一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法
【专利摘要】本发明公开了一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法，包括：克隆水稻受体材料的OsLCT1外显子；利用CRISPR/Cas9系统，根据外显子序列选择靶标序列，构建pCRISPR/Cas9重组载体；将pCRISPR/Cas9重组载体导入水稻愈伤组织中得到转基因苗；筛选转基因阳性植株；获得突变植株；将突变植株进行繁种，于后代植株中分离不含转基因成分的功能缺失突变体。本发明利用CRISPR/Cas9技术定向敲除水稻OsLCT1，彻底失活镉转运蛋白OsLCT1，定向育成不带转基因成分，稻米镉含量显著降低，综合农艺性状无显著变异的水稻材料，具有安全、高效、节约时间、成本低等优势。
【专利说明】
一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法
技术领域
[0001] 本发明涉及水稻生物技术育种领域，具体涉及一种降低水稻籽粒镉含量的育种方 法。
【背景技术】
[0002] 随着我国工业化和城市化的不断发展，工业"三废"、城市垃圾及污水灌溉等造成 土壤重金属污染不断加剧。其中，重金属镉(Cadmium，Cd)在土壤一食物链中的活跃迀移已 对人类健康构成严重威胁。近些年来，稻米镉超标事件屡现报端，对我国粮食生产造成严重 的安全挑战，引起国家各部委的高度重视。针对这一现状，全国广泛开展镉低积累水稻品种 筛选和相关农艺栽培技术研究，在效果与副作用、成本与时间周期等方面，还存在诸多需要 解决的问题。而定向改良水稻的镉积累性状，培育低镉品种是解决稻米镉超标问题最环保、 最经济的方法。
[0003] 随着研究的深入，水稻吸收、输运、分配和籽粒积累镉的生理过程机制已逐渐明 晰：（1)根毛细胞从土壤溶液中吸收Cd2+; (2)木质部介导Cd由根转运到茎和叶；（3)在茎节 中，部分Cd由木质部转运到韧皮部中，再由韧皮部介导Cd优先转运到上部茎节，并最终转运 到籽粒中；（4)在灌浆成熟期，叶中积累的Cd再次活化，由韧皮部介导转运到籽粒中，这部分 Cd占籽粒Cd积累量的近一半。目前传统的改良品种的籽粒镉含量方法为利用低镉材料与受 体材料杂交、回交，结合后代农艺性状观察和镉含量鉴定多代筛选，这样的育种方法育种周 期长，并且无论回交多少代都会多少渗入与靶标基因连锁的其他基因，改变遗传背景，影响 受体品种的农艺性状。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种基于CRISPR/Cas9系 统靶向突变OsLCTl降低水稻籽粒镉含量的育种方法，利用CRISPR/Cas9技术定向敲除水稻 OsLCTl，彻底失活镉转运蛋白OsLCTl，定向育成不带转基因成分，稻米镉含量显著降低，综 合农艺性状无显著变异的水稻材料，具有安全、高效、节约时间、成本低等优势。
[0005] 为此，本发明提供了一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法，包括以下步骤：
[0006] S1、克隆水稻受体材料的OsLCT 1的第三个外显子、测序；
[0007] S2、利用CRISPR/Cas9系统，根据计第三个外显子序列选择靶标序列；
[0008] S3、构建含所述靶标序列片段的pCRISPR/Cas9重组载体；
[0009] S4、将所获得的pCRISPR/Cas9重组载体导入水稻愈伤组织中得到转基因苗；
[0010] S5、筛选所述转基因苗中的转基因阳性植株；
[0011] S6、利用所述转基因阳性植株获得突变植株；
[0012] S7、将所述突变植株进行繁种，于后代植株中分离不含转基因成分的功能缺失突 变体，即为稻米镉含量降低的水稻。
[0013] 上述的育种方法，优选的，所述步骤S2中设计的靶标序列的的一条链具有5'- (N) x-NGG-3 '结构，所述N表示A，T，C和G中的任意一个，所述X为19或20。
[0014] 上述的育种方法，优选的，所述靶标序列包括TPS1和TPS2，所述TPS1的DNA序列为 SEQIDN0.2所示的序列，所述TPS2的DNA序列为SEQIDN0.3所示的序列。
[0015] 上述的育种方法，优选的，所述步骤S3具体包括以下步骤：
[0016] S3-1、根据靶标序列以及酶切位点信息，设计带粘性末端的接头引物；
[0017] S3-2、酶切原始载体；
[0018] S3-3、将所述带粘性末端的接头引物退火后连接到酶切过的原始载体上，得到重 组gRNA表达盒；
