亲和基质上的 特定基团，固定化含有亲和标记物的蛋白质。由于亲和标记物对于基质上的特定基团的高 结合亲和力，因此蛋白质到基质的结合是强的且高度特异性的。因此，本发明提供了用于蛋 白质(诸如酶)的纯化和固定化的通用方法。
[0015] 在第一方面中，本发明涉及固定化蛋白质材料，其包含载体和固定在该载体上的 至少一种蛋白质，其中载体包含亲和基质附着至其的载体材料，所述载体材料选自由以下 组成的组：
[0016] (a)控制孔隙度玻璃(CPG);
[0017] (b)混合控制孔隙度玻璃(混合CPG);和
[0018] (C)多孔有机聚合物；
[0019] 并且其中至少一种蛋白质含有亲和标记物并且通过至亲和基质的特异性亲和结 合而固定在载体上。
[0020] 蛋白质通过亲和标记物在载体上的固定化赋予了蛋白质在预定位点的特异性结 合的优势。然而，与此同时，固定化方法一般适用于许多不同的蛋白质。在本发明中使用的 亲和标记物可以是能够特异性地结合到其具有亲和力的基质的任何标记物。亲和结合可以 是例如范德华相互作用、氢键、离子键或疏水相互作用的结果。在任何情况下，亲和结合应 当足够的强以允许亲和标记物和基质保持紧密地彼此结合，至少直到施加某些特定条件以 将亲和标记物从基质解离。
[0021] 在另一方面中，本发明涉及用于蛋白质的固定的载体，包含亲和基质附着至其的 载体材料，所述载体材料选自由以下组成的组：
[0022] (a)控制孔隙度玻璃(CPG);
[0023] (b)混合控制孔隙度玻璃(混合CPG);和 [0024] (c)多孔有机聚合物；
[0025]并且其中蛋白质通过与亲和基质的特异性亲和结合而固定在载体上。
[0026]待固定在载体上的蛋白质可以是含有未和标记物的任何蛋白质，诸如含有未和标 记物的（重组)蛋白质或酶。优选地，蛋白质是含有亲和标记物的酶。应当理解的是，标记物 对于附着到载体的亲和基质应当具有特异性亲和力。
[0027]许多亲和标记物及相应的基质在本领域中是已知的。在本发明中可以有用的亲和 标记物的实例以及基质上的相应基团列于下表中： 「00281
[0029] 在优选的实施方式中，蛋白质上的亲和标记物是聚组氨酸标记物并且附着到载体 上的亲和基质含有螯合的金属离子。螯合的金属离子优选的是选自由Fe 2+、Fe3+、C〇2+、Ni 2+、 Cu2+和Zn2+组成的组的金属离子，并且更优选地是选自由Fe3+、Ni 2+和Co2+组成的组的金属离 子。在优选的实施方式中，螯合的金属离子是Co2+。在另一优选的实施方式中，螯合的金属离 子是Fe 3+。
[0030] 螯合的金属离子的选择可取决于预期的用途。例如，如果载体要用于亲和标记的 蛋白质的纯化和分离，那么酶与载体的结合应当是可逆的。在此种情况下，优选的是，螯合 的金属离子为Ni 2+或Co2+，并且最优选Co2+。这些金属离子足够强的结合以固定聚组氨酸标 记的酶，但是当施加特定的条件时也能够释放固定化酶，诸如使用含有咪唑或乙二胺四乙 酸盐(EDTA)的缓冲溶液处理。
[0031] 为了在多相生物催化中使用固定化酶，期望酶与载体的强结合。在此种情况下，优 选的是螯合的金属离子为Co2+或Fe 3+，并且最优选Fe3+，因为这会导致聚组氨酸标记物与载 体特别强的结合。如在实例中所表明的，从包含Fe 3+作为螯合金属离子的固定化蛋白质材料 中浸出的酶或金属离子几乎可以忽略不计。不存在浸出使得固定化蛋白质材料(生物催化 剂）以催化量使用。催化量的使用在连续流反应中尤为重要。
[0032] Fe3+作为螯合金属离子的另一优点是，这种金属是无毒的。所产生的固定化蛋白质 材料由此可以安全地应用在例如食品工业中。
[0033] 用于亲和标记的蛋白质的基质通过适合的连接基附接到载体的表面。控制孔隙度 玻璃(CPG)的表面含有游离硅烷醇（Si-ΟΗ)基团，其能够通过共价键附接到连接基分子。通 常，使表面与双官能烷基硅烷连接基分子(其链长度和结构可以不同）反应，由此硅原子与 玻璃表面硅烷醇基团共价结合并且其中硅烷的末端基团是官能团，诸如醛、胺、环氧基团、 卤化物、或羧酸衍生物。应当使用的适合官能团将取决于待附接到CPG表面的基质的性质。 用于通过适合连接基将基质附接到CPG表面的方法是本领域技术人员已知的。
[0034] CPG是强健且惰性的玻璃材料，其可以被生产为尺寸控制的大孔或介孔的颗粒。 CPG的锐利的孔径分布可以在约10至300nm直径的孔径变化。这提供了有利的微环境而没有 由于空间位阻引起的复杂情况。互连的孔结构导致低的溶液流动阻力并且促进反应物和产 物在整个材料间的物质转移。CPG的刚性结构提供了坚固的、不可压缩的介质，其适合于高 通量的反应器设计和在高流速下的线性规模扩大。该材料在溶剂中显示出有限的溶胀性， 并且在大多数有机介质和pH低于10的含水环境中是化学和尺寸稳定的。
[0035]常规CPG表现出配体负载能力，其与其孔尺寸负相关。因此，较大孔径的CPG载体不 能负载与较小孔尺寸的CPG载体一样多的蛋白质。这部分地是由于孔尺寸和表面积之间的 负相关，并且部分地是由于充当官能化基团的表面可及的硅醇基团具有限定的每单位面积 的密度，约4.5μπιο 1 /m2。常规的CPG展现出非均匀的硅烷醇分布，其中空间位阻的硅醇位点 不能作为官能附着点。
[0036] 混合控制孔隙度玻璃（混合CPG或HybCPG)是CPG的变体，其中CPG的内表面和外表 面涂覆有约l〇nm的交联有机聚合物的膜，如W02009/005631中所描述的。混合CPG上的聚合 物涂层可以含有官能团，诸如醛、氨基、环氧基、卤化物、羧酸和酯、或它们的混合物，基质可 以附接至该官能团。用于将基质附接到适合的官能团的方法是本领域技术人员已知的。
[0037]相对于常规CPG，混合CPG提供了某些优点。作为聚合物涂层的结果，可以最小化负 载和孔径之间的依赖性，并且可以更精确且均匀地控制官能化位点之间的间隔。混合CPG作 为用于蛋白质固定化的载体材料可以提供额外的益处，因为可以修整聚合物涂层的设计， 从而提供给定应用期望或所需要的表面特性。例如，均相聚合物如聚苯乙烯可以产生更疏 水的载体表面，同时均相聚合物如聚丙烯腈可以产生更亲水的载体表面。通过使用两种或 更多种不同聚合物的混合物，可以获得共聚合物涂层，其中载体表面的特性特别适于给定 的应用。薄层涂层允许在有机溶剂中一定程度的微小溶胀，但是不具有混合CPG床的体积膨 胀或背压的增加。该涂层还允许混合CPG在大于pH 10的含水环境中使用。
