环糊精葡萄糖基转移酶及其制备方法
【专利摘要】环糊精葡萄糖基转移酶及其制备方法，涉及环糊精葡萄糖基转移酶。通过优化Thermococcus sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶基因的密码子，人工合成环糊精葡萄糖基转移酶基因核苷酸序列，并将基因克隆至载体pUC57?Amp。通过引物扩增后得到的糊精葡萄糖基转移酶基因cgt与pET?28m质粒构建了重组原核表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组蛋白的表达，纯化后的蛋白纯度高、活力好，为该蛋白的实际应用提供了基础。通过同源重组表达环糊精葡萄糖基转移酶，可以克服分离纯化过程复杂繁琐、产量低等不足，为该蛋白能广泛应用于生物、食品、医药、农业等领域奠定基础。
【专利说明】
环糊精葡萄糖基转移酶及其制备方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及环糊精葡萄糖基转移酶，尤其是涉及Thermococcus sp.4557环糊精葡 萄糖基转移酶及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 环糊精(Cyclodextrin)是指由成环的葡萄糖基组成的聚合物，葡萄糖基的数量在 6个及以上。到目前为止主要的三种环糊精为α-，β_和γ_环糊精，它们分别含有6个、7个和8 个葡萄糖基。研究证明由于环糊精的中空桶状结构使其内部具有较强的疏水性，外部却呈 现较强的亲水性质，可用于包埋各种疏水的化合物。因此环糊精在工业生产以及科学研究 中具有很大的应用性。
[0003] 环糊精葡萄基转移酶（Cyc 1 odextr in glucanotransferases，CGTase ; EC 2.4.1.19)是一类能够将淀粉转化为环状葡聚糖的酶，属于α-淀粉酶、GH13水解酶家族。环 糊精葡萄糖基转移酶能够催化四种反应，分别为歧化反应(018?1'〇?〇1'1:;[0仙1:;[011)、水解反 应(Hydrolysis)、开环反应(Coupling)和环化反应(Cyclization)。根据酶作用的底物以及 条件的不同，发生不同的催化作用以及产生不同的产物。
[0004] 自然界中能够产生环糊精葡萄糖基转移酶的微生物有很多，包括芽孢杆菌、假单 胞菌、微球菌、产酸克雷伯氏菌等。到目前为止常用于工业上生产环糊精葡萄糖基转移酶的 菌种仅包括嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱脂肪芽孢杆菌、软化芽孢杆菌等少数几种。大部分环糊 精葡萄糖基转移酶催化淀粉生成的环糊精种类较杂，专一性较差，且产量也比较低。因此通 过构建工程菌，实现环糊精葡萄糖基转移酶的过量表达成为研究的热点。
[0005] 大肠杆菌表达系统由于具有遗传背景清楚、操作简单、大规模发酵培养以及成本 较低等优点，是最常用的表达系统。近年来环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的可溶性 表达已取得了较好的结果，所用的目的基因多来源于芽孢杆菌属。有人通过将嗜碱脂肪芽 孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶的基因与pET_22b( + )载体质粒进行重组，在大肠杆菌中 进行诱导表达，所得到的环糊精葡萄糖基转移酶是其天然条件下产量的9倍之多。但是环 糊精葡萄糖基转移酶的异源表达也同样存在着许多的不足:表达系统没有普遍性，部分环 糊精葡萄糖基转移酶基因无法实现可溶性表达；多数表达的酶为环糊精葡萄糖基转移 酶，较少α-和γ-环糊精葡萄糖基转移酶。因此，寻找具有优良性质的环糊精葡萄糖基转移 酶具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供Thermococcus sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶基因； [0007]本发明的第二个目的是提供Thermococcus sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶；
[0008]本发明的第三个目的是提供Thermococcus sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶的制 备方法；
[0009]本发明的第四个目的是提供Thermococcus sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶的生 物学活性。
[0010] Thermococcus sp. 4557环糊精葡萄糖基转移酶基因，编码Thermococcus sp. 4557 环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列，记作cgt。
