一种用于检测水中肠球菌的酶底物培养基及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测水中肠球菌的酶底物培养基及其应用，所述的酶底物培养基中含有以下物质：蛋白胨、牛肉膏粉、酵母浸膏粉，氯化钠、二水合柠檬酸三钠、磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，去氧胆酸钠、庆大霉素，多粘菌素B以及对硝基苯基?β?D?葡萄糖苷。本发明的培养基根据需要可制成液体培养基、固体培养基或干粉培养基。取未经处理过的水样置于有盖无菌容器中，加入本发明所述的酶底物培养基，混摇均匀，盖紧容器，置于41℃±1℃培养箱中培养24h，然后观察容器中水样颜色变化，如果呈现黄绿色，即为肠球菌阳性。本发明的提出为肠球菌的检测提供了一种操作简便、结果易判断、无需确认实验的检测手段，以便于对水体进行检测。
【专利说明】
一种用于检测水中肠球菌的酶底物培养基及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种检测水中肠球菌的培养介质与应用。本发明属于环境微生物检测 领域。
【背景技术】
[0002] 水中污染物可分为化学性、物理性与生物性等三类。本发明主要涉及检测水中微 生物的方法。水体中如含致病性微生物，可危害健康与生命。经水传播的最常见致病微生物 为伤寒与副伤寒、志贺氏菌病、霍乱、弯曲杆菌病、传染性肝炎及阿米巴痢疾等等。这些细 菌、病毒及原虫见于传染源的粪便或尿中，当排泄后，可能进入水体，如果该水体最终作为 饮水之来源，则可能导致疾病发生。水源水、生活饮用水微生物污染是我国最大的健康危害 问题之一，特别是在欠发达地区，经水传染病仍是危害健康的重要疾病。饮用水微生物污染 是我国供水工作中的首要卫生问题。由于微生物种类较多，而且有些微生物检测又非常困 难，因此不可能对水体中各种微生物逐一检测。由于大肠菌群(Coliforms)、大肠埃希氏菌 (E.Coli)和肠球菌(Enterococci)的检测相对容易，而且通过检测这些细菌基本可以判断 水体是否存在粪便等污染。因此，国际上通常把上述微生物称为指示菌，只要在水体中检测 到这些微生物的存在，就可以判定该水体已被粪便等污染物污染。
[0003] 水中肠球菌的检测多采用多管发酵法和滤膜法，操作步骤繁琐，需经确认试验对 阳性结果做出判断，检测时间较长。因此，急需建立一种操作简便，结果易判断、无需确认实 验的检测方法，以便于各级检测单位使用。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提出了一种能够快速检测水中肠球菌的 酶底物培养基及其应用方法，使用本发明的方法不需要繁琐的操作步骤、操作方便、结果易 判断、无需确认实验。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术手段实现的：
[0006] 本发明通过营养指示剂物理性状的改变来判定样品中目标菌的存在。不同种属的 微生物往往具有自己特定的酶，这些酶是代谢不同营养成份的基础。例如，大肠菌群细菌具 有半乳糖苷酶，大肠埃希氏菌具有葡萄糖醛酸苷酶，肠球菌具有葡萄糖苷酶。一般来 讲，一种特定酶只能代谢一些特定的营养成份。营养指示剂同时也是目标菌繁殖的基本营 养成分，该营养成分无法被目标菌以外的其它细菌代谢。当该营养成分被特定的酶代谢后， 其原来物理特性即会发生变化，产生特定的颜色变化或发出荧光等。通过这些物理性状的 变化，既可以判定某种特定细菌的存在。
[0007]在某些情况下，少数非目标菌也可能产生与目标菌相同的酶，造成假阳性结果。本 发明为了消除或把假阳性结果降至最低，根据检测的目标菌情况，在培养介质中加入能抑 制非目标菌繁殖的特殊物质。即根据目标菌所产生的酶，制成对应的含酶底物培养介质，使 目标菌得以繁殖生长，而非目标菌最大可能地被抑制。这样，只有在目标菌存在的情况下， 其培养介质中的特定营养成分才能被代谢，并游离出指示剂部分，从而显示出物理性状的 变化。同时，培养介质配方中适量的细菌酶诱导剂，可增加目标菌特异性酶的活性，从而缩 短细菌的培养时间并提高检测灵敏度。
[0008]营养指不剂有两部分构成，一部分可以作为目标菌的基本营养成分，另一部分是 单纯的指示剂。营养指示剂通常是某种色素原通过化学键链接到盐、碳、氨基酸、脂肪酸或 肽链等营养物质上形成。在对肠球菌的检测中，本发明选用对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷 (PNPG)作为其营养指示剂。由于肠球菌能产生β-葡萄糖苷酶，可以代谢产生对硝基苯酚产 生肉眼可见的黄绿色。