[0038] 在整个说明书的其余部分以及所附的权利要求书中，对CPG的任何提及均被解释 为包括(常规)CPG和混合CPG两者，除非另有具体说明。
[0039] 由于诸如较高的成本效益或特定的加工要求的原因，因此可能需要除了CPG和 HybCPG之外的其他载体材料。此种材料包括多孔有机聚合物(塑料)材料。这些聚合物使用 官能团（诸如醛、氨基、环氧基、卤化物、羧酸或酯类、或它们的混合物)官能化，基质可以附 接至该官能团。用于将基质附接到适合官能团的方法是本领域技术人员已知的。官能化的 塑料可以被生产为具有有限溶胀的多孔颗粒。适合的有机聚合物可以基于单体诸如苯乙 烯、乙烯、丙烯、丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸甲酯。此种有机聚合物的实 例包括官能化聚乙烯、超高分子量聚乙烯(UHMWPE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚丙烯(PP)、聚 四氟乙烯(PTFE)和聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯和聚（甲基丙烯酸甲 酯）。在优选的实施方式中，多孔有机聚合物是官能化的聚苯乙烯或官能化的聚甲基丙烯酸 酯。
[0040] 本文描述的亲和标记的蛋白质至HybCPG的附接表明了使用多孔有机聚合物载体 的可能性，因为HybCPG中的多孔表面是有机聚合物本身。HybCPG较大地维持了CPG的不可压 缩和非溶胀的性质，同时可以利用有机聚合物的表面性能。当不需要CPG的刚性时，单独的 有机聚合物似乎是更好的选择。因此，在本文中表明了向此种材料施加亲和标记物附接的 方法。
[0041 ]如图1所概括的，CPG-固定化蛋白质材料可以由氨基-CPG或氨基-HybCPG开始，仅 以几个步骤容易地生产。例如，可以使用2,4_二羟基苯乙酮处理CPG材料，从而通过亚胺将 苯基团连接到CPG。如果需要，此后可以使用适合的还原剂，如，例如硼氢化钠、氰基硼氢化 钠或氢化铝锂，将亚胺官能团还原为相应的胺。随后，可以通过将所述材料分别悬浮在 C〇Cl2或FeCl3的含水溶液中以引入螯合金属离子，诸如Co 2+或Fe3+。干燥之后，可以将获得的 材料直接用作用于一种或多种聚组氨酸标记的蛋白质的结合基质。
[0042]以如上为CPG和HybCPG所描述的类似方式，可以产生其中载体材料为有机聚合物 的固定化蛋白质材料。
[0043]聚组氨酸标记物对金属离子如Co2+或Fe3+的高亲和力允许由含有蛋白质的粗溶液 进行聚组氨酸标记的蛋白质的固定化，而无需在固定化步骤之前对该溶液进行彻底的纯 化。不含聚组氨酸标记物的有机材料仅将微弱地结合或根本不结合螯合金属离子，并且通 过使用例如水或缓冲含水溶液洗涤将从最终固定化蛋白质材料容易地被除去。因此，如果 聚组氨酸标记的蛋白质是通过细胞内过表达来制备的，那么可以直接由细胞裂解物进行蛋 白质的固定化。可替换地，如果聚组氨酸标记的蛋白质是由宿主有机体分泌的，那么可以直 接由细胞培养上清液进行蛋白质的固定化。
[0044] 因此，在另一方面中，本发明涉及用于亲和标记的蛋白质的固定化的方法，包括以 下步骤：
[0045] i)将亲和标记的蛋白质固定在包含附接有亲和基质的载体材料的载体上，所述载 体材料选自由以下组成的组：
[0046] (a)控制孔隙度玻璃(CPG);
[0047] (b)混合控制孔隙度玻璃(混合CPG);和
[0048] (c)多孔有机聚合物；以及
[0049 ] i i)可选地用水或适合的缓冲液洗涤固定化蛋白质材料。
[0050] 在又一方面中，本发明提供了用于制备固定化蛋白质材料的方法，所述方法包括：
[0051] i)提供含有氨基的载体材料，所述载体材料选自由以下组成的组：
[0052] (a)控制孔隙度玻璃(CPG);
[0053] (b)混合控制孔隙度玻璃(混合CPG);和
[0054] (c)多孔有机聚合物；
[0055] ii)使载体材料与2,4-二羟基苯乙酮反应，从而将二羟基苯基基团连接至载体材 料；
[0056] iii)在二羟基苯基和能够结合聚组氨酸标记的蛋白质的金属离子之间形成螯合 络合物;和
[0057] iv)将聚组氨酸标记的酶结合到包含所述金属离子的载体材料。
[0058] 可选地，如上所述的用于制备固定化蛋白质材料的方法进一步包括将过渡金属纳 米颗粒结合到载体材料。
[0059] 在一个实施方式中，载体是控制孔隙度玻璃(CPG)。在另一实施方式中，载体是混 合控制孔隙度玻璃(混合CPG)。在又另一实施方式中，载体是多孔有机聚合物。
[0060] 在优选的实施方式中，该方法包括亲和标记的蛋白质在CPG或混合CPG上的固定 化。在另一优选的实施方式中，亲和标记的蛋白质是聚组氨酸标记的酶并且亲和基质含有 螯合金属离子。在更优选的实施方式中，该方法包括聚组氨酸标记的酶在CPG或混合CPG上 的固定化，其中使用的螯合金属离子是Co 2+或Fe3+。
[0061] 在另一方面中，本发明提供了通过如上所述的方法可获得的固定化蛋白质材料。 [0062] 使用标准頂AC方法可以实现结合蛋白质的解离。例如通过降低pH或通过添加对螯 合金属离子具有与聚组氨酸基团相等或更高亲和力的竞争性分子，如通过添加含有咪唑或 乙二胺四乙酸盐(EDTA)的缓冲溶液，可以将结合蛋白质从载体释放。在纯化的蛋白质从载 体解离后，如果必要，可以通过本领域已知的技术，例如通过使用适合的酶，诸如特异性蛋 白酶裂解亲和标记物将聚组氨酸标记物从蛋白质上去除，由此获得纯的无标记物的蛋白 质。
[0063] 因此，在又一方面中，本发明涉及用于纯化和分离亲和标记的蛋白质的方法，包括 以下步骤：
[0064] i)将亲和标记的蛋白质固定在包含附接有亲和基质的载体材料的载体上，所述载 体材料选自由以下组成的组：