[0019] S3-4、将所述重组gRNA表达盒进行PCR扩增得到扩增产物；
[0020] S3-5、酶切扩增产物，将酶切后的扩增产物连接到酶切过的pCRISPR/Cas9载体上， 得到重组载体。
[0021] 上述的育种方法，优选的，所述步骤S3-1中所述接头引物包括TSP1-F、TSP1-R、 TSP2-F和TSP2-R，所述TPS1-F的DNA序列为SEQ ID勵.4所示的序列，所述了?51-1?的0嫩序列 为SEQIDN0.5所示的序列，所述TPS2-F的DNA序列为SEQIDN0.6所示的序列 ；所述TPS2-R 的DNA序列为SEQIDN0.7所示的序列。
[0022]上述的育种方法，优选的，所述原始载体为pU3-gRNA或pU6a-gRNA。
[0023]上述的育种方法，优选的，所述步骤S3-2中采用Bsa頂每切所述原始载体。
[0024]上述的育种方法，优选的，所述步骤S3-5中采用Bsa頂每切所述扩增产物。
[0025] 主要利用了Bsa I的切割位点在识别位点之外的特点，便于一次酶切产生多种带 不同粘性末端的DNA片段，一次完成酶切、连接。
[0026] 上述的育种方法，优选的，所述步骤S3-3中，所述带粘性末端的接头引物位于所述 表达载体的两个Bsa I内切酶位点之间，形成重组的gRNA表达盒。
[0027] 上述的育种方法，优选的，所述步骤S6步骤具体为：提取所述转基因阳性植株的 DNA，进行PCR扩增得到扩增产物;对所述扩增产物进行测序，选择两个等位OsLCTl均发生功 能缺失突变的To代纯合突变体和双等位突变体的植株作为突变植株。
[0028] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0029] (1)本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9系统靶向突变OsLCTl降低水稻籽粒镉含 量的育种方法。OsLCTl是目前在水稻中唯一鉴定出来的参与韧皮部运输Cd的关键转运蛋 白，OsLCTl RNAi株系的籽粒的Cd含量可降至对照的50%左右，其形态表型、生物产量和经 济产量较对照无显著差别。本发明基于CRISPR/Cas9系统，定点突变OsLCTl，快速定向改良 水稻的籽粒镉积累性状，获得镉含量显著降低的水稻材料可以不带转基因成分。这种技术 方法一方面规避了转基因可能带来的安全隐患，另一方面由于是靶向突变，具有DNA损伤 小，突变位点可控的优势。
[0030] (2)本发明提供了一种基于CRISPR/Csa9系统靶向突变OsLCTl降低水稻籽粒镉含 量的育种方法，采用5' _(N)x-NGG-3 '结构的靶标序列，靶标序列NGG上游的12bp在水稻基因 组中有较好的特异性，能显著降低脱靶概率。
[0031] (3)本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9系统靶向突变OsLCTl降低水稻籽粒镉含 量的育种方法，大大缩短了育种周期，加快了育种进程，节省了时间和成本。
[0032] (4)本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9系统靶向突变OsLCTl降低水稻籽粒镉含 量的育种方法，由于是靶向定点突变，不改变受体材料的遗传背景;而传统杂交、回交的育 种方法，无论回交多少代都会多少渗入与靶标基因连锁的其他基因，改变遗传背景，影响受 体品种的农艺性状。
【附图说明】
[0033]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例 中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0034]图1为实施例1中的1^代植株潮霉素阳性检测结果;其中1-20分别表示20株不同的 !^代植株，CK+表示阳性对照，ΟΓ表示阴性对照。
[0035]图2为实施例1中的突变体oslctl和对照WT的糙米Cd含量;材料于4mg/kg的镉胁迫 盆栽种植，二次重复。
[0036]图3为实施例1中的突变体oslctl和对照WT的糙米此、〇1、？6、211含量;材料于411^/ kg的锦胁迫盆栽种植，三次重复。
【具体实施方式】
[0037]以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而 限制本发明的保护范围。
[0038] 实施例
[0039] 以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