[0011] 所述Thermococcus sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶基因 cgt的分子类型为DNA，序 列特征：长度为2040bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性，所述Thermococcus sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶基因 cgt的序列如下所示，记为SEQ ID No. 1:
[0012]
[0013]
[0014]所述Thermococcus sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列采用以下方法 获得:在苏州金唯智生物科技有限公司进行环糊精葡萄糖基转移酶基因的密码子优化改 造，并将基因克隆至载体pUC57-Amp ;以合成序列SEQIDNo.3和SEQIDNo.4作为引物，经 PCR扩增获得cgt基因核苷酸序列SEQ ID No. 1;相关的核苷酸序列通过软件预测获得基因 编码的多肽SEQ ID No.2,然后构建原核表达载体获得重组表达蛋白。
[0015] 所述合成序列SEQ ID No.3:CGGGATCCGTACGCCGTTCCGGAACGC。
[0016] 所述合成序列SEQ ID No.4:CCGCTCGAGTAGGGTTCTCA CCGATCGGGC。
[0017] Thermococcus sp . 4557环糊精葡萄糖基转移酶，包括具有水解淀粉活性的 Thermococcus sp.4557 CGT〇
[0018] 所述CGT的分子类型为蛋白质，序列特征:长度为680aa，类型为氨基酸，所述CGT的 序列如下所示，记为SEQ ID No.2:
[0019]
[0020]
[0021] 所述Thermococcus sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶，其蛋白具有SEQ ID No. 2所 示氨基酸序列的多肽;或将SEQ ID No.2氨基酸序列经过至少一个氨基酸残基的取代、缺失 或添加而形成，且具有与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相似功能的多肽。
[0022] 所述Thermococcus sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
[0023] l)Thermococcus sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶密码子优化改造以及人工合成；
[0024] 2)Thermococcus sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶的PCR扩增和序列分析；
[0025] 3)Thermococcus sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶的重组表达及纯化。
[0026] 本发明优化改造并人工合成Thermococcus sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶基因， 并将基因克隆至载体pUC57-Amp，通过引物扩增、克隆和鉴定了环糊精葡萄糖基转移酶基因 cgt。通过构建重组原核表达载体，在大肠杆菌中进行重组蛋白表达，克服了原菌分离纯化 过程中复杂繁琐、产量低等不足。同时纯化后的蛋白纯度高、活力好，为该蛋白能广泛应用 于生物、食品、医药等研究领域奠定基础。
【附图说明】
[0027] 图1为cgt基因重组表达的SDS-PAGE电泳图谱。M:蛋白Marker;l:重组载体cgt-pET-28m在菌株BL21 (DE3)的未诱导表达;2:重组载体cgt-pET-28m在菌株BL21 (DE3)的诱导 表达后超声破碎后上清;3:重组载体cgt-pET-28m在菌株BL21 (DE3)的诱导表达超声破碎后 包涵体。
[0028] 图2为CGT纯化的SDS-PAGE电泳图谱。M:蛋白Marker; 1:经镍柱介质纯化所得的目 的蛋白CGT。
[0029] 图3为温度对CGT的影响图谱。横坐标表示不同温度;纵坐标表示CGT的相对活性。
[0030] 图4为温度对CGT稳定性的影响图谱。横坐标表示时间；纵坐标表达CGT的相对活 性。
[0031 ] 图5为pH对CGT的影响图谱。横坐标表示不同pH;纵坐标表示CGT的相对活性。
[0032] 图6为pH对CGT稳定性的影响图谱。横坐标表示不同pH;纵坐标表示CGT的相对活 性。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如分子克隆实验室手册（1、萨姆布鲁克，拉塞尔（著），黄培堂(译），《分子克隆实验指南》， 科学出版社，2002年，第三版）中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议的条 件。
[0034] 为实现上述目的，本发明采用以下技术措施，其具体步骤是：
[0035] 1 ·人工合成Thermococcus sp. 4557环糊精葡萄糖基转移酶基因
