缺血性脑卒中的分子诊断标志物的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了缺血性脑卒中的分子诊断标志物，具体地该诊断标志物为PPIE，PPIE在缺血性脑卒中患者中表达下调，通过检测PPIE在受试者体内的表达水平，可以判断受试者是否患有缺血性脑卒中或者患缺血性脑卒中的概率。本发明提供了一种诊断缺血性脑卒中的产品，使用该产品可以实现缺血性脑卒中的早期诊断，从而降低因诊断不及时而导致的高死亡率。
【专利说明】
缺血性脑卒中的分子诊断标志物
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术领域，设及缺血性脑卒中的分子诊断标志物，具体地该标志 物为PPIE。
【背景技术】
[0002] 脑血管病与屯、血管病及肿瘤一起是严重危害人类健康的=大疾病之一，其具有高 发病率、高致残率与高死亡率的特点，同时也与屯、血管病及肿瘤一起是人类=大死亡原因 之一。脑血管病主要是由于脑组织血液循环障碍而导致局部神经功能缺失的神经系统疾 病，可分为急性脑血管病及慢性脑血管病。急性脑血管疾病又常被称为脑卒中，在美国，每 年约80万人患有脑卒中类疾病，且发病率随着年龄的增加而增加，运给其不断老年化的社 会带来严重的问题。在中国，脑血管病发病率逐年上升，已占据人口致死和致残原因的第一 位。近几年流行病学调查结果显示，我国每年新发脑卒中病例约有200万。而随着经济水平 的快速发展，我国人口老龄化问题的不断加重，W及不健康的生活方式等众多因素，使得缺 血性脑血管病发病率逐年增长。
[0003] 脑卒中又可分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中。缺血性脑卒中占全部脑卒中发病 率的80%左右，并且其发病率随年龄的增长而增高。缺血性脑卒中的发生主要是由于脑栓 塞及局部血栓的形成，运可能是由动脉粥样硬化引起的血管狭窄、血栓栓塞，或者是来源于 屯、脏的栓子随血流至脑部引起脑栓塞；而各种原因造成的血管损伤、血管炎症也是重要原 因之一。诸多原因引起脑部血液供应障碍，而造成受损脑组织的不可逆性损害，使得脑组织 缺血、缺氧导致最终坏死，给患者造成一系列的神经功能缺损和障碍。目前按照国际上公认 的最常用分型标准的分类方法，缺血性脑卒中疾病TOAST分型系统，可将缺血性脑卒中分为 5个亚型:大动脉粥样硬化型、屯、源性栓塞型、小动脉闭塞型及不明原因型。
[0004] 缺血性脑卒中是一种遗传和环境因素共同作用的复杂性疾病，随着人类基因组计 划的完成和分子遗传学的发展，基因的研究受到广泛重视，寻找疾病的基因标记物成为当 前研究的热点。今年来，越来越多研究认为，基因在缺血性脑卒中的发生发展过程中起着重 要的调控作用，因此基因与缺血性脑卒中发病风险的关系也备受关注。
【发明内容】
[0005] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，提供一种缺血性脑卒中的诊断标 志物；
[0006] 本发明的目的之二，提供一种诊断产品，实现缺血性脑卒中的早期诊断。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[000引本发明提供了检测PPIE基因的试剂在制备诊断缺血性脑卒中的产品中的应用。
[0009] 进一步，所述PPIE基因在缺血性脑卒中患者中表达下调。
[0010] 进一步，所述诊断缺血性脑卒中的产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检 、原位杂交或微阵列忍片诊断缺血性脑卒中的产品。
[0011] 进一步，所述用RT-PCR诊断缺血性脑卒中的产品至少包括一对特异扩增PPIE基因 的引物;所述用实时定量PCR诊断缺血性脑卒中的产品至少包括一对特异扩增PPIE基因的 引物;所述用免疫检测诊断缺血性脑卒中的产品包括:与PPIE蛋白特异性结合的抗体;所述 用原位杂交诊断缺血性脑卒中的产品包括:与PPIE基因的核酸序列杂交的探针;所述用微 阵列忍片诊断缺血性脑卒中的产品包括:蛋白忍片和基因忍片;其中，蛋白忍片包括与PPIE 蛋白特异性结合的抗体，基因忍片包括与PPIE基因的核酸序列杂交的探针。
[0012] 在本发明的一个【具体实施方式】中，所述用实时定量PCR特异扩增PPIE基因的引物 序列如沈Q ID NO.3和沈Q ID NO.4所示。
[0013] 进一步，所述诊断缺血性脑卒中的产品包括忍片和/或试剂盒;其中所述忍片包括 基因忍片、蛋白质忍片;所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒。
[0014] 本发明提供了一种诊断缺血性脑卒中的产品，所述的产品能够通过检测PPIE基因 的表达水平来诊断缺血性脑卒中。