[0040] 实施例1:
[0041] 本发明的一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法，有效改良水稻籽粒的镉积累性 状，步骤如下：
[0042] 1)克隆粳稻品种107的OsLCTl第三个外显子，即自OsLCTl翻译起始密码子ATG后第 214~1533位的核苷酸序列，进行测序。测序结果为SEQ ID NO. 1所示的序列：
[0044] 2)根据步骤1)中第三个外显子序列，设计两条靶标序列，分别为TPS1和TPS2:
[0045] TPS1(SEQ ID NO.2)：CCGCGTCGTTTGGGATCCTCAGG；
[0046] TPS2(SEQ ID NO.3)：CCGTGGTCTCTGGGGATAGTCAT〇
[0047] 以上两条靶标序列的反向互补链含有5'-(N)x-NGG_3'结构。其中，下划线部分为 5 ' -(N)x-NGG-3 '结构中的NGG的互补链序列。
[0048] 3)含TPS1、TPS2双靶点pCRI SPR/Cas9重组载体的构建：
[0049] 3.1、合成带粘性末端的靶标序列双链，作为接头引物：
[0050] TPS1包括合成正向寡核苷酸链TSP1-F(SEQIDN0.4)和与之互补的反向寡核苷酸 链TSP1-R(SEQIDN0.5)，TPS2包括合成正向寡核苷酸链TSP2-F(SEQIDN0.6)和与之互补 的反向寡核苷酸链TSP2-R(SEQIDN0.7)，具体序列为 ：
[0055] 其中，未划线的部分为靶标序列TPS1(SEQIDN0.2)、TPS2(SEQIDN0.3)中去除 NGG的序列或其互补序列，下划线部分为用于连接载体的粘性末端。
[0056] 3 · 2、构建 pCRISPR/Cas9 重组载体：
[0057] 3.2.1接头的制备:将接头引物TSP1-F、TSP1-R、TSP2-F和TSP2-R分别溶解成100μΜ 的母液，各取lyL，其中TSP1-F与TSP1-R混合，TSP2-F与TSP2-R混合，稀释到ΙμΜ。在95°C下放 置30S，移至室温冷却，完成退火。
[0058] 3.2.2酶切口1]3巧1?嫩41]6311?嫩载体：在2(^1^反应体系中用101]883頂每切口1]3-gRNA、pU6a-gRNA载体20min，在70°C下放置5min使酶失活，得到酶切后的pU3-gRNA、pU6a-gRNA载体。
[0059] 3.2.3将步骤3.2.1中得到的接头与步骤3.2.2得到的pU3-gRNA、pU6a-gRNA载体的 连接反应：取lyL 10x T4 DNA ligase buffer，0.5yL pU3-gRNA/pU6a-gRNA载体（12ng)，ly LTSP2/TSPl，lyL T4 DNA ligase(35U)，最后加 ddH20至总体积 10μ1，在20°C~25°C下连接 15min，得到重组的 sgRNA 表达盒：pU3-TSP2-gRNA、pU6a-TSP 1 -gRNA。
[0060] 3.2.4PCR扩增表达盒：用K0D高保真酶，和U3-F、U3-R引物对、扩增步骤3.2.3中得 到的口1]313?211?麻 ；用1(00高保真酶，和1]6&4、1]6&-1?引物对、扩增步骤3.2.3中得到的 pU6a-TSPl-gRNA表达盒。其中引物对的序列分别为：
[0065]反应体系为：lyL pU3-TSP2-gRNA/pU6a-TSPl-gRNA载体，0.5yL U3-F/U6a-F，0.5y L U3-R/U6a-R，4yL dNTP，15yL 2xbuffer，0.5yL KOD酶，加 ddH20至总体积30yL。
[0066] 反应程序为：95°C预变性lmin，28个循环：95°C变性10s，60°C退火15s，68°C延伸 20s。电泳，把扩增后的pU3-TSP2-gRNA、pU6a-TSPl-gRNA表达盒等量混合，用PCR产物纯化试 剂盒纯化。
[0067] 3.2.5酶切扩增产物、连接到酶切过的？0?13?1?/^&89载体上获得?0?13?1?/^ &89重 组载体。具体构建方法采用边酶切边连接的方法，以Bsa I为内切酶。
[0068]反应体系如下：lyL pU3-TSP2-gRNA(30ng)、pU6a-TSPl-gRNA表达盒混合物，lyL pCRISPR/Cas9载体（80ng)，lyL Bsa I(10U)，1.5yL lOxSmart Buffer，1.5yL ΑΤΡ(1πιΜ)，1μ L T4 DNA ligase(35U)，最后加 ddH2〇至总体积 15yL。