[0065] (a)控制孔隙度玻璃(CPG);
[0066] (b)混合控制孔隙度玻璃(混合CPG);和
[0067] (c)多孔有机聚合物；
[0068] i i)可选地使用水或适合的缓冲液洗涤固定化蛋白质材料;和 [0069] iii)从亲和基质解离纯化的蛋白质。
[0070] 固定化步骤可以在适合的缓冲液中进行。如果必要，此后可以使用水或适合的缓 冲液洗涤固定化蛋白质材料，以从固定化蛋白质材料中除去任何未结合的蛋白质以及其它 不期望的化合物。从亲和基质解离纯化的蛋白质可以通过应用适合于特定亲和标记物的条 件来实现。用于解离不同亲和标记物的适合条件在本领域中是众所周知的。
[0071] 该方法可以可选地包括另外的步骤iv)从纯化的蛋白质中除去亲和标记物。
[0072]在优选的实施方式中，该方法包括纯化和分离CPG或混合CPG上的亲和标记的蛋白 质。在另一优选的实施方式中，亲和标记的蛋白质是聚组氨酸标记的酶并且亲和基质含有 螯合金属离子。在更优的实施方式中，该方法包括纯化和分离CPG或混合CPG上的聚组氨酸 标记的酶，其中所使用的螯合金属离子是Co 2+。
[0073] 如果如上所述固定在载体上的蛋白质是酶，那么它们含有能够催化化学反应的活 性位点。因此，固定化酶材料作为有机合成中的生物催化剂是潜在有用的。因此，在另一方 面，本发明涉及本文所公开的固定化酶材料作为多相生物催化剂的用途，例如，在合成有机 转化中。本发明进一步提供了用于催化酶催化的反应的方法，包括提供根据本发明的固定 化蛋白质材料，以及使所述固定化蛋白质材料与至少一种底物接触，固定在载体上的酶能 够对该底物起作用。
[0074] 如本文所公开的，酶通过亲和标记物结合而固定在载体上改善了所使用的酶的稳 定性。已经发现，固定化酶耐受含水条件以及各种不同的有机溶剂。这使得固定化酶材料能 够在游离非固定化酶本来不稳定的反应条件中使用。可能的是，固定化酶材料还可以在比 游离非固定化酶所耐受的pH范围更宽的pH范围内使用。
[0075] 当从粗(未纯化的）配制品中结合酶时，所产生的固定化蛋白质材料由富集化的酶 组成。由于保留了酶方法的天然活性，因此固定化制剂表现出比初始非固定化蛋白质材料 更高的每蛋白质量的催化活性。
[0076] 本发明的另一个优点是可以容易地回收固定化酶材料。由于固定化酶材料是多相 催化剂，因此可以通过过滤简单地从反应混合物中收集该材料。此后，如果在纯化材料之后 必要，可以在另外的反应中再利用该材料。特别是对于昂贵和/或难以培养的酶，回收固定 化酶材料的可能性是重要的方面。
[0077] 固定在载体上的酶可以是在有机合成转化中作为生物催化剂有用的任何酶，包括 但不限于充当氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶的酶。因此，固定化酶 材料可以在任何有机反应中被用作多相生物催化剂，其中固定化酶能够特异地催化反应。 此种生物催化反应的例子包括但不限于酶促氧化和还原反应、酶促水解反应和酶促异构化 反应。特别有用的生物催化反应是对映选择性反应。生物催化反应的具体例子包括使用脂 肪酶选择性酰化醇或胺、使用ω -转氨酶的转氨基作用、使用CYP P450或拜尔-维利格 (Baeyer-Villiger)单加氧酶的单加氧、使用醇脱氢酶氧化醇或还原酮/醛、以及使用单胺 氧化酶氧化胺。
[0078] 在一个实施方式中，可以将两种或更多种不同的酶固定到载体上，其中不同的酶 中的每种能够催化不同的反应。那么在多步或级联反应中可以使用含有两种或更多种不同 固定化酶的材料作为多相生物催化剂。例如，此种级联反应可以是其中两种或更多种酶催 化的反应以两个或更多个后续步骤在底物上进行的反应，（即其中将第一酶的底物转化成 第二酶的底物等等的反应），诸如，通过ω -转氨酶的氨基转移反应随后为通过脂肪酶的酰 化反应。可替换地，此种级联反应可以是其中通过第一酶转化底物并且其中由第二酶再生 用于第一酶的辅因子的反应，诸如通过醇脱氢酶选择性/特异性还原酮/醛，同时伴随通过 甲酸脱氢酶再生消耗的NADH。
[0079] 当两种或更多种不同的酶被固定在载体上时，如果不同的酶含有相同的亲和标记 物，如聚组氨酸标记物时是方便的。由于每种酶对于螯合金属离子的结合亲和力是相等的， 因此不同的酶将同样强地结合到载体。因此，理论上，当使用等量的具有相同亲和标记物的 η种不同酶时，载体上每种不同酶的量将为1/η(不考虑任何扩散效应）。
[0080] 对于使用具有两种或更多种不同固定化酶的固定化蛋白质材料，并且其中不同的 酶显示出催化活性的差异的级联反应，与具有较高催化活性的酶的量相比，固定更大量的 具有较低催化活性的酶可能是有利的。这将加速决定速率的步骤，并且提高反应级联的总 速率。
[0081] 可替换地，可以通过以所需的比率混合一种或多种不同的固定化酶材料来进行级 联反应。
[0082] 在另一方面，本发明提供了用于催化酶催化的多步或级联反应的方法。在此方面 中，该方法包括提供固定化蛋白质材料，该固定化蛋白质材料包含根据本发明的两种或更 多种固定化酶，以及使所述固定化蛋白质材料与至少一种底物接触，固定在载体上的酶能 够对该至少一种底物起作用。
[0083]在另一个实施方式中，固定化酶材料另外包含金属纳米颗粒，诸如过渡金属的纳 米颗粒，例如但不限于钴、镍或钯。包含金属纳米颗粒的材料可以例如通过将氨基-CPG或氨 基-HybCPG浸泡于适合量的金属盐(如(：〇(：1 2、附(：12、1^屮(1(：14、？(1(：12或?(1〇?4)2)在乙腈或水 或它们的混合物中的溶液中来制备。此后，通过添加过量的适当的还原剂如氢化钠、硼氢化 钠、氰基硼氢化钠、氢化铝锂等，将金属离子还原为金属纳米颗粒。在添加2，4-二羟基-苯乙 酮时，初始形成的亚胺被立即还原为相应的胺。在通过洗涤去除还原剂之后，然后通过将材 料分别悬浮于C 〇Cl2、FeCl3或NiCl2的含水溶液中，将金属离子诸如Co 2+、Fe3+或Ni2+螯合在基 质上。干燥之后，所获得的材料可以被直接用作用于一种或多种聚组氨酸标记的酶的基质； 参见图2。
