弱毒力cmv载体表达抗性基因增强植物抗除草剂性能的应用
【专利摘要】本发明公开了一种黄瓜花叶病毒弱毒力载体表达抗除草剂基因在增强植物抗除草剂性能方面的应用。黄瓜花叶病毒弱毒力载体的构建方法包括如下步骤：1)、改造病毒CMV成缺失2b基因序列的弱病毒表达载体；具体为：将已构建好的病毒CMV侵染性克隆质粒之一pCB?CMVF209采用酶切连接的方法改造，使2b基因缺失，并加入酶切位点，构建成为弱毒力的病毒表达载体???弱病毒载体；2)、将抗除草剂基因编码区(ORF)序列插入步骤1)所得的弱病毒载体构建重组病毒表达载体；构建所得的含抗除草剂基因编码区序列的重组弱病毒表达载体用于增强植物对除草剂的抗性。
【专利说明】
弱毒力CMV载体表达抗性基因増强植物抗除草剂性能的应用
技术领域
[0001] 本发明设及病毒载体的用途，特别是黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗除草 剂性能方面的应用。
【背景技术】
[0002] 现有研究开发的植物病毒载体可分为=种用途:一是主要用于表达药用蛋白、抗 体等；二是用于分析或利用外源基因功能;=是用于病毒诱导的基因沉默分析被沉默基因 的功能。在病毒载体用于外源蛋白表达的研究方面，早期研究开发病毒载体的目的主要用 于外源蛋白表达。利用植物病毒载体表达外源基因的方法主要有两种:一是在体外转录携 带目的基因的侵染性CDNA克隆，将病毒基因组CDNA进行基因取代、插入融合等[W，外源基 因被加入后，便置于原核启动子下游，然后W其转录物RNA直接侵染植物或者用基因枪的方 法将病毒载体转入植物中完成侵染，接种植物后病毒在寄主细胞内自主增殖进行外源基因 的表达[is];二是将侵染性病毒的基因组CDNA克隆插入到Act2、CaMV35S转录启动子等下游 构建携带目的基因的侵染性重组病毒体，采用农杆菌转化法浸润接种植物，从而在寄主细 胞内完成一系列转录、合成及装配过程，实现外源基因的表达过程。Marillonnet等在前人 的基础上建立了农杆菌浸润接种技术，便使得病毒载体用于外源蛋白表达达到了一个令人 满意的水平，使外源蛋白的表达又踏上了一个新台阶。至今用于表达药用蛋白的主要病 毒载体及表达的药用蛋白或抗原如下班豆花叶病毒（cowpea mosaic virus,CPMV) 表达的口蹄疫病毒(FMDV)VPl抗原、人免疫缺陷病毒化IV-l)gp41抗原、人鼻病毒化RV-14) 抗原、犬细小病毒（CPV)抗原、慢性肺炎病菌（Pseudom aeruginosa)外层腊蛋白F抗原、 s1:ahylococ州S aureus D2domain肤、追疾抗原、水貂肠炎病毒(MEV)抗原、对传染性肠胃炎 病毒(TGEV)具有特异性小分子免疫蛋白（SIP)、乙型肝炎病毒核屯、抗原化BcAg) dTMV载体表 达的有血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、流感病毒血凝素、人免疫缺损病毒化IV-I)抗原、 追疾抗原、鼠带状疮疹ZP3糖蛋白、口蹄疫病毒(FMDV)VPl抗原、a-天花粉蛋白、38C13鼠 B细 胞淋己瘤单链抗体、肠癌病毒单抗、口蹄疫病毒(FMDV)VPl、牛抱疹病毒I型(BHV-l)gDC、猪 传染性腹泻病毒(PEDV)中和表位;TBSV表达的人免疫缺损病毒化IV-I )V3环抗原、犬细小病 毒(CPV)抗原;PVX载体表达的有人免疫缺损病毒化IV-l)gp41抗原、轮状病毒VP6抗原、人类 乳突病毒16化PV-16化7蛋白抗原、人乳铁蛋白帅十、人粒细胞巨隧细胞集落剌激因子(GM- CSF)、肺结核抗原ESAT-6; ALMV载体表达的有呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白抗原;PPV病毒载 体表达的兔出血热病毒（R皿V)VP60抗原；S叶草黄脉病毒Clover yellow vein virus (ClYVV)载体表达可溶性甲烧单加氧酶C亚单位(sMMO-C);CMV载体表达的aFGF蛋白等。在病 毒载体用于分析或利用外源基因功能方面，植物病毒载体除了用于表达疫苗抗原、抗体和 药用蛋白生产外，还可用于表达外源基因，分析基因功能，分析外源蛋白与植物中蛋白质的 相互作用。例如，含番茄叶霉病菌avr9无毒基因的PVX重组表达载体通过农杆菌浸润接种带 有抗病(R)基因 cf-9的番茄植株叶，番茄植株会发生过敏反应，表明R基因表达的产物可与 av巧基因产物发生了直接的相互作用EW。植物病毒载体也可用于植物利用外源基因的功 能。511611等[1叫尋抗除草剂草下麟的基因 Bar插入到双生病毒玉米线条病毒(MSV)中，再利用 农杆菌介导的方法来侵染玉米，就能在玉米植株表达而出现抗除草剂的性状。但该病毒载 体接种后仍保持原病毒的特性，对玉米植株依然产生致病性，因此没有用于生产实际中的 前景。在病毒载体用于分析被沉默基因的功能方面，病毒介导的基因沉默(VIGS)是根据植 物对RNA病毒独特的防御机制发展而来的一种技术，因其操作简便、效率高、周期短、避免植 物转化、克服基因重复等特点，可W在不同的遗传背景下工作，对基因的分析更清楚，渐渐 成为了研究植物基因功能的一种有效方法。在正向遗传学及反向遗传学发现和鉴定基因功 能的研究方面发挥着重要的作用，越来越多的植物病毒被改造成有效的沉默载体，在植物 生长发育、抗逆、信号转导等功能研究方面取得了显著的进展^^。