一个受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因及其检测方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一个受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因及其检测方法和应用，该基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，编码的蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。以dCAPs特异性引物 (SEQ ID No.5) (SEQ ID No.6)对水稻中所提取的DNA进行PCR扩增后，经MboⅡ酶切进行鉴定，能快速检测到含有该基因水稻的植株，其检测准确性高，操作简单。携带该基因的水稻在低温条件下早期水稻植株黄化，高温条件下恢复正常绿色。通过本发明得到的低温响应水稻温敏感叶色突变体在研究植物的叶绿体发育、叶绿素的生物合成以及其温度响应等分子机制具有重要意义，同时也可以作为标记性状提高杂交水稻的种子纯度，可应用于杂交水稻制种，可提高杂交水稻不育系自身以及它配制杂交水稻的纯度。
【专利说明】
-个受低溫响应的早期水稻叶绿体发育基因及其检测方法和 应用
技术领域
[0001] 本发明设及农业和植物生物技术等领域，特别是在分子水平上进行水稻遗传育种 W及生理、基因功能等基础研究。
【背景技术】
[0002] 叶片是植物进行光合作用的主要器官，类型丰富且易于鉴别，叶色变异是辨别植 物突变最直观的性状之一。叶绿体是植物进行光合作用的场所，而叶绿体的发育受到一系 列的核质互作基因的控制。研究表明控制叶绿体发育的基因被破坏可导致叶绿体发育受 阻，进而使植物叶色发生异常，使光合作用效率下降，甚至植株死亡。目前，人们利用物理、 化学、生物等诱变已得到水稻叶色突变体，将其应用于水稻的遗传育种、生理及其相关基因 的克隆和功能研究。本研究利用经物理诱变得到的低溫条件下水稻早期苗色突变体并通过 图位克隆技术定位到一个受低溫响应叶绿体发育的基因，至今尚未有与此水稻基因相关的 文献报道。
[0003]
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一个受低溫响应的早期水稻叶绿体发育基因、该基因编码 的蛋白质及运个基因的检测方法和应用。
[0005] 携带该基因的水稻在低溫条件下早期水稻植株黄化，高溫恢复绿色。
[0006] 运种低溫响应早期水稻叶绿体发育的基因，具有SEQ ID No. 1所示的核巧酸序列。 优选的，其核巧酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0007] 该基因序列所编码的蛋白质，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。优选的，该氨 基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[000引一对用于检测受低溫响应水稻叶绿体发育基因的特异性dCAPs PCR引物，其特征 在于，其核巧酸序列： 上游：5' GATTCGATGAAGCTTATCGGATACTTGCGAAG 3' 下游：5' ATCCTTGGCATCACTGATACGG 3' 即沈Q ID No.5和沈Q ID No.6所示序列。
[0009] 检测运种控制早期受低溫响应水稻叶绿体发育基因的方法为，采用上述特异性 dCAPs PCR引物对水稻植株所提取的DNA进行PCR扩增反应，由普通水稻(如嘉花1号)DNA扩 增所得到的12化P片段，如SEQ ID No. 3所示，能被施〇n酶切成33bp和92bp的两个特异性片 段，而由携带该低溫响应的叶绿体发育基因的水稻的DNA扩增得到的124bp长度，如SEQ ID No. 4所示序列，不被舰>〇n酶切断，根据DNA能否被舰>〇n酶切可快速检测到是否含有此基因 的水稻品种。
[0010] 水稻低溫度响应叶色突变体材料是由梗稻"嘉花1号'经6化〇 丫射线福照而来，经海 南、上海两地多年自交加代和选择，已成为各种农艺性状稳定的品系。发明人在研究中将此 突变品系与釉稻"广占 63S"配制杂交组合，构建遗传群体，利用SSR和InDel分子标记将控制 叶绿体发育的基因定位在水稻的第10号染色体。
[0011] 本发明控制低溫响应叶绿体发育的基因本研究首先利用RNA干扰(RNAi)法验证水 稻叶绿体发育相关基因的功能，通过构建PTCK303二元载体，转入农杆菌，再侵染野生型水 稻嘉花1号的愈伤经分化获得突变体基因的RNAi苗，来验证基因功能，其RNAi植株叶色变黄 (如图4)，同样，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术也验证了普通水稻(野生型）中的该等位 基因的被破坏即可导致早期水稻叶绿体发育受阻，使植株黄化。
[0012] 本发明得到的控制低溫响应早期水稻叶绿体发育的基因可应用于杂交水稻制种， 该基因导入杂交水稻不育系可提高不育系自身W及由它配制杂交水稻的纯度。
【附图说明】
[0013] 图1为20°C条件下含有苗期低溫响应叶绿体发育的基因水稻与野生型水稻对照 图，其中左侧为含有苗期低溫响应叶绿体发育的基因水稻，右侧为野生型水稻。
[0014] 图2为32°C条件下含有苗期低溫响应叶绿体发育的基因水稻与野生型水稻对照 图，其中左侧为含有苗期低溫响应叶绿体发育的基因水稻，右侧为野生型水稻。
[0015] 图3为本发明对PCR扩增产物进行瓜酶切检测结果。Tl代表野生型水稻酶切检 测结果;T2代表含有低溫响应叶绿体发育的基因酶切检测结果。
[0016] 图4为野生型、RNAi的Tl代苗与苗期低溫响应叶绿体发育的基因水稻对比图，其中 左侧为野生型水稻、中间为RNAi的Tl代苗期水稻，右侧为苗期低溫响应叶绿体发育的基因 水稻。
[0017] 图5为野生型与CRISPR/Cas9基因组编辑技术敲除的苗对比图，其中左侧为野生型 水稻，右侧为CRISPR/化s9基因组编辑技术敲除的苗期水稻。