[0084]尽管不希望受到理论的限制，但据信金属纳米颗粒通过CPG材料上的氨基结合到 CPG材料上。还可以想的是，通过金属离子的还原形成的金属纳米颗粒的尺寸足够大以陷入 CPG材料的孔中。
[0085] 含有固定化酶和金属纳米颗粒二者的固定化蛋白质材料可以在组合的酶催化反 应和过渡金属催化反应中用作多相生物催化剂。此种反应的例子包括但不限于动态动力学 拆分反应。此种反应的具体例子是如所附实施例所示的，通过由Pd纳米颗粒将胺外消旋化， 之后使用脂肪酶酰化的胺的动态动力学拆分。
[0086] 因此，在又一方面中，本发明提供了用于催化组合的酶催化和和过渡金属催化的 反应的方法。在此方面中，该方法包括提供根据本发明的另外包含过渡金属纳米颗粒的固 定化蛋白质材料，和使所述固定化蛋白质材料与至少一种底物接触，固定在载体上的酶和 过渡金属能够对该至少一种底物起作用。
[0087] 本文公开的固定化蛋白质材料的实例及此种材料的用途在实验部分进行了描述。
[0088]
[0089] 亲和标记物"是指附接到重组蛋白并且能够结合到固定在基质上的特定基 团的定义基团，诸如有机或有机金属分子、蛋白质片段或其他。亲和标记物的实例是聚组氨 酸标记物、谷胱甘肽S-转移酶(GST)标记物、几丁质结合蛋白（CBP)标记物、麦芽糖结合蛋白 (MBP)标记物、FLAG-标记物、亲和素蛋白标记物或链亲和素标记物。亲和标记物也可以被称 为融合标记物。
[0090]如本文中所使用的，术语"亲和标记的蛋白质"是指其中如上所定义的亲和标记物 已经被添加到靶蛋白质的重组蛋白。亲和标记的蛋白质可以通过重组DNA技术使用本领域 中已知的方法，如通过DNA片段的接合或通过PCR技术来制备。亲和标记的蛋白质也可以称 为"融合标记物蛋白质"或"融合蛋白质"。
[0091] 术语"聚组氨酸标记物"是指附接到蛋白质的C-末端或N-末端的至少两个组氨酸 残基的链。聚组氨酸标记物优选地为至少六个组氨酸残基的链。用于聚组氨酸标记物的其 它常用名称为polyHis标记物、组氨酸标记物、六组氨酸-标记物、6xHis-标记物和His 6标记 物、以及His-tag?。
[0092] 术语"聚组氨酸标记的酶"是指其中靶酶与以上定义的聚组氨酸标记物融合的重 组酶。
[0093]如本文中所使用的，术语"氨基-CPG"是指通过适合的连接基使用氨基官能化的 CPG材料。如本文中所使用的术语"氨基-HybCPG"是指混合CPG材料，其中聚合物涂层含有氨 基。
[0094] 借助下列实施例进一步阐明本发明，但这些实施例在任何方面均不限制本发明。 所有引用的文献和参考资料均通过引证并入本文。
[0095]
[0096] aw水活度
[0097] AlaDH来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的丙氨酸脱氢酶
[0098] CalA南极念珠菌脂肪酶A(也被称为南极假丝酵母(Pseudozyma antarctica)脂 肪酶A)
[0099] CalB南极念珠菌脂肪酶B(也称为南极假丝酵母脂肪酶B)
[0100] DCM 二氯甲烷
[0101 ] 2,5_01(0\10来自恶臭假单胞菌(？8611(1〇1]1〇仙8口111:1(^)的2,5-二酮莰烧单加氧酶
[0102] equiv.当量
[0103] EtOAc乙酸乙酯 [0104] FMN黄素单核苷酸
[0105] FRE来自大肠杆菌的黄素还原酶
[0106] GC气相色谱
[0107] HEPES 4-(2-轻乙基）哌嗪-1-乙磺酸 [0108] IPTG异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
[0109] min 分钟
[0110] MOPS 3-(N-吗啉代)丙磺酸
[0111] MTBE甲基叔丁基醚(或叔丁基甲基醚）
[0112] NADH烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原形式）
[0113] PLP吡哆醛5-磷酸酯
[0114] SDS-PAGE十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0115] Tris三(羟甲基)氨基甲烷
[0116] ω-TA 来自紫色色杆菌（Chrimobacterium violaceum)的 ω -转氨酶
[0117] 实验方法
[0118] CPG材料获自Prime Synthesis，Inc.，（Aston，PA，USA)。在实施例中使用了下列控 制孔隙度玻璃材料：
[0119] · LCAA CPG是使用长链烷基胺衍生化的CPG(CPG-0502-N12)。
[0120] ?共聚-HybCPG-胺(在下文中也被称为"HybCPG copo"）是涂覆有由1:1的丙烯腈： 乙烯基苄基氯形成的共聚物并且原位交联的混合CPG。
[0121] · VBC HybCPG-胺(在下文中也被称为"HybCPG VBC"）是涂覆有由乙烯基苄基氯单 体形成的聚合物并且原位交联的混合CPG。
[0122] 如在W0 2009/005631中所描述的，涂层的（共)聚合物使用双官能胺交联。此后，通 过与邻苯二甲酰亚胺钠反应，随后使用肼进行脱邻苯二甲酰化来将氨基引入到氯聚合物涂 层上。
[0123] 在实施例中使用了下列多孔有机聚合物：
[0124] ?"中溶胀聚苯乙烯"（购自3-Prime LLC，USA;件号04-02-03-32)，氨基官能化的 聚苯乙稀载体。孔径~1000 A(非常宽的分布），粒径lOOwn，胺负载222ymol/g。
[0125] ?"低溶胀甲基丙稀酸酯共聚物"（购自SPRIN Technologies S.p.A.，意大利;件 号1A02BN)，氨基官能化的甲基丙烯酸酯载体。孔径未知，粒径100-300μπι，胺负载270μπι〇1/