1997年，化n肪111111611等[21] 最早对VIGS进行了定义，最初的意义是用来描述植物收病毒侵染后产生的症状恢复现象。 后来，VIGS专指利用重组病毒载体携带外源基因侵染植物后，随着病毒的复制和移动特异 性的诱导植物沉默自身内源基因的一种现象^22'23^。1995年，Kumagai^W等人，W烟草花叶病 毒(Tobacco mosaic virus,TMV)为载体进行改造，他在TMV中插入了一段从烟草cDNA反转 录出来的（phytoene desaturase，PDS)序列，利用运个携带PDS序列的病毒载体侵染烟草 后，植物出现系统性稱绿的光漂白现象，同时PDS的mRNA水平也出现显著性降低。结果说明 植物出现漂白现象是由于PDS表达水平下降导致的，而PDS是类胡萝h素合成过程中的关键 酶，对植物有着光保护作用。1998年，Ruiz等口5]采用PVX马铃馨X病毒(Potato X virus)载 体携带PDS的序列的方法，也引发植物出现了相同的光漂白现象。后来，人们利用改造的 VIGS载体对植物进行目的性的基因沉默，抑制内源基因的表达，从而达到研究植物基因功 能的作用。1998年，Kjemtrup等利用双生病毒科的番茄金色花叶病毒(STMV)为VIGS载体 插入儀离子馨合酶（magnesium chelatase)的关键基Su(Sulfur)和转巧光蛋白基因 Iuc (Iuciferase)，从而引起了植物出现叶片黄化和转Iuc植物不再发出巧光的表型。2001年， Ratcliff等口7]，报道了 W烟草脆裂病毒TRV构建的VIGS载体，相比于PVX、TMV、TGMV有许多 优点，其中TRV的VIGS载体相比于PVX对植物的症状影响较轻，并且在沉默效率、侵染范围、 持久性方面都比PVX更加完善。2002年，Liu等啼j用烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus, TRV)在番茄中进行了 VIGS试验，可W对已经公布的番茄EST文库进行功能研究分析。 目前，TRV是应用范围最广的VIGS病毒载体，不仅其诱导植物的沉默效率高，而且更容易诱 导分生组织的基因沉默，目前在烟草、番茄等茄科植物中均有大量的报道。最初由Ratcliff 等口7]构建的版本，Liu等口9]的pYL156、p化279修改版本、W及化1611*1116等 [^]构建的TRV-2b 版本。其中，的PYL156和PYL279版本，为了使病毒大量的在植株内扩增，该病毒还 加入了2个35S启动子，并且在C端还加入了核酶。而TRV-2b的版本病毒载体中含有TRV RNA2 中的化序列。目前,TRV的病毒载体已在番茄、烟草、棉花(Gossypium spp.)、牵牛花UU、拟 南芥和磐粟(opium poppy)"2]等多种植物上被应用。2002年，化Izberg等U3呀Ij用大麦条纹 花叶病毒BSMV携带PDS片段，成功引起了大麦的白化现象，抑制了大麦PDS基因的表达，运是 首次利用VIGS载体在单子叶植物上实现了基因沉默。2006年，Ding等[343用雀麦花叶病毒 (Brome mosaic virus,BMV)进行改造，同样成功的在水稻、玉米等单子叶植物中完成了对 基因沉默的研究。但现有病毒载体由于对寄主植物本身具有致病作用，因而不能用于表达 抗除草剂基因增强植物的抗除草剂性能。
[0003]上文设及的参考文献具体如下：
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[0026] 综上所述，我们发现，植物病毒载体在用于在增强植物抗除草剂性能方面的应用 仅仅有一篇报道，且由于该病毒载体本身对植物有致病作用，而没有应用潜力。黄瓜花叶病 毒载体在增强植物抗除草剂性能方面的应用没有报道，黄瓜花叶病毒弱毒力载体在通过表 达抗除草剂基因增强植物抗除草剂性能方面的没有报道。
【发明内容】
[0027] 本发明要解决的技术问题是提供一种黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗除 草剂性能方面的应用。
[0028] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种黄瓜花叶病毒弱毒力载体表达抗除草剂 基因在增强植物抗除草剂性能方面的应用。
[0029] 作为本发明的黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗除草剂性能方面的应用的 改进：
[0030] 所述黄瓜花叶病毒弱毒力载体的构建方法包括如下步骤：
[0031] 1)、改造病毒CMV成缺失化基因序列的弱病毒表达载体;具体为：
[0032] 将已构建好的病毒CMV侵染性克隆质粒之一 PCB-CMVF209采用酶切连接的方法改 造，使化基因缺失，并加入酶切位点，构建成为弱毒力的病毒表达载体---弱病毒载体；
[0033] 2)、将抗除草剂基因编码区（ORF)序列插入步骤1)所得的弱病毒载体构建重组病 毒表达载体；
[0034] 构建所得的含抗除草剂基因编码区序列的重组弱病毒表达载体用于增强植物对 除草剂的抗性。
[0035] 作为本发明的黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗除草剂性能方面的应用的 进一步改进：