[0015] 进一步，上面所述的产品包括忍片、或试剂盒。其中，所述忍片包括基因忍片、蛋白 质忍片;所述基因忍片包括固相载体W及固定在固相载体上的寡核巧酸探针，所述寡核巧 酸探针包括用于检测PPIE基因转录水平的针对PPIE基因的寡核巧酸探针;所述蛋白质忍片 包括固相载体W及固定在固相载体上的PPIE蛋白的特异性抗体;所述试剂盒包括基因检测 试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒;所述基因检测试剂盒包括用于检测PPIE基因转录水平的试 剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括PPIE蛋白的特异性抗体。其中，所述基因忍片可用于检测 包括PPIE基因在内的多个基因（例如，与缺血性脑卒中相关的多个基因）的表达水平。所述 蛋白质忍片可用于检测包括PPIE蛋白在内的多个蛋白质(例如与缺血性脑卒中相关的多个 蛋白质）的表达水平。通过将多个与缺血性脑卒中的标志物同时检测，可大大提高缺血性脑 卒中诊断的准确率。
[0016] 进一步，所述基因检测试剂盒用于特异性扩增PPIE基因引物对。
[0017] 进一步，所述用于扩增PPIE基因的引物对的序列如SEQ ID NO.3和沈Q ID NO.4所 /J、- O
[0018] 在本发明中，"抗体"覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性 抗体）、及抗体片段、组合抗体等，只要它们展现出期望的生物学活性即可。"单克隆抗体"指 从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除 了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体一般W极小量存在。此类单 克隆抗体典型的包括包含结合祀物的多肤序列的抗体，其中祀物结合多肤序列是通过包括 从众多多肤序列中选择单一祀物结合多肤序列在内的过程得到的。
[0019] 单克隆抗体还包括"嵌合"抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种 或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另 一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，W及此类抗体的片 段，只要它们展现出期望的生物学活性即可。
[0020] "抗体或抗体片段"指无论自天然生成抗体的任何物种衍生，还是通过重组DNA技 术创建;无论自血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌分离的抗体(例如IgG、IgM、IgA、 1神或1旨6)或片段(诸如化13少(曰13'）2少￥、二硫化物连接的。￥、3。。￥、闭合构象多特异性抗 体、二硫化物连接的scFv、双抗体）。
[0021] 在本发明中，术语"探针"指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的 分子。除非另有指出，术语"探针"通常指能通过互补碱基配对与另一多核巧酸(往往称为 "祀多核巧酸"）结合的多核巧酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全 序列互补性的祀多核巧酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式， 包括，但不限于:溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
[0022] 在本发明中，术语"微阵列"是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原 件诸如聚核巧酸探针(例如寡核巧酸)或结合剂(例如抗体）。所述基质可W是固体基质，例 如，玻璃或二氧化娃玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核巧酸序 列可W是DNA、RNA或其中的任何排列。
[0023] 各种探针阵列已经描述在文献中并且可W用于本发明上下文中检测可能与本文 所述表型相关的标志物。例如，DNA探针阵列忍片或较大的DNA探针阵列晶片（否则，可W通 过打断晶片而获得各个体忍片）用于本发明的一个实施方案。DNA探针阵列晶片一般包含玻 璃晶片，其上放置了高密度DNA探针(短DNA片段)阵列。运些晶片各自可W保持例如约6000 万个用于识别较长样品DNA序列（例如，来自个体或群体，例如，包含所关注的标志物）的DNA 探针。用玻璃晶片上的DNA探针组识别样品DNA通过DNA杂交进行。当DNA样品与DNA探针阵列 杂交时，样品结合于样品DNA序列互补的那些探针。通过评价个体样品DNA与那些探针更稳 固地杂交，有可能确定已知的核酸序列是否存在于样品中，由此确定核酸中发现的标志物 是否存在。还可W使用运一手段通过控制杂交条件W允许区别单一核巧酸，例如，用于SNP 鉴定和一种或多种SNP的样品基因分型来进行ASH。阵列提供了一种同时(或串连)检测多个 多态性标志物的便利性实施方案。