[0126] 如Cassimjee等(ACS Catal.2011，第1卷，第1051-1055页）中的描述，进行来自紫 色色杆菌的过表达的ω-转氨酶的培养。如_S:andst_ri3m等(Protein Eng Des Sel.2009,第 22卷，第413-420页）中的描述，进行过表达的南极念珠菌脂肪酶A的培养。如Engstr&n等 (Org. Biomol. Chem. 2011，第9卷，第81-82页）中的描述，进行过表达的南极念珠菌脂肪酶B 和CalB Trpl04Ala(脂肪酶B的不稳定的变体）的培养。如Kadow等(AMB Express 2011，1: 13)中的描述，进行来自恶臭假单胞菌的过表达的2,5_二酮莰烷单加氧酶的培养。如Kadow 等(厶口口1.]\1;[(31'013；[01.13;[(^6(3111101.2013,2013年11月5日网上发表）中的描述，进行来自大肠 杆的过表达的黄素还原酶的培养。如Mutti等(EurJ.0rg.Chem.2012,第5期，第1003-1007 页）中的描述，进行来自枯草芽孢杆菌的过表达的丙氨酸脱氢酶的培养。当不存在时，通过 ?0?向基因中添加1^86 -标记物。根据1^丨1§31^0丨11等(0坪.13;[01]1〇1.〇16111.2011，第9卷，第81-82 页）中描述的程序，将聚组氨酸标记的CalA和CalB固定在Accurel上。
[0127] 实施例
[0128] 实施例1
[0129] 用于固定和纯化聚组氨酸标记的酶的螯合CPG载体的制备
[0130] 在甲醇(200mL)中，使用2,4-二羟基苯乙酮(为0?6的氨基官能度的1.5叫11".）将 所需类型的氨基_CPG(5g)持续搅拌处理60min。使用连接搅拌，通过依次加入硼氢化钠 (4equiv.)将所形成的亚胺还原60min。过滤固体材料，使用饱和碳酸钠水溶液、水并且然后 乙醇冲洗，然后在80°C下干燥2小时。然后将颗粒浸泡在C 〇Cl2的饱和水溶液（100mL)中。在 过滤以及使用水和乙醇冲洗之后，在80°C下将颗粒干燥2小时。表1中示出了不同螯合CPG材 料的性能。
[0131]
[0132] 类似于上述程序制备含有Fe3+作为螯合金属离子的载体，但是使用FeCl3的水溶液 代替C0CI2。
[0133] 实施例2
[0134] 用于固定和纯化聚组氨酸标记的酶的螯合多孔聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯载体 的制备
[0135] 在甲醇（50mL)中，使用2,4_二羟基苯乙酮(为塑料的氨基官能度的1.5equiv.)将 洗涤(水/乙醇l:l，400mL)且干燥的(过滤后真空16h)期望类型（见下）的氨基官能化的多孔 有机聚合物颗粒(2g)持续搅拌处理60min。用持续搅拌，通过依次添加硼氢化钠(4equi V.) 将所形成的亚胺还原60min。过滤固体材料，使用饱和碳酸钠水溶液、水并且然后乙醇冲洗， 然后在真空中在25°C下干燥16小时。
[0136] 然后将所述颗粒浸泡于CoCl2的饱和水溶液（100mL)中。过滤并且使用水及乙醇冲 洗后，在真空中在25°C下将颗粒干燥16小时。表2中示出了不同螯合多孔塑料载体的性能。
[0137]
[0138] 实施例3
[0139] 聚组氨酸标记的酶在螯合载体上的固定化
[0140] 使用未经缓冲的含有CalA或CalB的细胞培养上清液。通过在HEPES缓冲液(50mM， 500mM NaCl，pH 8.3)中的细胞再悬浮制备ω -ΤΑ的细胞裂解液。在添加清洁剂(BugBuster? 10X，N〇vagen)之后，通过离心去除细胞碎片。将螯合CPG载体浸泡于裂解液或上清液中，随 后在轨道摇床（150rpm)上搅拌。在固定化过程中Bradf ord分析的溶液的样品确认，随着蛋 白质浓度停止下降，螯合CPG载体的结合及饱和完成。还在通过过滤除去CPG载体之后用溶 液进行了活性试验。然后，使用缓冲液(对于CalA和Ca 1B是MOPS(50mM，pH 7.4);对于ω -TA 是HEPES(如上））冲洗固定化的制剂，并且在真空下干燥16小时。
[0141 ] 通过将颗粒浸泡于洗脱缓冲液(50mM磷酸钠，500mM咪唑，pH 7.5)中并且在轨道摇 床上温育20min来进行从CPG载体提取固定化酶。通过SDS-PAGE可视化所提取的酶的存在及 纯度;仅对应于His6-标记的酶的带是可见的。
[0142] 如先前所描述的（Cassimjee等，ACS Catal.2011，第1卷，第1051-1055页），进行溶 剂中的ω -TA的活性位点定量。通过将ω -ΤΑ-CPG添加到1-苯乙胺（lmM，lmL，MTBE aw=0.6， ImM十五烧）中，进行溶剂中的固定化ω -ΤΑ的活性位点定量。在轨道摇床上搅拌反应混合物 (150印111，2411，22°(：)。通过盐水合物对(似2即〇4,2!1 20/7!120)设定溶剂的水活度，但是在添加 ω-ΤΑ-CPG后或在反应过程中不控制。通过GC(200yL样品至Et0Ac，3滴乙酸酐和三乙胺，在 22 °C温育8h)以十五烷作为内标测量转化。
[0143] 通过将ω-ΤΑ-CPG添加到1-苯乙胺（lmM，lmL，50mM HEPES，pH 7.0)中测量缓冲液 中的固定化ω -TA的活性位点定量。在轨道摇床（150rpm，24h，22 °C)上搅拌反应混合物。使 用NaOH水溶液（1%)处理样品（400yL)，使用DCM萃取并且在添加十五烷（lmM，EtOAc)后通过 GC分析。在所有情况下，将转化与使用螯合CPG的空白反应(没有结合的酶)进行比较。
[0144] 固定化的产率(即，从裂解液中除去的活性酶的量相对于洗涤后保留在CPG上的活 性酶的量)基于活性位点定量为高于99%。结果示于表3中。
[0145]
[0146] 如上文对CPG载体所描述的，进行聚组氨酸标记的酶(CalA和CalB)在螯合多孔聚 苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯载体上的固定化。
[0147] 实施例4
[0148] ω-ΤΑ-CPG作为催化剂的用途
[0149] 将实施例3中制备的ω-ΤΑ-CPG在苯氧基-2-丙酮的对映体定向氨基转移中用作催 化剂：
[0150]