[0036] 所述步骤1)中的酶切位点为:SUi I、Mlu I、Spe I、Apa I、BamH I、Sac II。
[0037] 作为本发明的黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗除草剂性能方面的应用的 进一步改进：
[0038] 所述步骤1)具体包括如下步骤：
[0039] ①、WCMV序列为模板，设计加酶切位点的正、反向引物；
[0040] 加酶切位点化O I的正向引物化oIF2:CATGCcatggctgagtttgcctg;
[0041 ]加酶切位点Stu I的反向引物2a0RFlR:gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttgg;
[0042] W质粒PCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，纯化，WNco I、SUi I酶切PCR 产物，纯化，备用。
[0043] ②、选择Stu IW及Mlu I、Spe I、Apa I、BamH I、Sac II中至少1个酶切位点加入 正向引物的5'；设计在5'加入Avr II酶切位点的反向引物；
[0044] 所述正向引物：GAAGGCCTGACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcggAACctccccttccgc atet(为化0RF333F);或由GAAGGCCT与序列GACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcgg中的至少 1个酶切位点的序列与序列AACctccccttccgcatct组成；
[0045] 所述反向引物为AvrIIR: Cttccgaagaaacctaggag;
[0046] W质粒PCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，纯化，Wstu I、Avr II酶切PCR 产物，纯化；
[0047] ③、W化O I、Avr II酶切质粒PCB-CMVF209;
[004引④、采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠 杆菌感受态D册a;
[0049] ⑤、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用Nco I、Avr II酶切鉴定和PCR鉴定(最后送测序公司测序鉴定，分析，）得到构建正确的质粒pCB- CMVF209-no2b。保存备用。
[0050] 作为本发明的黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗除草剂性能方面的应用的 进一步改进：
[0051] 所述步骤2)具体包括如下步骤：
[0052] ①、设计加酶切位点Stu I的正向引物，设计加酶切位点Mlu I的反向引物；W含目 的基因的质粒(例如pMDl8-gene)为模板，PCR扩增合成目的基因，纯化PCR产物，WStu I、 Mlu I酶切PCR产物，纯化；
[0化3]②、Wstu I、Mlu I酶切质粒pCB-CMVF209-no2b;
[0054] ③、采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠 杆菌感受态D册a;
[0055] ④、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用Stu I、Mlu I酶切鉴定和PCR鉴定(最后送测序公司测序鉴定，分析），得到构建正确的质粒pCB- CMVF209no2b-gene (例如为pCB-CMVF209no2b-bar)。保存备用。
[0化6] 本发明利用黄瓜花叶病毒cucumber mosaic Virus(CMV)改造成对植物没有致病 性的弱病毒表达载体，应用于表达抗除草剂基因，增强植物抗除草剂性能。
[0057]本发明总的具体方案如下：
[005引1、将已构建好的病毒CMV侵染性克隆质粒之一 PCB-CMVF209采用酶切连接的方法 (具体点)改造，使化基因缺失，并加入酶切位点，构建成为弱毒力的病毒表达载体。具体地： [0化9] (1) Wcmv序列为模板，设计加正、反向引物。NcoIF2: CATGCcatggctgagtttgcctg; 2aORFlR: gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttgg。W 质粒 pCB-CMVF209 为模板，PCR 扩增合成 PCR产物，W化O I、Stu I酶切PCR产物，纯化，备用。
[0060] (2)选择5化1^及肌111、5口6 1、4口曰1、8曰恤1中至少1个酶切位点加入正向引物 的5'，形如2b0RF333F:GAAGGCCTGACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcggAACctccccttccgcat Ct;设计在5'加入Avr II酶切位点的反向引物AvrIIR:Cttccgaagaaacctaggag。W质粒pCB- CMVF209为模板，PCR扩增，纯化PCR产物，WStu I、Avr II酶切PCR产物，纯化，备用。
[0061] (3)^化〇1、4￥'11酶切质粒9〔8-〔1￥。209，备用。