[0009] 为了抑制非目标菌的生长，本发明的培养基中还加入了抑制非肠球菌生长的成 分。这些成分包括去氧胆酸钠、庆大霉素、多粘菌素 Β等，可抑制非肠道细菌和革兰氏阴性细 菌的生长。同时为了抑制非目标菌的生长，利用肠球菌可在高温下生长而大多数环境细菌 在36°C生长良好、在41°C-45°C生长受到抑制的特点，采用的培养温度为41°C ± 1°C。
[0010] 为了加速目标菌的繁殖生长，本发明中将一些生长促进剂添加于培养基介质中。 这些生长促进剂主要包括来自蛋白胨、牛肉膏粉和酵母提取物中的碳源、氮源及微量元素 等，它们主要在细菌开始对数生长期前发挥作用，可以加速细菌繁殖生长，从而显著地缩短 目标菌的培养时间。
[0011] 为了适应不同的水样，培养基中加入了磷酸盐缓冲体系，可以将检测的水样pH维 持在7.2左右。
[0012] 具体的，本发明的一种用于检测水中肠球菌的液体酶底物培养基，含有以下浓度 的各物质：蛋白胨〇 . 3-0.7g/L、牛肉膏粉0.3-0.7g/L、酵母浸膏粉0.3-0.7g/L，氯化钠5-10g/L、二水合柠檬酸三钠0.5-1.58/1、磷酸氢二钠2-3.58/1，磷酸二氢钾1-28/1，去氧胆酸 钠0 · 1-0 · 5g/L、庆大霉素0 · 1-0 · 5mg/L，多粘菌素 B 15-25mg/L以及对硝基苯基-β-D-葡萄糖 苷50-70mg/L。
[0013] 其中，优选的，所述的酶底物培养基中含有以下浓度的各物质：蛋白胨0.5g/L、牛 肉膏粉〇 . 5g/L、酵母浸膏粉0.5g/L，氯化钠7.5g/L、二水合柠檬酸三钠 lg/L、磷酸氢二钠 2 · 83g/L，磷酸二氢钾1 · 36g/L，去氧胆酸钠0 · 2g/L、庆大霉素0 · 25mg/L，多粘菌素 B 20mg/L 以及对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷60mg/L。
[0014] 本发明的一种用于检测水中肠球菌的干粉酶底物培养基，将用于检测100mL水的 干粉酶底物培养基作为一个剂量，每个剂量的干粉酶底物培养基中含有以下重量的各物 质：蛋白胨0.03-0.07g、牛肉膏粉0.03-0.07g、酵母浸膏粉0.03-0.07g，氯化钠0.5-lg、二水 合柠檬酸三钠〇. 05-0.15g、磷酸氢二钠0.2-0.35g，磷酸二氢钾0.1-0.2g，去氧胆酸钠0.01_ 0.05g、庆大霉素0.01-0.05mg，多粘菌素 Β 1.5-2.5mg以及对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷5-7mg〇
[0015] 其中，优选的，每个剂量的干粉酶底物培养基中含有以下重量的各物质：蛋白胨 0.05g、牛肉膏粉0.05g、酵母浸膏粉0.05g，氯化钠0.75g、二水合柠檬酸三钠 O.lg、磷酸氢二 钠0.283g，磷酸二氢钾0.136g，去氧胆酸钠0.02g、庆大霉素0.025mg，多粘菌素 B 2mg以及对 硝基苯基-β-D-葡萄糖苷6mg。
[0016] 其中，优选的将所述的各物质研磨成粉末状，混匀，常温下制成10~30目的速溶颗 粒。
[0017] 进一步的，本发明还提出了以上所述的液体或干粉酶底物培养基检测水中肠球菌 中的应用。
[0018] 更进一步的，本发明还提出了一种用于检测水中肠球菌的方法，包括以下步骤:取 未经处理过的水样置于有盖无菌容器中，加入所述的液体酶底物培养基，混摇均匀，盖紧容 器，置于41°C±rC培养箱中培养24h，然后观察容器中水样颜色变化，如果呈现黄绿色，即 为肠球菌阳性。或者
[0019] 一种用于检测水中肠球菌的方法，其包括以下步骤:取未经处理过的水样置于有 盖无菌容器中，加入所述的干粉酶底物培养基，混摇均匀，盖紧容器，置于41°C ± 1°C培养箱 中培养24h，然后观察容器中水样颜色变化，如果呈现黄绿色，即为肠球菌阳性。
[0020] 其中，优选的，每100mL水样中加入一个剂量的本发明所述的干粉酶底物培养基。
[0021] 相较于现有技术，本发明具有以下优点：
[0022] 1)本发明的培养基和方法适用于环境卫生和食品卫生领域检测粪便污染指示菌；
[0023] 2)本发明的培养基和方法适用于各级卫生部门、环保部门、食品监测站、水质监测 站等；