[0036] 环糊精葡萄糖基转移酶基因的密码子优化改造在苏州金唯智生物科技有限公司 进行，环糊精葡萄糖基转移酶基因改造优化并合成基因，将基因克隆至载体pUC57-Amp。对 优化后获得的环糊精葡萄糖基转移酶基因命名为cgt。
[0037] 2. Thermococcus sp. 4557环糊精葡萄糖基转移酶基因的PCR扩增和序列分析 [0038]以Thermococcus sp.4557优化改造后序列为模板，用引物F和R扩增环糊精葡萄糖 基转移酶cgt基因。
[0039] F：CGGGATCCGTACGCCGTTCCGGAACGC(SEQ ID No.3)；
[0040] R：CCGCTCGAGTAGGGTTCTCA CCGATCGGGC(SEQ ID No.4)；
[0041] 划线部分GGATCC代表BamH頂每切位点，GCTAGC代表Xho頂每切位点。
[0042] 在50μ1的反应体系中含0.5μ1模板(含有目的基因的载体pUC57-Amp)，lyl引物F (10μΜ)，1μ1 引物R(10yM)，4yl dNTP(各2·5πιΜ)，10μ1 5XPrimerSTAR? Buffer，0.5yl PrimerSTAR? HS DNA Polymerase(2.5UAU)(TaKARa公司），用H2O将总体积补至δΟμΚΡΟ? 反应条件为：98°Clmin，30cycles(98°C10s、54°C30s、72°C2min)72°C5min;4°C 保存。PCR 产 物经纯化后与T载体连接，转化到大肠杆菌感受态细胞ToplO中，菌落PCR后选取有DNA片段 的阳性克隆测序。
[0043] 3.Thermococcus sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶基因的表达、纯化与蛋白复性 [0044]将含有cgt基因的质粒用BamH I和Xho頂每切，胶回收cgt基因片段，同时将质粒 pET-28m也用相同的酶进行酶切。将两者连接过夜（12~16h)。连接产物转化到大肠杆菌感 受态细胞T0P10中，提取质粒，测序验证。
[0045] 将测序正确的质粒cgt-pET-28m转化BL21(DE3)，37°C生长15小时后菌落PCR验证 质粒转化的正确性。挑选转化正确的菌落，接种到500mL含有100mg/L卡那霉素的LB培养基 中，37 °C摇培至A6QQ = 0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)至终浓度0.4mM，37 °C诱 导4~5h;将菌液收集至200mL的离心管中，8000g离心10min沉淀细菌细胞;将菌体细胞重新 悬浮在20mL Binding Buffer(50mM磷酸钠缓冲液，300mM氯化钠，pH= 7.4)中，超声波处理 至菌液成半透明，再14000rpm离心20min，弃上清；将包涵体沉淀用含8M尿素的Binding Buffer混勾溶解；待溶解完全后4000g离心5min，所得上清与平衡后的GE Healthcare Ni Sephar〇se(GE公司）室温结合过夜。纯化过程按照纯化试剂盒说明进行。纯化得到的重组蛋 白CGT经10%的SDS-PAGE电泳分析，其分子量约为74kDa，纯度达90%以上（图l，2)。
[0046]将纯化后单一的洗脱液蛋白全部转入透析袋中，放置在含有6M尿素的Binding 811打6^容液于4°(：透析。每隔311更换透析液，使其尿素浓度依次下降（41、21、1.51、1.(^、 0M)。最后获得的即为复性CGT蛋白。（若蛋白透析时有沉淀析出，可低转速离心除去沉淀后 继续透析）
[0047] 4.重组Thermococcus sp. 4557 CGT的酶学性质
[0048] 4.1蓝值法(2、张树政.酶制剂工业[M]，科学出版社，1984:547)检测重组环糊精葡 萄糖基转移酶的酶活
[0049] 1)在5mL样品管中加入适量CGI1酶液，加入0.2M甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 9.0) 0.2mL，再加入0.2%马铃薯淀粉溶液0.2mL(现配现用），置于一定温度水浴中放置lOmin; [0050] 2)取出后立即加入0.5M醋酸0.5mL终止反应。
[00511 3)加入3mL 0.005%碘液显色，同时以蒸馏水为空白，未加入酶液的反应液为对 照，在700nm波长下测定吸光值(0D)，一个酶活单位定义为使吸光度下降10%所需的酶量， 酶活计算如下：
[0052] U/mL= (8-13)/&*1000*酶液稀释倍数 [0053] 式中，a为对照组0D值，b为样品0D值。
[0054] 4.2重组酶酶学性质的研究
[0055] 1)预实验
[0056]分别取5μ1、10μ1、20μ1、30μ1酶液按照步骤4.1中的检测体系进行反应，找到最适 加入的酶量进行之后的酶学性质实验。在保证酶不过量的条件下选取20μ1进行实验，该体 系为标准反应体系。
[0057] 2)最适反应温度
[0058] 将酶的标准反应体系分别置于30~90°C保温lOmin，测酶活。
[0059] 图3为温度对CGT的影响图谱。横坐标表示不同温度;纵坐标表示CGT的相对活性。
[0060] 3)温度稳定性