[0024] 上述探针具有与祀点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。运里，所谓"互补"， 只要是杂交即可，可W不是完全互补。运些多核巧酸通常相对于该特定的碱基序列具有 80 % W上、优选90 % W上、更优选95 % W上、特别优选100 %的同源性。运些探针可W是DNA， 也可W是RNA，另外，可W为在其一部分或全部中核巧酸通过?魁、1魁、6魁、6魁^魁等人工 核酸置换得到的多核巧酸。
[0025] 在本发明的上下文中，"PPIE基因"包括人PPIE基因W及人PPIE基因的任何功能等 同物的多核巧酸。PPffi基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中PPIE基因（NC_ 000001.11)DNA序列具有70% W上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；在本发明的 具体实施方案中，所述PPIE基因的编码序列是SEQ ID NO. 1所示的DNA序列。
[00%]本发明的PPIE基因可W是天然的或是人工合成的，或者使用可W表达PPIE的DNA 片段的载体转染细胞获得。所述载体所述载体包括病毒载体、真核表达载体。
[0027]病毒载体可W是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺 病毒相关病毒载体、瘤疹病毒(例如单纯瘤疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。 真核表达载体可W是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、PCDNA3.0表 达载体、PCDNA3.1表达载体、祀GFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载 体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如地in438、pCAMBIA1301等。
[00%]在本发明的上下文中，PPffi基因表达产物包括人PPIE蛋白W及人PPIE蛋白的部分 肤。所述PPIE蛋白的部分肤含有与缺血性脑卒中相关的功能域。
[0029]叩Pffi蛋白"包括PPIE蛋白W及PPIE蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括 PPIE蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱 导突变体、在高或低的严紧条件下能与人PPIE的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。在本发明 的【具体实施方式】中，所述PPIE蛋白是由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋 白质。
[0030] 通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。 本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、 缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相 似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
[0031] 在本发明的上下文中，"诊断缺血性脑卒中"既包括判断受试者是否已经患有缺血 性脑卒中、也包括判断受试者是否存在患有缺血性脑卒中的风险。
[0032] 本发明的优点和有益效果：
[0033] 本发明首次发现了 PPIE基因表达与缺血性脑卒中的发生发展相关，对于掲示缺血 性脑卒中的发病机理具有重要的意义
[0034] 本发明提供了诊断产品，通过检测血液中PPIE的表达水平，从而判断受试者是否 患有缺血性脑卒中、或者判断受试者是否存在患有缺血性脑卒中的风险，实现早发现早治 疗，降低缺血性脑卒中的致残率或死亡率。
【附图说明】
[0035] 图1显示利用QPCR检测PPIE基因在缺血性脑卒中患者中的表达情况.