[0151] 将20mg ω -TA-CPG加入到3mL具有100mM外消旋1-苯乙胺和50mM 2-苯氧基丙酮的 MTBE (aw = 0.6)溶液中，并且使用轨道摇动（150rpm)在50 °C下温育反应混合物。将十五烷 (50mM)用作内标。在记录的时间点采集样品（50yL)后，通过手性气相色谱来跟踪1-苯乙胺 的转化和对映体过量;如上所述，使用乙酸酐和三乙胺将样品衍生化。在没有衍生化的情况 下测量1-苯氧基丙-2-胺的形成。结果示于表4中。
[0152]
[0153] 实施例5
[0154] 固定化的CalA和CalB作为催化剂的用途
[0155] 将实施例3中制备的CalA-CPG、CalB_CPG、CalB-聚苯乙烯和CalB-聚甲基丙烯酸酯 在1-苯基乙醇对映选择性酰化(动力学拆分）中用作催化剂：
[0157] 通过将固定化酶(20mg)加入到3mL具有10mM 1-苯基乙醇和100mM 丁酸乙稀酯的甲 苯溶液(aw=0.1)中进行脂肪酶催化的动力学拆分反应，并且使用轨道摇动(200rpm)在22 °C (对于CalA和CalB)或50°C (对于CalB Trpl04Ala)下温育混合物。将十五烷(5mM)用作内 标。通过在记录的时间点采集样品（50yL)，通过手性GC测量1-苯基乙醇和丁酸1-苯乙酯的 转化率和对映体过量。
[0158] 包括下列反应以进行比较：
[0159] -CalB固定在AccureP (多孔聚丙烯粉末)上。
[0160] -CalB以未修饰形式（即没有根据实施例1处理）固定在氨基-HybCPG copo上。
[0161] 通过将多孔材料以与酶的量（由Bradford法测量蛋白质含量)50:1的比率加入到 浓缩的上清液中，随后温育至少八小时来进行Ca 1B (和Ca 1B Trp 104A1 a)在乙醇活化的 Ax'curel.? (Accurel MP1001，粒径<1000ym，Membrana GmbH，Wuppertal，Germany)的固定 化。结果不于表5中。
[0164] 实施例6
[0165] 具有三种不同酶的级联_CPG( "BV-级联-CPG"）的制备
[0166] 通过在磷酸钠缓冲液（5〇11^，50〇11^此(：1，？!17.5)中的细胞再悬浮以及添加 BugBusterTMlOX制备2,5-DKCM0、FRE和AlaDH的细胞裂解液。离心并且除去细胞碎片之后， 将螯合Co 2+CPG载体浸泡于等体积的三种细胞裂解液的混合物中，随后在轨道摇床(150rpm) 上搅拌。在固定化过程中Bradford分析的溶液样品确认，随着蛋白质浓度停止下降，CPG载 体的结合及饱和完成。还使用通过过滤除去CPG之后的溶液进行了活性试验。然后，使用磷 酸钠缓冲液(参见上文)冲洗固定化制剂，然后在真空下干燥16小时。
[0167] 实施例7
[0168] 使用BV-级联-CPG作为催化剂的酶促级联反应
[0169]将实施例6中制备的级联-CPG在( + )-樟脑的拜尔维利格(Baeyer-Villiger)氧化 中用作催化剂：
[0171] 将65mg BV-级联-CPG加入到总液体体积为5.0mL的具有2.0mM( + )_樟脑、5.0mM L-丙氨酸、〇.3禮？丽和0.51111祖0!1的磷酸盐缓冲液（10〇1111，？!17.5)的反应混合物中。然后溶 解氧（鼓泡30s)，随后将容器密封；在轨道摇床（150rpm)上在22°C下温育混合物。将样品 (500yL)萃取到EtOAc，以苯甲酸乙酯作为内标并且通过GC分析。3小时后测量转化率。24小 时后加入氧，并且使反应继续进行额外的3小时，之后再次测量转化率(27小时）。
[0172] 还用游离(未固定化的）2,5_DKCM0、FRE和AlaDH(来自细胞裂解液)进行比较反应。 未测量酶的比例和量。结果示于表6中。
[0173]
[0174] 通过将l.Og BV-级联-CPG加入到总液体体积为5.0mL的具有160mM L-丙氨酸、 0.3禮？丽和0.511^祖0!1的磷酸盐缓冲液（10011^，？!17.5)反应混合物中，进行多相反应。然 后，加入5mL具有( + )-樟脑（100mM)的环己烷作为第二液相。在轨道摇床（lOOrpm)在22°C下 搅拌密封的容器，伴随向水相中持续添加氧。在记录的时间点从有机相中采集样品（50μυ 并在添加作为内标的苯甲酸乙酯（2.0mM在EtOAc中）之后通过GC分析。在使用Et0Ac(20mL) 萃取全部组分之后，测量72小时后的转化率。
[0175] 还使用游离（未固定化的）2，5-DKCM0、FRE和AlaDH(来自细胞裂解液)进行了比较 反应。未测量酶的比例和量。结果示于表7中。
[0176]
[0177] 实施例8
[0178] 具有CalB和Pd-纳米粒子的级联_CPG( "Pd-CalB-CPG"）的制备
[0179] 将氨基_CPG(5g)浸泡于Pd(TFA)2(相对于CPG的氨基官能度为0.5equiv.)的水溶 液(200mL)中，并且将混合物持续搅拌lOmin。然后加入NaBH 4(7equiV.)，并且将混合物搅拌 额外的3〇111；[11。然后加入2,4-二羟基苯乙酮(0.56911；^.)，之后将混合物搅拌30111；[11。过滤固 体物质，并用水彻底清洗，然后浸泡于C0CI2的饱和水溶液（100mL)中。过滤并且用水洗涤之 后，将固体材料浸泡于聚组氨酸标记的CalB溶液(纯化的或来自上清液）中并且搅拌30min。 然后过滤固定化制剂，用缓冲液(20mM MOPS，pH 7.4)冲洗，此后在真空下干燥16小时。
[0180] 实施例9
[0181] 使用Pd-CalB-CPG的级联反应
[0182] 将实施例8中制备的材料在1-苯乙胺的对映选择性酰化(动态动力学拆分）中用作 催化剂：
[0184] 将100mg Pd-CalB-CPG浸泡于1 .OmL含有20mM外消旋1-苯乙胺和100mM丁酸异丙酯 的甲苯溶液中。加入lmg NaBH4并且将反应小泡密封。使用在轨道摇床（100-800rpm)上的持 续搅拌将体系在65°C下温育24至48小时。通过在记录的时间点采集样品由手性GC测量底物 和产物(例如(R) -N- (1 -苯基乙基)丁酰胺））的转化和对映体过量。