[0062] (4)采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠 杆菌感受态D册a。
[0063] (5)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用化O 1、 Avr II酶切鉴定和（或）PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，得到构建正确的质粒pCB- CMVF209-no2b，保存备用。
[0064] 2、将抗除草剂基因编码区(0RF，应小于7(K)bp)序列插入弱病毒载体构建重组病毒 表达载体。具体地：
[0065] (1)、W抗除草剂基因编码区（ORF)序列为基础，设计加酶切位点Stu I或Mlu I或 Spe I或Apa I或BamH I的正向引物，加酶切位点Mlu I或Spe I或Apa I或BamH I或Sac II 的反向引物(但反向引物所加酶切位点必须是在正向引物所加的酶切位点的后一个酶切位 点）；W含目的基因的质粒(例如pMD 18-gene，质粒pMD 18-gene构建：由NCBI库中可查得目的 基因序列，由基因合成公司合成，构建成质粒pMD18-gene;或者由目的该基因的来源植物或 微生物通过化izol法提取总RNA，按RT-PC时式剂盒说明书，W目的基因的正向引物和反向引 物做RT-PCR获得，然后按PMD18载体使用说明书操作构建成质粒pMD18-gene)或总RNA的反 转录产物为模板，PCR扩增目的基因，酶切PCR产物，纯化，备用。
[0066] (2似与2. (1)相同的酶酶切质粒pCB-CMVF209-no2b，备用。
[0067] (3)采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠 杆菌感受态D册a。
[0068] (4)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用与 2. (1)相同的酶酶切鉴定，并进行PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，得到构建正确的质粒 pCB-CMVF209no2b-gene，保存备用。
[0069] 3、将含抗除草剂基因 ORF的重组弱病毒表达载体PCB-CMVF20化o2b-bar转化农杆 菌，具体方法是公知方法。
[0070] 4、质粒农杆菌浸润法将 pCB-CMVF209no2b-gene、pCB-CMVF109、pCB-CMV309 质粒农 杆菌混合，浸润接种4-6叶龄植物苗叶，具体方法是公知方法。
[0071] 5、接种苗室溫培养5-8天后，即可按常规苗管理。
[0072] 6、在已接种的植物上在生长期喷施除草剂40%草下麟100倍液或200倍液，即可发 现植物对除草剂产生了抗性。而没接种含bar基因的重组弱病毒的植株则在喷施除草剂后 先萎黨、后枯死。
[0073] 在本发明中，
[0074] 质粒pMD18-gene构建：由NCBI库中可查得目的基因序列，由基因合成公司合成，构 建成质粒pMD18-gene;或者由目的该基因的来源植物或微生物通过化izol法提取总RNA，按 RT-PCR试剂盒说明书，W目的基因的正向引物和反向引物做RT-PCR获得，然后按pMD18载体 使用说明书操作构建成质粒pMD18-gene。
[OO巧]pMD 18 -bar的构建方法也可参照上述进行；例如bar基因序列从NCBI核酸库中查 得，经基因合成公司合成，构建成pMDlS-bar。
[0076] 本发明的优点
[0077] 1、构建了一个含有抗除草剂基因的载体pCB-CMVF209no化-gene,其具有对作物无 致病力的性能，能用于作物抗除草剂。
[0078] 2、将该载体PCB-CMVF20化o2b-bar导入植株后，能显著增强植物对目标除草剂的 抗性。
[0079] 3、本发明构建了一个含有抗除草剂基因的CMV重组弱病毒株，对植物无致病症状 且可在烟草属植物中长距离移动。
【附图说明】
[0080] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0081 ]图1为各案例的实验结果对比图。
【具体实施方式】
[0082] 实施例1:
[0083] 1、改造病毒CMV成缺失化基因序列的弱病毒表达载体;具体包括如下步骤：
[0084] (1) WCMV序列为模板设计正、反向引物。
[00化]加酶切位点化O I的化oIF2: CATGCcatggctgagtttgcctg;
[00化]加酶切位点Stu I的2a0RFlR: gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttgg〇
[0087] W质粒PCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，WNco I、Stu I酶切PCR产物， 纯化,备用。
[0088] 所述PCR扩增体系为： IOxbu (Tcr 5[il dclH20 37.5^1 dNTPS 4^1 pCB-CMVF209 l|al
[0089] Nco !F2 叫 2aORFlR lu! Pyi'obesr 化 q O.Sjj! 总体积 -----------------------------5(叫