[0036] 具体的实施方式
[0037] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。W下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York = Cold Spring化rborLaboratoiy Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0038] 实施例1筛选与缺血性脑卒中相关的基因标志物
[0039] 1、样品收集
[0040] 各收集10例正常人血液和缺血性脑卒中患者血液样本，上述所有标本的取得均通 过伦理委员会的同意。
[0041] 2、RNA样品的制备及质量分析
[0042] 2.1 RNA样品的制备
[0043] 使用Promega公司的RNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下：
[0044] 1)取Iml收集在肝素或邸TA处理过的试管中的全血，放进无菌离屯、管中；
[0045] 2)收集血细胞:300化pm(400g)离屯、5min，小屯、地从样品顶部吸走上清；
[0046] 3)加Iml血细胞裂解液，小屯、吸放4-5次，重悬沉淀物；
[0047] 4)3000巧 m 离屯、5min;
[0048] 5)重复步骤3)和4)两次(共=次）；
[0049] 6)避开细胞沉淀物，小屯、吸走几乎所有上清，只保留10化1上清液;确认一下BME已 经加到RNA裂解液中，然后加17化1 RNA裂解液到细胞中，吸放重悬并裂解细胞；
[(K)加]7)加35化1 RNA稀释液，颠倒混合3-4次；
[0化1] 8)置于70。(：水浴中3111111;
[0化2] 9)室溫下 13000g 离屯、IOmin;
[0053] 10)将清亮裂解物转移到一支无菌离屯、管中；
[0054] 11)向澄清裂解液中加入20化1 95 %乙醇，用移液枪吸放3-4次W混合;将此混合 物转移到离屯、柱装配体中，13000g离屯、Imin;
[0055] 12)从离屯、柱装配体上拿下离屯、柱，弃去收集管中的液体，将离屯、柱装回到收集管 上，确认一下RNA Wash Solution已用乙醇稀释，加600]il RNA洗涂液于离屯、柱装配体， 13000g 离屯、Imin;
[0056] 13)弃去收集管中的液体，将离屯、柱装回到收集管上，将50iil新鲜制备的D化Se解 育混合物直接加到离屯、柱内的膜上；
[0化7] 14)室溫下解育15min，向离屯、柱中加入20化1 DNA酶终止缓冲液（确认已加入乙 醇），13000g离屯、Imin;
[0化引 15)加入60化1 RNA洗涂液（已加入乙醇），13000g，离屯、Imin;
[0化9] 16)清空收集管，向离屯、柱内加入25化1 RNA洗涂液(已加入乙醇），高速离屯、2min;
[0060] 17)将离屯、柱从收集管上转移到洗脱管上，向膜上加10化1无核酸酶水，将离屯、柱 装配体放进离屯、机并使洗脱管的盖子朝外，13000g离屯、Imin，丢弃离屯、柱，盖好盛有RNA的 洗脱管，存于-70°C。
[0061 ] 2.2 RNA样品的质量分析(Nano化OP1000分光光度计）
[0062] NanoDroplOOO分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求:0D260/0D280为 1?8-2?2d
[0063] 2.3 RNA样品的质量分析（Agilent Technologies 2100Bioanalyzer)
[0064] 将上述提取的R N A进行琼脂糖凝胶电泳，A g i I e n t T e C h n O I O g i e S 2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28S rRNA和18S rRNA主带明显、无降解、RNA完整 性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序CDNA文库构建的要求，可W用于文库构建及 测序。
[0(?日]3、高通量转录组测序
[0066] 3.1 RNA-seq 读段定位
[0067] 首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用Top化t Vl. 3.1将清洁片段与 UCSC H. sapiens参考基因组化gl9)进行匹配，H. sapiens UCSC hgl9版的预先构建的索引 从Top化t主页下载，并作为参考基因组，利用Top化t与基因组匹配时，允许每个读段(默认 到20)有多个匹配位点，最多2次错配。Top化t根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的 剪切位点库，根据运些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用 Top化t方法的系统默认参数。
[006引3.2转录丰度评估
[0069]匹配上的读段文件通过Cufflinks vl.0.3处理，Qifflinks vl.0.3将RNA-seq片 段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定 基因化b长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。 Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载（Homo_ sapiens.GRQi37.63.gtf)。
[0070] 3.3差异表达基因的检测
[0071 ] 将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff， Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表 达。在化ffi壯巧俞出中只有q值<0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
[007^ 4、结果
[0073] RNA-seq结果显示，PPIE基因在缺血性脑卒中患者血液中的表达量显著低于正常 人的表达量。
[0074] 实施例2 QPCR测序验证PPIE基因的差异表达