[0061 ] 将酶先分别置于30 °C、40 °C、50 °C、60 °C、70 °C、80 °C水浴中，不同时间取出酶液，在 用标准的反应体系检测残余酶活，以未处理的酶作为对照。
[0062]图4为温度对CGT稳定性的影响图谱。横坐标表示时间；纵坐标表达CGT的相对活 性。
[0063] 4)最适反应pH
[0064]分别使用NaAc-HAc buffer(4~6)、NaH2P〇4-Na2HP〇4 buffer(6.0~7.5)、Tris-HCl buffer(7 · 5~9 · 0)、Glycine-NaOH buffer(9~11)作为反应体系缓冲液以及配置底物溶液 在60°C下检测酶的活性。
[0065] 图5为pH对CGT的影响图谱。横坐标表示不同pH;纵坐标表示CGT的相对活性。
[0066] 5)pH 稳定性
[0067] 将酶先分别置于他厶(3-骱(：131^€644~6)、他!12?〇4-他2册〇4 131^€6以6.0~7.5)、 1^8-!1(：1131^€647.5~9.0)、617(^116-恥0!1131^€649~11)缓冲液中，室温211后，标准反 应体系在60 °C检测残余酶活。
[0068] 图6为pH对CGT稳定性的影响图谱。横坐标表示不同pH;纵坐标表示CGT的相对活 性。
【主权项】
1 .Thermococcus sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶基因，其特征在于编码Thermococcus sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶的核巧酸序列，记作cgt。2.如权利要求1所述化ermococcus sp. 4557环糊精葡萄糖基转移酶基因，其特征在于 Thermococcus sp. 4557环糊精葡萄糖基转移酶基因 cgt的分子类型为DNA，序列特征：长度 为2040bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性，所述化ermococ州S sp.4557环糊精 葡萄糖基转移酶基因 cgt的序列如下所示，记为SEQ ID No. 1:3. 如权利要求1所述化ermococcus sp. 4557环糊精葡萄糖基转移酶基因，其特征在于 其核巧酸序列采用W下方法获得:进行环糊精葡萄糖基转移酶基因的密码子优化改造，并 将基因克隆至载体pU巧7-Amp合成序列SEQ ID No.3和合成序列SEQ ID No.4作为引物， 经PCR扩增获得cgt基因核巧酸序列SEQ ID No. 1;相关的核巧酸序列通过软件预测获得基 因编码的多肤SEQ ID No.2,然后构建原核表达载体获得重组表达蛋白。 4. Thermococcus sp. 4557环糊精葡萄糖基转移酶，其特征在于包括具有水解淀粉活性 的Thermococ州S sp.4557 CGT。5. 如权利要求4所述化ermococcus sp. 4557环糊精葡萄糖基转移酶，其特征在于所述 CGT的分子类型为蛋白质，序列特征：长度为680aa，类型为氨基酸，所述CGT的序列如下所 示，记为沈Q ID No.2:481 G朗陡化I鉛VTPYIA離视的LIGGA邸G 3S蚀Π 防&V MR化SW雌了閒LV'邸班祁 巧41 TE舱机。VV'V ETG(满A組PA化脚挖駐⑩L PALIAWATPI IT嫌Lfl路S LPEL施P邸L 601 邱SST約?ΡΤ mPWN抑.仲' S呢I:^T巧哪駆LRPLNVTL YGFV殿TWF L肌胖PTV即 661 ETAMMF巧T I视邸 IGENP。6. 如权利要求5所述化ermococcus sp. 4557环糊精葡萄糖基转移酶，其特征在于其蛋 白具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肤;或 将SEQ ID No.2氨基酸序列经过至少一个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成，且具 有与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相似功能的多肤。7. 如权利要求4所述化ermococcus sp. 4557环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法，其特 征在于包括W下步骤： 1 )The;rmococcus sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶密码子优化改造 W及人工合成； 2. The;rmococ州S sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶的PCR扩增和序列分析； 3. The;rmococ州S sp.4557环糊精葡萄糖基转移酶的重组表达及纯化。
【文档编号】C12N15/54GK105936912SQ201610490579
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】阮灵伟, 施泓, 徐洵, 董琦
【申请人】国家海洋局第三海洋研究所