[0024] 3)本发明的培养基和方法对实验室和实验人员要求低，适用于基层的使用；
[0025] 4)本发明的培养基和方法操作简单，检测步骤简捷；
[0026] 5)本发明的培养基和方法比传统的方法检测时间短，只需要24h，对阳性结果不需 进行确认试验；
[0027] 6)本发明的培养基和方法灵敏度高，特异性强，结果准确；
[0028] 7)本发明的培养基可制成干粉培养基，可高压灭菌后制成液体培养基、固体培养 基或用于纸片法；
[0029] 8)本发明的培养基可采用无菌一次性包装，最大程度地避免了对检测结果污染的 可能。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0031 ]实施例一用于检测水中肠球菌的液体酶底物培养基的制备 [0032] (1)按照以下重量分别称取各物质：蛋白胨0.5g、牛肉膏粉0.5g、酵母浸膏粉0.5g， 氯化钠7.5g、二水合柠檬酸三钠 lg、磷酸氢二钠2.83g，磷酸二氢钾1.36g，去氧胆酸钠0.2g、 庆大霉素〇. 25mg，多粘菌素 B 20mg以及对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷60mg。
[0033] (2)将上述庆大霉素、多粘菌素 B、对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷溶解于适量蒸馏水 中，过滤除菌。
[0034] (3)将上述除庆大霉素、多粘菌素 B、对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷之外的成分溶解于 适量蒸馏水中，高压灭菌;将过滤除菌成分添加，补足体积至1L，即得。
[0035] 实施例二用于检测水中肠球菌的干粉酶底物培养基的制备
[0036] (1)按照以下重量分别称取各物质：蛋白胨0.5g、牛肉膏粉0.5g、酵母浸膏粉0.5g， 氯化钠7.5g、二水合柠檬酸三钠 lg、磷酸氢二钠2.83g，磷酸二氢钾1.36g，去氧胆酸钠0.2g、 庆大霉素0.25mg，多粘菌素 B 20mg以及对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷60mg。
[0037] (2)将上述物质研磨成粉末状，混匀，常温下制成10~30目的速溶颗粒，按检测 lOOmL水样的剂量分装、密封、灭菌。分装，每个剂量的干粉酶底物培养基中含有以下重量的 各物质：蛋白胨〇. 〇5g、牛肉膏粉0.05g、酵母浸膏粉0.05g，氯化钠0.75g、二水合柠檬酸三钠 〇. lg、磷酸氢二钠〇. 283g，磷酸二氢钾0.136g，去氧胆酸钠0.02g、庆大霉素0.025mg，多粘菌 素 B 2mg以及对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷6mg。
[0038] 在室温下，该培养基通常可以保存12个月。
[0039]实施例三水样中肠球菌检测的定性实验及与常规方法的比较 [0040] 取lOOmL未经处理过的水样置于120mL左右有盖无菌容器中，加入一个剂量的上述 干粉酶底物培养基(实施例二制备），混摇均匀使其溶解。盖紧容器，置于41°C±1°C培养箱 中培养24h。然后观察容器中水样颜色变化，如果呈现黄绿色，即为肠球菌阳性。
[0041 ] 常规方法采用《食品和水中肠球菌检验方法》（SN/T 1933.1-2007)规定的水中肠 球菌直接培养法，取lOOmL未经处理过的水样进行检测。先将样品分别用两种肠球菌培养基 培养后，对可疑阳性结果进行确认实验。共进行30组实验，实验结果如表1所示，本发明的培 养基与培养方法的检验效果表与常规方法比较，无统计学差异(采用卡方检验），认为两种 方法具有等效性。常规方法培养需要48h，确定实验结果需要48h，需要显微镜等复杂的实验 室设备，而本发明方法只需要培养24h，不需要显微镜等实验室设备，无需进行分离培养和 证实实验。
[0042]表1本发明方法与常规方法的定性检测比较
[0044]实施例四水样中肠球菌检测的定量实验及与常规方法的比较 [0045]将lOOmL未经处理过的水样加入一个剂量的上述干粉酶底物培养基(实施例二制 备），摇动使其溶解，按规定剂量随机分配后，常用的分配方式有5-管法、15管法、51孔法等， 置于41°C ± 1°C培养箱中培养24h，根据阳性管或孔数，查相应的MPN表，可计算出100mL水样 中目标菌的MPN值。