[0185] 通过相分离获得产物，使用IN HC1振摇有机相（三次）以除去残留的酰基供体和 胺，然后使用EtOAc反萃取洗涤相。在真空下蒸发合并的有机相以获得产物，通过快速层析 进一步纯化。
[0186] 实施例10
[0187] A.金属离子浸出的确定
[0188] 为了确定在给定条件下从载体浸出的金属离子的量，使基于CPG和HybCPG并且含 有Co2+或Fe3+的载体经受在含水缓冲液中的延长的温育。
[0189] 在室温下在振动台上，使结合有Co2+或Fe3+的LCAA CPG、HybCPG VBC和HybCPG copo各250mg在3mL含水缓冲液(HEPES 20mM，pH7.0)中温育72小时。
[0190] 通过混合一份温育的溶液与一份NH4SCN-溶液（1.0M)、一份HC1-溶液(6.0M)和两 份丙酮，测量Co 2+的量。这一程序显示出与Co2+的浓度呈比例的蓝色，将其通过分光光度法 在620nm下定量。还测试了仅具有缓冲液的空白样品。
[0191] 通过混合一份温育的溶液与一份NH4SCN-溶液（1.0M)和一份HC1-溶液(6.0M)，测 量Fe 3+的量。这一程序显示出与Fe3+的浓度呈比例的红色，通过分光光度计在480nm下进行 定量。还测试了仅具有缓冲液的空白样品。
[0192] 在从温育的载体材料中除去一半溶液（1.5mL)之后，加入1.5mL的6.0M HC1-溶液， 并且在摇床上将材料温育1小时;这一程序有效地脱附所有结合的金属离子。然后，将一份 这种温育的溶液与一份HC1-溶液(3M)和一份NH4SCN-溶液(1.0M)混合。向待定量Co 2+的样品 中，还加入两份丙酮。记录在620nm下的吸光度（用于Co2+的量化)和480nm下的吸光度（用于 Fe3+的量化）。基于吸光度测量值，对在两个不同温育(首次在pH 7.0,然后在3.0M HC1中）下 的测试体积计算对应于金属离子总量的值，并且对去除的体积(在首次温育后的1.5mL)进 行校正。由此可以量化在pH 7.0下浸出的金属离子的分数。结果示于下表8中。
[0193]
[0194] 可以看出，结合到CPG和HybCPG载体材料的Fe3+比Co2+更不容易浸出。
[0195] B.酶浸出的确定
[0196] 为了确定在给定条件下从载体离解的酶的量，使ω-ΤΑ在CPG或HybCPG上的固定化 制剂在含水缓冲液中经受延长的温育。
[0197] 在轨道摇床上，将其中酶由Co2+或Fe3+结合的ω -TA-LCAA CPG、ω -ΤΑ-HybCPG VBC 和 ω-ΤΑ-HybCPG copo各 12~16mg在4mL含水缓冲液(HEPES 100mM，pH 7.0)中温育lmin。在 此刻之后，未在溶液中检测到酶。这是通过活性试验来测量的，其中在沉降固定化材料之 后，使用lmL溶液。在轨道摇床上将剩余的3mL制剂温育24小时，之后，所述制剂的一些展现 出在溶液中可测量量的酶。
[0198] 通过采集lmL溶液，加入lmL试验混合物（1 -苯乙胺（1 OmM)、丙酮酸钠(5mM)和PLP(1 μΜ)，溶解在相同的缓冲液中），并且在245nm下测量随时间推移的吸光度变化5min来进行活 性试验。还测试了具有纯缓冲液的空白反应。在该波长下，所形成的苯乙酮(来自氨基转移 反应的产物）可以监测为增加的吸光度，其中消光系数为12miT 1 cnT1 ( Schatzle等， Anal · Chem · 2009，第81卷，第8244-8248页）。由于动力学常数是已知的（Cassimjee等， 0rg.Biomol.Chem.2012,第10卷，第5466-5470页），因此可以计算浸出的酶的量。在浸出实 验之前，通过活性位点定量来测量固定化制剂中结合酶的量。对于每种材料24小时后浸出 的量示于表9中。
[0199]
[0200]该数值表明，在测试条件下，Fe3+作为螯合金属离子导致了更少的酶浸出。以Co2+ 或Fe3+作为螯合金属离子，在选定条件下HybCPG copo作为载体没有导致任何可检测的酶浸 出。具有玻璃表面的LCAA CPG给出了最高量的酶浸出。这可能是酶非特异性结合到玻璃表 面的结果。
[0201] 实施例11
[0202] 具有HybCPG C〇p〇(C〇2+)的聚组氨酸标记的ω-ΤΑ的纯化
[0203] 通过使用BugBuster?，从添加有50yg/mL卡那霉素的100mL Luria-Bertani培养基 中的ω-ΤΑ的制粒的IPTG诱导的24小时培养物制备细胞裂解液（5.0mL)。加入过量的辅酶 (PLP)并且在37 °C下将溶液温育1小时。然后，通过使用PD 10柱（两轮），将缓冲液改变为 HEPES缓冲液(50mM，500mM NaCl，pH 8.2(缓冲液1))，除去过量的PLP(未被酶结合），这得到 7. OmL含有祀全酶、天然蛋白质和其他杂质的溶液。
[0204] 在柱中装入204mg含有26ymol/g Co2+的HybCPG copo(Co2+)。通过添加7.0mL缓冲 液1预湿润该材料，并且丢弃流过液。
[0205] 以395_，￡ = 8.1111]?-1〇11-1分光光度测量活性全酶(〇388丨111]_66等4〇5〇3七31.2011， 第1卷，第1051-1055页）。在吸光度测量后，将裂解液加入到柱中，并且收集流过液。在通过 柱之前和之后，在这一波长下测量的裂解液的吸光度差为0.62(所有的测量均使用1.0cm光 程长度进行）。这对应于29mg当前结合到柱中HybCPG copo (Co2+)载体的酶。
[0206] 然后，使用7.OmL缓冲液1洗涤柱。收集流过液，以缓冲液1作为空白，该流过液的吸 光度测量为0.11。这对应于5mg从柱上洗下的酶，假设是由于非特异性结合或未结合的酶， 在柱中留下24mg结合酶。
[0207] 通过施加5.0mL Tris缓冲液(50mM，500mM咪唑，pH 7.5(缓冲液2))，进行柱中结合 酶的解离。收集流过液并且再次添加过量的辅酶。如上所述，通过使用PD10柱，将缓冲液改 变为缓冲液1除去过量的PLP，得到总体积为7.0ml含有溶解全酶的溶液。所测量的吸光度为 0.465。这对应于22mg的纯化酶，或92%的产率。溶液看起来显著地清除了污染宿主细胞蛋 白质，这还得到了 SDS-PAGE的确认。