[001引【具体实施方式】： 实施例1:水稻DNA提取(CTAB法提取模板DNA) 1. 取1.Og水稻叶片，然后加液态化研磨成粉末状，迅速转移到2.0 ml Eppendorf管中， 再加入600 iil已预热的2 X CTAB缓冲液(60°C)，混合均匀； 2. 将步骤1得到的溶液放置60°C水浴40分钟，每隔IOmin轻轻震荡4~6次，冷却至室溫 后，12000 r/min离屯、Smin; 3. 小屯、吸取上清液600ul倒入新的2.0 ml Eppendorf管，再加入相同体积的异戊醇:氯 仿（1:24)溶液，充分混匀，12000 r/min离屯、5min; 4. 小屯、吸取上清加入1.5 ml Eppendo计管，加入S分之二体积的异戊醇混匀，12000 r/min 离屯、Smin; 5. 弃上清，加入70%乙醇清洗DNA约1-2次，12000 r/min离屯、5min; 6. 弃上清，室溫惊干或者40°C恒溫箱烘干，力时d出0溶解，4 °C保存备用。
[0019] 实施例2:PCR扩增和基因检测 总体积为50ul的PCR反应体系：
再使用化pendorf PCR扩增仪进行扩增。PCR反应程序：
实施例3:检测获得低溫响应早期水稻叶绿体发育的基因 1、 25 化 PCR反应体系如下：IOOmM Tris-肥 1 pH9.0; IOOmM KCl; 20mM MgS〇4;SOmM (NH4)2S04;2.5 mM dNTP; IOiiM 引物，抓AU Tag酶，化I模板DNA/lOiil。
[0020]引物序列为： 上游：5' GATTCGATGAAGCTTATCGGATACTTGCGAAG 3' 下游：5' ATCCTTGGCATCACTGATACGG 3' 2、 酶切反应体系：22.5iU无菌水;20山的PCR产物；5iU的10 X胞70饥Xif f er; 2.5山的胞70 m〇
[0021 ] 3、将酶切反应体系混匀后，放入37°C恒溫水浴中，溫浴3小时，每管加入化1的10 X Loading buffer终止酶切反应。将酶切产物上样与1%琼脂糖凝胶上并进行电泳，最后经漠 化乙锭染色后在UVP凝胶成像仪上成像，结果如图3。
[0022] 实施例4:基因功能验证 水稻低溫响应叶色突变体材料tc拍巧5源于梗稻嘉花1号经6化〇 丫射线诱变产生。经 测序发现，突变型基因（化0)(SEQ No. 1)中的碱基A缺失，RNA表达水平降低，tc拍口突变 体在低溫条件下早期植株黄化。另外，RNAi技术和CRISPR/Cas9基因组编辑技术实验结果， 都表明普通水稻中的该等位基因口)的突变体后代都能使水稻叶色呈低溫条件下黄化 表型。
[0023] 1、利用SSR和InDel分子标记进行突变基因的定位，通过测序和利用实时巧光定量 PCR技术(Real Time qPCR)对叶绿体发育、叶绿素合成W及光合作用相关基因进行RNA水平 的表达量的分析，其RNA水平的表达量下降，运说明该基因影响低溫条件下质体早期发育相 关基因的表达，导致质体发育受阻，进而影响了叶绿体发育和光合色素的累积。
[0024] 2、本发明主要利用RNA干扰(RNAi)法验证一个水稻叶绿体发育相关基因的功能， 通过构建PTCK303二元载体，转入农杆菌，再侵染野生型水稻嘉花1号的愈伤经分化获得突 变体基因的RNAi苗，来验证基因功能。
[0025] 3、本发明利用CRISPR/化s9基因组编辑技术即由RNA指导化S蛋白对祀向基因进行 修饰的技术对普通水稻中的该等位基因进行了敲除，得到了 Tl代低溫白化植株(如图5)，也 证实普通水稻(野生型）中的该等位基因口)的被破坏即可导致低溫条件早期水稻叶绿 体发育受阻，使植株黄化。
[0026] 5、携带该基因的水稻在低溫条件下苗期叶色呈黄化表型，高溫下又恢复正常，因 此可W通过此表型变化来鉴别水稻品种真伪，提高纯度。
【主权项】
1. 一个受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因，其特征在于： 其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。2. 根据权利要求1所述的一个受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因，其特征在于:所 述的基因序列所编码的蛋白质如SEQ ID No.2所不。3. -对用于检测权利要求1所述的受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因的特异性 dCAPs引物，其特征在于，其核苷酸序列为： 上游：5' GATTCGATGAAGCTTATCGGATACTTGCGAAG 3' 下游：5' ATCCTTGGCATCACTGATACGG 3' 即SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列。4. 检测权利要求1所述的受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因的方法，其特征在于： 用权利要求3所述的特异性dCAPs引物对野生型水稻和携带受低温响应的早期水稻叶绿体 发育基因水稻所提取的DNA进行PCR扩增反应，得到125bp和124bp核苷酸片段。5. 根据权利要求4所述的受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因的检测方法，其特征 在于:所述的野生型水稻125bp核苷酸片段，序列如SEQ ID No.3所示，受低温响应的早期水 稻叶绿体发育基因水稻苗期124bp核苷酸片段，序列如SEQ ID No.4所示。6. 根据权利要求4所述的受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因的检测方法，其特征 在于，将所得到的得到125bp片段用撼〇11酶切，出现长度为33bp和92bp的特异性片段，说明 含有受低温响应的早期水稻叶绿体发育基因。
【文档编号】C07K14/415GK105925587SQ201610409565
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月13日
【发明人】吴兰兰, 吴军, 刘艳霞, 林冬枝, 董彦君
【申请人】上海师范大学