[0069] 反应程序：在PCR仪上完成 12循环：37°C 5min、10°C 5min、20°C 5min。
[0070] 构建方法可参照Ma等文献A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient, High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants. Mol Plant(2015)。
[0071] 4)农杆菌介导遗传转化水稻:将步骤3)中构建好的pCRISPR/Cas9重组载体导入农 杆菌种EHA105,用粳稻品种107的成熟种子在诱导培养基上诱导愈伤组织。具体步骤如下： [0072] 将含有pCRISPR/Cas9重组载体的EHA105接种于YM琼脂培养基28°C培养2天得到培 养液。将收集到的培养液加入到含有l〇〇mo 1 /L的乙酰丁香酮的NB液体培养基中，调0D600到 0.5得到菌液。将水稻愈伤组织在以上菌液中浸泡30min，用无菌水冲洗3~5次，用灭菌滤纸 吸干水分，风干，后转移到NB琼脂培养基培养26°C~28°C暗培养3天。然后转移愈伤组织至 含有50mg/L潮霉素的培养基26°C~28°C暗培养，每15天继代一次，继代2次。抗性筛选后，转 入到再生培养基，分化出转基因苗。经潮霉素 PCR检测，共获得23株转基因阳性植株。
[0073] 5)突变位点的鉴定：
[0074] 5.1、提取上述转基因阳性植株的基因组DNA。
[0075] 5.2、针对含靶标位点的800bp以内的DNA片段，设计特异性引物，以Το代转基因水 稻的基因组DNA或cDNA为模板，扩增含靶标位点的DNA片段，具体步骤为：
[0076]以步骤5.1中提取的DNA为模板，以T-C-F4和T-C-R4为上游引物和下游引物，用高 保真酶扩增包含双靶标位点的DNA片段。
[0077] T-C-F4：GTCGGCGTGCTCTTCGGCGT(SEQ ID NO.12)；
[0078] T-C-R4:CTCCCGGTCGCATGGTCAGGT(SEQ ID N0.13)。
[0079] 反应体系：〇.5yL DNA模板，lyL T-C-F4，lyL T-C-R4,4yL dNTP，15yL 2xbuffer， 0.5yL K0D酶，加 ddH20至总体积30yL。
[0080] 反应程序:95°C预变性3min，30个循环:98°C变性10s，64°C退火30s，68°C延伸40s。
[0081] 5.3、扩增得到的PCR产物经纯化后送公司测序，测序结果与野生型植株序列比对， 对于测序结果为叠峰的样品，TA克隆，挑取10个左右单克隆，测序比对分析样品基因型，部 分突变分析结果如表1所示。
[0082] 表1 :CRISPR/Cas9系统引入的To代转基因植株突变序列分析结果表
[0085]表1为实施例1中的CRISPR/Cas9系统引入的To代转基因植株突变序列分析;6-7、 7-1等表示不同的转基因株系，CK表示对照;WT表示野生型;标注下划线的字母为NGG序列的 反向互补序列；表示此处碱基省略；表示碱基缺失，"Inv"表示倒位，其后的数字 表示碱基数。
[0086]从表1的测序结果表明，获得的23株To代转基因植株全部发生靶向InDel突变，突 变率为100%，主要突变类型为两个靶位点间的序列缺失或倒位。
[0087] 6)根据测序比对结果，选取OsLCTl开放阅读框发生移码突变或提前终止，导致两 个等位OsLCTl均发生功能缺失突变的To代纯合突变株系7-1和双等位突变株系7-3,繁种， 于!^代转基因分离群体分子检测潮霉素、Cas9等转基因元件，结果参见图2,分离不带转基 因成分的功能缺失突变体。
[0088]两个等位OsLCTl基因均发生功能缺失突变是指两个等位OsLCTl基因在靶标位置 处均发生移码突变或提前终止。纯合突变体是指两个等位OsLCTl基因发生同一种的突变， 双等位突变体是指两个等位OsLCTl基因发生两种不同的突变。
[0089] 7)采取人工模拟镉胁迫的盆栽试验，土壤取自大田表层，测定基础肥力，风干、过 筛、去杂、混勾，分装至每盆25mg/kg，将Cd(CdCl2)以溶液形式加入备用土壤，锦处理浓度为 4mg/kg，平衡4周待用。
[0090] 将步骤7中的功能缺失突变体及对照种植于镉污染盆，每盆6穴，每穴2株，三次重 复。于水稻成熟期，考察主要农艺性状，并鉴定糙米镉含量及其他相关矿质元素含量，结果 参见图2、图3。结果显示，oslctl糙米镉含量较对照显著降低，而其他相关金属元素并无显 著影响，该方法可用于水稻籽粒镉含量的分子改良。