[0090] 所述PCR扩增程序为： 94 °C 3min 94 C 30scc~'| 56'C 3Oscg ^ 35cvclcs
[0091] irC 60 sec J ITC 8min 4°G forev 巧。
[0092] 注:质粒PCB-CMVF209,是CMVF209序列的侵染性克隆，具体构建方法见中国农业科 学2011,44(14):3060-3068。
[009引 （2)设计加酶切位点Stu I、Mlu I、BamH I的正向引物2b0RF333F: G AAGGCCTGACGCGTGACT AG TGGATCC AA Cctccccttccgcatct;反向弓| 物 2bAvrIIR: Cttccgaagaaacctaggag。W 质粒pCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，Wstu I、Avr II酶切PCR产物，纯化，备用。
[0094] 所述PCR扩增体系为：
[0095]
[0096]
[0097]
[0098] (3)^化〇1、4￥'11酶切质粒9〔8-〔1￥。209，备用。
[0099] (4)采用T4-DNA连接酶试剂盒将步骤（1)、步骤(2)的酶切PCR产物同时与步骤(3) 所得的酶切质粒的产物连接，转化大肠杆菌感受态D册a。
[0100] (5)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用化O I、Avr II酶切鉴定和PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，得到构建正确的质粒pCB- CMVF209-no2b，保存备用。
[0101] 2、将抗除草剂基因 baHNCBI ID:X05822)编码区（ORF)序列插入弱病毒载体构建 重组病毒表达载体;具体如下：
[0102] (1)、设计加酶切位点Mlu I 的正向引物BarMluF: cgAcgcgtatgagcccagaacgacgcc ； 加酶切位点BamH I的反向引物Ba:rBamR: CGggatcctcagatctcggtgacgggca。W含bar基因的 质粒pMD18-bar(bar基因序列从NCBI核酸库中查得，经基因合成公司合成，构建成PMD18- bar)为摇版.PCR扩蜡合成曰的甚巧序列.述化.WMl 1] T、RamH T酶切PCR产物，纯化，备用。
[0103]
[0104] 所述PCR扩增程序与上述步骤1 (1)相同。
[01 化](2)、WM1u I、BamH I酶切质粒pCB-CMVF209-no2b，备用。
[0106] (3)、采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大 肠杆菌感受态D册a。
[0107] (4)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用Mlu I、BamH I酶切鉴定和PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，得到构建正确的质粒pCB- CMVF209no2b-bar 保存备用。
[0108] 3、采用常规方法，将含bar基因的重组弱病毒表达载体pCB-CMVF209no化-bar转化 农杆菌。
[0109] 4、质粒农杆菌浸润法将 pCB-CMVF209no2b-bar、pCB-CMVF109、pCB-CMV309(pCB- CMVF109、pCB-CMV309具体构建方法见中国农业科学2011，44( 14): 3060-3068)质粒农杆菌 混合，浸润接种(公知方法)4-6叶龄植物苗叶。
[0110] 5、接种苗室溫培养5-8天后，即可按常规苗管理。
[0111] 6、在已接种的植物上在生长期喷施除草剂40%草下麟100倍液，5、10天后观察，已 接种的植物生长正常，即植物对除草剂草下麟产生了抗性。实验结果图如图1所示。
[0112] 实施例2、
[0113] 1、改造病毒CMV成缺失化基因序列的弱病毒表达载体。
[0114] (1)、WCMV序列为模板设计正、反向引物。加酶切位点Nco I的NCOIF2: CATGCcatggctgagtttgcctg;加酶切位点Stu I 的2a0RFlR: gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgttt gttg。W质粒PCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，WNco I、Stu I酶切PCR产物，纯 化，备用。
[0115] (2)、设计加酶切位点 Stu I、Spe I、Apa I、BamH I 的正向引物 2b0RF333F: GAAGGCCTGGACTAGTgggcccGGGATCCAACctccccttccgcatct;反向引 物2bAvrIIR: Cttccgaagaaacctaggag。W 质粒PCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，WStu I、Avr II酶切PCR产物，纯化，备用。
[0116] (3)、^化〇1、4￥'11酶切质粒9〔8-〔1￥。209，备用。