【主权项】
1. 一种固定化蛋白质材料，包含载体和固定在所述载体上的至少一种蛋白质，其中所 述载体包含附接有亲和基质的载体材料，所述载体材料选自由以下组成的组： (a) 控制孔隙度玻璃(CPG); (b) 混合控制孔隙度玻璃(混合CPG);和 (c) 多孔有机聚合物； 并且其中，所述至少一种蛋白质含有亲和标记物并且通过至所述亲和基质的特异性亲 和结合被固定在所述载体上。2. 根据权利要求1所述的固定化蛋白质材料，其中，所述载体材料是控制孔隙度玻璃 (CPG)或混合控制孔隙度玻璃(混合CPG)。3. 根据权利要求1或2所述的固定化蛋白质材料，其中，所述载体材料是控制孔隙度玻 璃(CPG)〇4. 根据权利要求1或2所述的固定化蛋白质材料，其中，所述载体材料是混合控制孔隙 度玻璃(混合CPG)。5. 根据权利要求1所述的固定化蛋白质材料，其中，所述载体材料是多孔有机聚合物。6. 根据权利要求5所述的固定化蛋白质材料，其中，所述多孔有机聚合物选自由官能化 聚苯乙烯和官能化聚甲基丙烯酸酯组成的组。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的固定化蛋白质材料，其中，所述亲和标记物是聚 组氨酸标记物并且其中所述亲和基质含有螯合的金属离子。8. 根据权利要求7所述的固定化蛋白质材料，其中，所述螯合的金属离子是Co2+。9. 根据权利要求7所述的固定化蛋白质材料，其中，所述螯合的金属离子是Fe3+。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的固定化蛋白质材料，其中，所述至少一种蛋白质 是酶。11. 根据权利要求10所述的固定化蛋白质材料，包含两种或更多种固定化酶。12. 根据权利要求10或11所述的固定化蛋白质材料，另外包含金属纳米颗粒。13. 根据权利要求12所述的固定化蛋白质材料，其中，所述金属纳米颗粒是过渡金属纳 米颗粒。14. 根据权利要求12或13所述的固定化蛋白质材料，其中，所述金属纳米颗粒选自由 钴、镍和钯纳米颗粒组成的组。15. -种用于蛋白质的固定化的载体，包含附接有亲和基质的载体材料，所述载体材料 选自由以下组成的组： (a) 控制孔隙度玻璃(CPG); (b) 混合控制孔隙度玻璃(混合CPG);和 (c) 多孔有机聚合物； 并且其中，所述蛋白质通过至所述亲和基质的特异性亲和结合被固定在所述载体上。16. 根据权利要求15所述的载体，其中，所述载体材料是控制孔隙度玻璃(CPG)。17. 根据权利要求15所述的载体，其中，所述载体材料是混合控制孔隙度玻璃（混合 CPG)〇18. 根据权利要求15所述的载体，其中，所述载体材料是多孔有机聚合物。19. 根据权利要求18所述的载体，其中，所述多孔有机聚合物选自由官能化聚苯乙烯和 官能化聚甲基丙烯酸酯组成的组。20. 根据权利要求15至19中任一项所述的载体，其中，所述亲和基质含有螯合的金属离 子。21. 根据权利要求20所述的载体，其中，所述螯合的金属离子是Co2+。22. 根据权利要求20所述的载体，其中，所述螯合的金属离子是Fe3+。23. -种用于制备固定化蛋白质材料的方法，所述方法包括： i) 提供含有氨基的载体材料，所述载体材料选自由以下组成的组： (a) 控制孔隙度玻璃(CPG); (b) 混合控制孔隙度玻璃(混合CPG);和 (c) 多孔有机聚合物； ii) 使所述载体材料与2,4_二羟基苯乙酮反应，从而将二羟基苯基基团连接至所述载 体材料； iii) 在所述二羟基苯基基团与能够结合聚组氨酸标记的蛋白质的金属离子之间形成 螯合络合物;和 iv) 将聚组氨酸标记的酶结合到包含所述金属离子的载体材料。24. -种通过根据权利要求23所述的方法可获得的固定化蛋白质材料。25. 根据权利要求23所述的方法，另外包括将过渡金属纳米颗粒结合到所述载体材料。26. -种通过根据权利要求25所述的方法可获得的固定化蛋白质材料。27. 根据权利要求10至14、24和26中任一项所述的固定化蛋白质材料作为多相催化剂 的用途。28. 根据权利要求11至14、24和26中任一项所述的固定化蛋白质材料在多步或级联反 应中作为多相催化剂的用途。29. -种用于催化酶催化的反应的方法，包括提供根据权利要求10至14、24和26中任一 项所述的固定化蛋白质材料，和使所述固定化蛋白质材料与至少一种底物接触，固定在所 述载体材料上的酶能够对所述至少一种底物起作用。30. -种用于催化酶催化的多步或级联反应的方法，包括提供根据权利要求11至14、24 和26中任一项所述的固定化蛋白质材料，和使所述固定化蛋白质材料与至少一种底物接 触，固定在所述载体材料上的酶能够对所述至少一种底物起作用。31. -种用于催化组合的酶催化和过渡金属催化的反应的方法，包括提供根据权利要 求12至14和26中任一项所述的固定化蛋白质材料，以及使所述固定化蛋白质材料与至少一 种底物接触，固定在所述载体材料上的酶和过渡金属能够对所述至少一种底物起作用。32. -种用于纯化和分离亲和标记的蛋白质的方法，包括以下步骤： i)将亲和标记的蛋白质固定在载体上，所述载体包含附接有亲和基质的载体材料，所 述载体材料选自由以下组成的组： (a) 控制孔隙度玻璃(CPG); (b) 混合控制孔隙度玻璃(混合CPG);和 (c) 多孔有机聚合物； i i)可选地使用水或适合的缓冲液洗涤固定化蛋白质材料;和 iii)从所述亲和基质解离纯化的蛋白质。33.根据权利要求32所述的方法，另外包括步骤iv)从所述纯化的蛋白质除去亲和标记 物。
【文档编号】C12N11/14GK105940104SQ201580005764
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2015年1月30日
【发明人】卡里姆·恩格尔马克·卡西姆吉, 扬-埃尔林·贝克瓦尔
【申请人】恩制因塞米公司