[0091] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽 然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人 员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内 容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因 此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何 简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
【主权项】
1. 一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法，其特征在于，包括以下步骤： 51、 克隆水稻受体材料的OsLCTl的第三个外显子，测序； 52、 利用CRI SPR/Cas9系统，根据OsLCT 1第三个外显子序列选择靶标序列； 53、 构建含所述靶标序列片段的pCRISPR/Cas9重组载体； 54、 将所获得的pCRI SPR/Cas9重组载体导入水稻愈伤组织中得到转基因苗； 55、 筛选所述转基因苗中的转基因阳性植株； 56、 利用所述转基因阳性植株获得突变植株； 57、 将所述突变植株进行繁种，于后代植株中分离不含转基因成分的功能缺失突变体， 即为稻米镉含量降低的水稻。2. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述步骤S2中设计的靶标序列的的一 条链具有5 ' - (N) x-NGG-3 '结构，所述N表示A，T，C和G中的任意一个，所述X为19或20。3. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述靶标序列包括TPS1和TPS2,所述 TPS1的DNA序列为SEQIDN0.2所示的序列，所述TPS2的DNA序列为SEQIDN0.3所示的序 列。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的育种方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括以 下步骤： S3-1、根据靶标序列以及酶切位点信息，设计带粘性末端的接头引物； S3-2、酶切原始载体； S3-3、将所述带粘性末端的接头引物退火后连接到酶切过的原始载体上，得到重组的 gRNA表达盒； S3-4、将所述重组gRNA表达盒进行PCR扩增得到扩增产物； S3-5、酶切扩增产物，将酶切后的扩增产物连接到酶切过的pCRISPR/Cas9载体上得到 重组载体。5. 根据权利要求4所述的育种方法，其特征在于，所述步骤S3-1中所述接头引物包括 TSP1-F、TSP1-R、TSP2-F和TSP2-R，所述TPS1-F的DNA序列为SEQIDN0.4所示的序列，所述 TPS1-R的DNA序列为SEQIDN0.5所示的序列，所述TPS2-F的DNA序列为SEQIDN0.6所示的 序列 ；所述TPS2-R的DNA序列为SEQIDN0.7所示的序列。6. 根据权利要求4所述的育种方法，其特征在于，所述原始载体为pU3-gRNA或pU6a-gRNA。7. 根据权利要求4所述的育种方法，其特征在于，所述步骤S3-2中采用Bsa頂每切所述 原始载体。8. 根据权利要求4所述的育种方法，其特征在于，所述步骤S3-3中，所述带粘性末端的 接头引物位于所述表达载体的两个Bsa頂每切位点之间，形成重组的gRNA表达盒。9. 根据权利要求4所述的育种方法，其特征在于，所述步骤S3-5中，采用Bsa頂每切所述 扩增产物。10. 根据权利要求1、2、3、5、6、7、8和9中任一项所述的育种方法，其特征在于，所述步骤 S6步骤具体为:提取所述转基因阳性植株的DNA，进行PCR扩增得到扩增产物;对所述扩增产 物进行测序，选择两个等位OsLCTl均发生功能缺失突变的To代纯合突变体和双等位突变体 的植株作为突变植株。
【文档编号】C12N15/82GK105936907SQ201610269268
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】唐丽, 赵炳然, 李曜魁, 吕启明, 韶也, 毛毕刚, 胡远艺, 彭彦
【申请人】湖南杂交水稻研究中心