[0117] (4)、采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大 肠杆菌感受态D册a。
[0118] (5)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用化O I、Avr 11酶切鉴定和PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，得到构建正确的质粒pCB- CMVF209-no2b，保存备用。
[0119] 2、将抗除草剂基因 bar编码区（ORF)序列插入弱病毒载体构建重组病毒表达载体。 具体地：
[0120] (1 )、设计加酶切位点Spe I的正向引物BarSpeF:gactagtatgagcccagaacgacgcc； 加酶切位点BamH I的反向引物Ba:rBamR: CGggatcctcagatctcggtgacgggca。W质粒pMD18_ bar为模板，PCR扩增合成PCR产物，WSpe I、BamH I酶切PCR产物，纯化，备用。
[0121 ]备注说明：该PCR扩增体系及扩增程序参照实施例1步骤2的（1)。
[0122] (2)WSpe I、BamH I酶切质粒pCB-CMVF209-no2b，备用。
[0123] (3)采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠 杆菌感受态D册a。
[0124] (4)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用Spe I、BamH I酶切鉴定和PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，得到构建正确的质粒pCB- CMVF209no2b-bar，保存备用。
[01巧]3、采用常规方法，将含bar基因的重组弱病毒表达载体pCB-CMVF209no2b-bar转化 农杆菌。
[01%] 4、质粒农杆菌浸润法将 pCB-CMVF209no 化-bar、pCB-CMVF109、pCB-CMV309 质粒农 杆菌混合浸润接种4-6叶龄植物苗叶。
[0127] 5、接种苗室溫培养5-8天后，即可按常规苗管理。
[01%] 6、在已接种的植物上在生长期喷施除草剂40%草下麟200倍液，5、10天后观察，已 接种的植物生长正常，即植物对除草剂产生了抗性。实验图结果如图1所示。
[0129] 实施例3:
[0130] 1、改造病毒CMV成缺失化基因序列的弱病毒表达载体。
[01別](I)WCMV序列为模板设计正、反向引物。加酶切位点Nco I的NcoIF2: CATGCcatggctgagtttgcctg;加酶切位点Stu I的2a0RFlR: gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgttt gttg。W质粒PCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成目的基因序列，纯化PCR产物，WNco I、Stu I酶切PCR产物，纯化，备用。
[0132] (2)设计加酶切位点Stu I、Mlu I、Spe I、Apa I、BamH I、Sac II的正向引物 2b0RF333F:GAAGGCCTGACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcggAACctccccttccgcatct;反向引 物化AvrIIR:Cttccgaagaaacctaggag。W质粒PCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，W Stu I、Avr II酶切PCR产物，纯化，备用。
[0133] (3)^化〇1、4￥'11酶切质粒9〔8-〔1￥。209，备用。
[0134] (4)采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠 杆菌感受态D册a。
[0135] (5)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用化O I、Avr II酶切鉴定和PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，将构建正确的质粒PCB-CMVF209- no化保存备用。
[0136] 2、将抗除草剂基因bar编码区（ORF)序列插入弱病毒载体构建重组病毒表达载体。 具体地：
[0137] (1 )、设计加酶切位点Stu I的正向引物BarStuF:aaggcctatgagcccagaacgacgcc ； 加酶切位点Mlu I的反向引物BarMluR: cgAcgcgtagatctcggtgacgggca。W质粒pMDlS-bar为 模板，PCR扩增合成PCR产物，Wstu I、Mlu I酶切PCR产物，纯化，备用。
[013引（2)WStu I、Mlu I酶切质粒pCB-CMVF209-no2b，备用。
[0139] (3)采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠 杆菌感受态D册a。