[0046]同时《食品和水中肠球菌检验方法》（SN/T 1933.1-2007)规定的水中肠球菌最近 似值测定法(即为MPN法），共进行15组检测。结果如表2,本发明的培养基与培养方法的检验 效果表与常规方法比较，无统计学差异(采用配对t检验），认为两种方法具有等效性。
[0047]表2本发明方法与常规方法定量检测结果(MPN/100mL)
【主权项】
1. 一种用于检测水中肠球菌的液体酶底物培养基，其特征在于所述的酶底物培养基中 含有以下浓度的各物质：蛋白胨0.3-0.7g/L、牛肉膏粉0.3-0.7g/L、酵母浸膏粉0.3-0.7g/ L，氯化钠5-10g/L、二水合柠檬酸三钠0.5-1.5g/L、磷酸氢二钠2-3.5g/L，磷酸二氢钾l-2g/ L，去氧胆酸钠0.1-0.5g/L、庆大霉素0.1-0.5mg/L，多粘菌素 B 15-25mg/L以及对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷 50-70mg/L。2. 如权利要求1所述的液体酶底物培养基，其特征在于所述的酶底物培养基中含有以 下浓度的各物质：蛋白胨〇. 5g/L、牛肉膏粉0.5g/L、酵母浸膏粉0.5g/L，氯化钠7.5g/L、二水 合柠檬酸三钠 lg/L、磷酸氢二钠2.83g/L，磷酸二氢钾1.36g/L，去氧胆酸钠0.2g/L、庆大霉 素0.25mg/L，多粘菌素 B 20mg/L以及对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷60mg/L。3. 权利要求1或2所述的液体酶底物培养基检测水中肠球菌中的应用。4. 一种用于检测水中肠球菌的干粉酶底物培养基，将用于检测100mL水的干粉酶底物 培养基作为一个剂量，其特征在于每个剂量的干粉酶底物培养基中含有以下重量的各物 质：蛋白胨0.03-0.07g、牛肉膏粉0.03-0.07g、酵母浸膏粉0.03-0.07g，氯化钠0.5-lg、二水 合柠檬酸三钠〇. 05-0.15g、磷酸氢二钠0.2-0.35g，磷酸二氢钾0.1-0.2g，去氧胆酸钠0.01_ 0.05g、庆大霉素0.01-0.05mg，多粘菌素 B 1.5-2.5mg以及对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷5-7mg〇5. 如权利要求4所述的干粉酶底物培养基，其特征在于每个剂量的干粉酶底物培养基 中含有以下重量的各物质：蛋白胨〇.〇5g、牛肉膏粉0.05g、酵母浸膏粉0.05g，氯化钠0.75g、 二水合柠檬酸三钠〇. lg、磷酸氢二钠〇. 283g，磷酸二氢钾0.136g，去氧胆酸钠0.02g、庆大霉 素0.025mg，多粘菌素 B 2mg以及对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷6mg。6. 如权利要求4或5所述的干粉酶底物培养基，其特征在于将所述的各物质研磨成粉末 状，混匀，常温下制成10~30目的速溶颗粒。7. 权利要求4-6任一项所述的干粉酶底物培养基检测水中肠球菌中的应用。8. -种用于检测水中肠球菌的方法，其特征在于包括以下步骤:取未经处理过的水样 置于有盖无菌容器中，加入权利要求1或2所述的液体酶底物培养基，混摇均匀，盖紧容器， 置于41°C±rC培养箱中培养24h，然后观察容器中水样颜色变化，如果呈现黄绿色，即为肠 球菌阳性。9. 一种用于检测水中肠球菌的方法，其特征在于包括以下步骤:取未经处理过的水样 置于有盖无菌容器中，加入权利要求4-6任一项所述的干粉酶底物培养基，混摇均匀，盖紧 容器，置于41°C±rC培养箱中培养24h，然后观察容器中水样颜色变化，如果呈现黄绿色， 即为肠球菌阳性。10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于每100mL水样中加入一个剂量的权利要求4-6 任一项所述的干粉酶底物培养基。
【文档编号】C12R1/01GK105936929SQ201610446103
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年6月20日
【发明人】孙宗科, 张晓 , 郑萍, 武利平, 李霞, 王友斌, 丁培, 丁珵, 毛怡心, 陈西平
【申请人】中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所