[0075] 1、根据高通量测序的检测结果选择PPIE基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1 中的样本收集方式选择缺血性脑卒中患者血液和正常人血液各80例。
[0076] 2、1?^4提取步骤同实施例1。
[0077] 3、逆转录:使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下：
[0078] (1)取总RNA 2iig进行逆转录，加入Oligo(dT)，充分混匀；70°C水浴;5min后立 即冰浴2-3min;
[0079] (2)构建反应体系，其中包括5X逆转录缓冲液扣l，dNTP(2.5mM)扣l，RNasin 40UAU ,M-MLV 200UAU，补无核酶水至;
[0080] (3) 42 °C 水浴 60min 后，95 °C 水浴 5min W 灭活 M-MLV;
[0081 ] (4)-20°C 储存备用。
[0082] 4、QPCR 扩增
[0083] (1)引物设计
[0084] 根据Genebank中PPIE基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生 工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
[00化]PPIE基因：
[0086] 正向引物为5'-TCACAGATATTCAGATTC-3'（沈Q ID N0.3);
[0087] 反向引物为5'-CCTTCCTTAATTCTCATT-3'（沈Q ID N0.4)。
[0088] GAPDH 基因：
[0089] 正向引物为5'-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3'（SEQ ID N0.5);
[0090] 反向引物为5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（沈Q ID N0.6)。
[0091] (2)按照表1配制PCR反应体系：
[0092] 其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
[0093] 表1 PCR反应体系
[0094]
[0095]
[0096] (3)PCR反应条件:95°C IOmin，（95°C 15s，60°C60s) X 45个循环。WSY服 Green作为 巧光标记物，在Li曲t切cler巧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确 定目的条带，A A CT法进行相对定量。
[0097] 5、统计学方法
[0098] 实验采用3次重复实验，结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示，使用 SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统 计学意义。
[0099] 6、结果
[0100] 结果如图1所示，与正常人血液相比，PPIE基因在缺血性脑卒中患者血液中的表达 下调，差异具有统计学意义(P<〇. 05)，同RNA-S巧结果一致。
[0101] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核屯、思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行若干改进 和修饰，运些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 检测PPIE基因的试剂在制备诊断缺血性脑卒中的产品中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PPIE基因在缺血性脑卒中患者中表达 下调。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断缺血性脑卒中的产品包括:通过 RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或微阵列芯片诊断缺血性脑卒中的产品。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断缺血性脑卒中的 产品至少包括一对特异扩增PPIE基因的引物。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述特异扩增PPIE基因的引物序列如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示。6. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述诊断缺血性脑卒中的产品包括芯片 和/或试剂盒，其中所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片;所述试剂盒包括基因检测试剂盒 和蛋白免疫检测试剂盒。7. -种诊断缺血性脑卒中的产品，其特征在于，所述的产品能够通过检测PPIE基因来 诊断缺血性脑卒中。8. 根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、或试剂盒;其中，所述 芯片包括基因芯片、蛋白质芯片;所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒。9. 根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述基因检测试剂盒用于特异性扩增PPIE 基因引物对。10. 根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述用于扩增PPIE基因的引物对的序列 如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示。
【文档编号】G01N33/68GK105925713SQ201610509640
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月1日
【发明人】杨承刚, 边洋, 宋宏涛
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司