[0140] (4)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用Stu I、Mlu I酶切鉴定和PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，将构建正确的质粒pCB- CMVF209no2b-bar 保存备用。
[0141] 3、采用常规方法，将含bar基因的重组弱病毒表达载体pCB-CMVF209no化-bar转化 农杆菌。
[0142] 4、质粒农杆菌浸润法将 pCB-CMVF209no 化-bar、pCB-CMVF109、pCB-CMV309 质粒农 杆菌混合浸润接种4-6叶龄植物苗叶。
[0143] 5、接种苗室溫培养5-8天后，即可按常规苗管理。
[0144] 6、在已接种的植物上在生长期喷施除草剂40%草下麟100倍液倍液，5、10天后观 察，已接种的植物生长正常，即植物对除草剂产生了抗性。实验结果图如图1所示。
[0145] 对照例1:
[0146] 1、4-6叶龄烟草植株，不接种任何液体，同样培养5-8天。
[0147] 2、在生长期喷施除草剂40%草下麟200倍液，药后5天萎黨，药后10天已明显枯死。 实验结果图如图1所示。
[014引对照例2:
[0149] 1、改造病毒CMV成缺失化基因序列的弱病毒表达载体。
[0150] 同实施例1。
[0151] 2、将非抗除草剂基因PvSR2(NCBI ID:PV呪4704)编码区（ORF)序列插入弱病毒载 体构建重组病毒表达载体。具体地：
[0152] (1)、设计加酶切位点Stu I的正向引物MluPvSR2F: cgACGCGTAtgcgttgcgccatcctc t;加酶切位点Mlu I的反向引物BamHPvSR2R: CGggatcctcaatttccactgaagactttg。W质粒 pMD18-PvSR2为模板，PCR扩增目的基因序列，纯化PCR产物，Wstu I、Mlu I酶切PCR产物，纯 化，备用。
[0153] (2)WM1u I、BamH I酶切质粒pCB-CMVF209-no2b，备用。
[0154] (3)采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠 杆菌感受态D册a。
[0155] (4)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用Mlu I、BamH I酶切鉴定和PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，将构建正确的质粒pCB- CMVF209no2b-PvSR2 保存备用。
[0156] 3、采用常规方法，将含PvSR2基因的重组弱病毒表达载体PCB-CMVF20化o2b-PvSR2 转化农杆菌。
[0157] 4、质粒农杆菌浸润法将 PCB-CMVF20 化 o2b-PvSR2、pCB-CMVF109、pCB-CMV309 质粒 农杆菌混合浸润接种4-6叶龄植物苗叶。
[0158] 5、接种苗室溫培养5-8天后，即可按常规苗管理。
[0159] 6、在已接种的植物上在生长期喷施除草剂40%草下麟200倍液，5、10天后观察，药 后5天萎黨，药后10天已明显枯死。实验图结果如图1所示。
[0160] 对照例3:
[0161] 1、改造病毒CMV成缺失化基因序列的弱病毒表达载体。
[0162] (1) Wcmv序列为模板设计正、反向引物。NcoIF2 : CATGCcatggctgagtttgcctg; 2a0RFlR: gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttg。W 质粒 pCB-CMVF209 为模板，PCR 扩增合成 PCR产物，W化O I、Stu I酶切PCR产物，纯化，备用。
[0163] (2)设计加酶切位点Stu I、Mlu I、Spe I、Apa I、BamH I的正向引物2b0RF333F: GAAGGCCTGACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcggAACctccccttccgcatct;反向引物 化AvrIIR: Cttccgaagaaacctaggag。W质粒PCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，W Stu I、Avr II酶切PCR产物，纯化，备用。
[0164] (3)^化〇1、4￥'11酶切质粒9〔8-〔1￥。209，备用。
[0165] (4)采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠 杆菌感受态D册a。
[0166] (5)、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用化O I、Avr II酶切鉴定和PCR鉴定，最后送测序公司测序鉴定，将构建正确的质粒PCB-CMVF209- no化保存备用。
[0167] 2、采用常规方法，将弱病毒表达载体pCB-CMVF209no2b转化农杆菌。
[0168] 3、质粒农杆菌浸润法将PCB-CMVF20化o2b、pCB-CMVF109、pCB-CMV309质粒农杆菌 混合浸润接种4-6叶龄植物苗叶。
[0169] 4、接种苗室溫培养5-8天后，即可按常规苗管理。
[0170] 5、在已接种的植物上在生长期喷施除草剂40%草下麟200倍液，5、10天后观察，药 后5天萎黨，药后10天已明显枯死。实验结果图如图1所示。
[0171] 最后，还需要注意的是，W上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于W上实施例，还可W有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 黄瓜花叶病毒弱毒力载体表达抗除草剂基因在增强植物抗除草剂性能方面的应用。2. 根据权利要求1所述的黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗除草剂性能方面的应 用，其特征是： 所述黄瓜花叶病毒弱毒力载体的构建方法包括如下步骤： 1 )、改造病毒CMV成缺失2b基因序列的弱病毒表达载体;具体为： 将已构建好的病毒CMV侵染性克隆质粒之一 pCB-CMVF209采用酶切连接的方法改造，使 2b基因缺失，并加入酶切位点，构建成为弱毒力的病毒表达载体---弱病毒载体； 2)、将抗除草剂基因编码区（ORF)序列插入步骤1)所得的弱病毒载体构建重组病毒表 达载体； 构建所得的含抗除草剂基因编码区序列的重组弱病毒表达载体用于增强植物对除草 剂的抗性。3. 根据权利要求2所述的黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗除草剂性能方面的应 用，其特征是： 所述步骤1)中的酶切位点为：Stu I、Mlu I、Spe I、Apa I、BamH I、Sac II。4. 根据权利要求2或3所述的黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗除草剂性能方面 的应用，其特征是： 所述步骤1)具体包括如下步骤： ① 、以CMV序列为模板，设计加酶切位点的正、反向引物； 加酶切位点Nco I的正向引物NcoIF2:CATGCcatggctgagtttgcctg; 加酶切位点Stu I的反向引物2aORFlR为以下任一： gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttgg; gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttg； 以质粒PCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，纯化，以Nco I、Stu I酶切PCR产物， 纯化，备用。 ② 选择Stu I以及Mlu I、Spe I、Apa I、BamH I、Sac II中至少1个酶切位点加入正向引 物的5' ；设计在5'加入Avr Π 酶切位点的反向引物； 所述正向引物：GAAGGCCTGACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcggAACctccccttccgcatct (为 2bORF333F);或由GAAGGCCT 与序列 GACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcgg中的至少 1个 酶切位点的序列与序列AACctccccttccgcatct组成； 所述反向引物为AvrIIR:Cttccgaagaaacctaggag; 以质粒PCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，纯化，以Stu I、Avr Π 酶切PCR产 物，纯化； ③ 以Nco I、Avr II酶切质粒pCB-CMVF209; ④ 、采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠杆菌 感受态DH5a; ⑤ 、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用Nco I、 Avr Π 酶切鉴定和PCR鉴定，得到构建正确的质粒pCB-CMVF209-no2b。5. 根据权利要求2或3所述的黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗除草剂性能方面 的应用，其特征是： 所述步骤2)具体包括如下步骤： ① 、以抗除草剂基因编码区（ORF)序列为基础，设计加酶切位点Stu I或Mlu I或Spe I 或Apa I或BamH I的正向引物，加酶切位点Mlu I或Spe I或Apa I或BamH I或Sac II的反向 引物；以含目的基因的质粒为模板，PCR扩增目的基因，纯化，以正、反向引物所加酶切位点 的酶酶切PCR产物，纯化； ② 、以与上述步骤①相同的酶酶切质粒pCB-CMVF209-no2b; ③ 、采用T4-DNA连接酶试剂盒将酶切的PCR产物与酶切的质粒产物连接，转化大肠杆菌 感受态DH5a; ④ 、在上述转化培养长出菌落的平板内挑选菌落再液体培养，提取质粒，采用上述步骤 ①相同的酶酶切鉴定，并采用上述步骤①相同的引物进行PCR鉴定，最后测序鉴定，得到构 建正确的含目的抗性基因的质粒pCB-CMVF209no2b-gene。
【文档编号】A01H5/00GK105925603SQ201610256085
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】竺锡武, 彭日民, 王强, 张媛媛, 吴娟
【申请人】湖南人文科技学院