包埋型纳米铁/两种微生物菌剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了包埋型纳米铁/两种微生物菌剂及其制备方法。该制备方法先将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida.)和施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri.)2环制备两种微生物菌剂的菌体A；制备纳米铁溶液B，制备包埋剂琼脂、PVA、SiO2溶液C，制备交联剂硫酸铝饱和硼酸溶液D；按体积比分别取15～18％溶液B，6～15％的菌体A加入到57～66％溶液C中，搅拌混合均匀，在氮气保护的环境下滴加至室温的1‐22％溶液D中，在交联处理，清洗，保存，得到纳米铁/两种微生物菌剂。本发明利用纳米铁和微生物间的协同作用，提高三氯生的降解效率，所制得的菌剂强度高、微生物毒性小、原材料来源价格低廉，可广泛的用于受三氯生污染的水体处理。
【专利说明】
包埋型纳米铁/两种微生物菌剂及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及三氯生废水处理领域，具体是一种用于降解三氯生的包埋型纳米铁/两种微生物菌剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]三氯生具有良好的杀菌消毒作用，且具备良好的安全性，甚至有促进人体皮肤新陈代谢、光亮润泽的功效。从20世纪70年代应用于香皂生产以来，三氯生的应用范围逐步扩大，现已被广泛用于个人护理品及药品的生产过程中，如洗涤剂、除臭剂、化妆品、消毒器械，以及纺织品的出厂前消毒杀菌处理等。三氯生属于极性疏水性有机物，易沉积于土壤、底泥等固相物质。疏水物质的亲脂性使其易于在生物体内积累，也增加三氯生环境残留的可能性，并通过哺乳动物的食物链积累威胁人类健康。这类污染物的易吸附沉积性、持久性、生物富集性，给周围的生态环境带来长期的、不可预测的环境风险。对此类污染的控制与治理已引起人们的广泛关注。
[0003]生物处理是当前常用的废水处理方法，这种方法通过微生物的新陈代谢作用，将废水中的污染物质分解、吸收，从而达到治理污染的目的。生物处理法与其他方法相比，其成本低，效率高，而且容易操作，最重要的是没有二次污染，因此，在废水处理中得到了广泛的应用。随着经济的发展，废水的成分日益复杂，尤其当废水中含有有毒、难降解的有机污染物时，由于对该类有机物具有专项降解能力的微生物在环境中的种类、数量较少，同时它在种间竞争中处于劣势，因此，传统的生物处理技术面临极大挑战。
[0004]如果在传统的生物处理体系中投加具有特定功能的微生物或某些基质，增强它对特定污染物的降解能力，从而改善整个污水处理体系的处理效果，我们称这种技术为生物强化技术。近年来，纳米材料由于其巨大的比表面积和高活性，使反应速率得到提高，应用于被污染的土壤和地下水修复以及污水处理，而其中对纳米零价铁(nano-scale zero-valent，nZVI)研究相对较多。nZVI是一种有效的脱卤还原剂，早在20世纪80年代就引起了人们的关注。纳米零价铁可催化还原多种有机卤化物，如:卤代烷烃、卤代烯烃、卤代芳香烃等难降解有机物污染物，将其转化为无毒无害的化合物，同时提高其可生化性，能为进一步生物降解创造有利条件。虽然纳米零价铁具有很多优势，但是在其应用的过程中还遇到一些问题，比如纳米零价铁的稳定性较差。纳米零价铁很容易被氧化而形成铁的氧化物或者氢氧化物在纳米铁表面沉积，从而使得纳米零价铁产生钝化。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种三氯生的降解效果显著，不存在二次污染的用于降解三氯生的包埋型纳米铁/两种微生物菌剂及其制备方法。
[0006]本发明利用化学手段，将纳米铁和微生物进行包埋制成复合菌剂，可以使其在三氯生污染物的处理上形成协同效应，不仅可以利用纳米铁颗粒高的比表面积和表面活性，还可以保证微生物的稳定性和活性，制成的包埋型菌剂适合原位修复且无二次污染。
[0007]本发明的目的通过如下技术方案实现:
[0008]包埋型纳米铁/两种微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤:
[0009](I)菌体的制备:
[0010]挑取恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida.)和施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzer1.)2环，分别转移到营养液中，细菌在35-37°C的条件下培养1-3天，以5-18%的体积比例接种至含增殖培养基的容器中，在35-37°C的条件下培养1-3天，离心处理，获得上述菌体的对数生长期细胞;用磷酸盐缓冲液洗涤，按体积百分比计，取37 -45 %恶臭假单胞菌、55-63%的施氏假单胞菌混合，获得用于三氯生降解的施氏假单胞菌菌体，记为菌体A;
[0011](2)纳米铁溶液的制备:
[0012]采用液相还原法，在氮气保护的液相体系中，强还原剂KBH4还原FeSO4.7H20得到Fet3，用Fet3制备浓度为0.1?0.6g/L的纳米铁溶液，记为溶液B;
[0013](3)包埋剂琼脂、PVA、S i02溶液的制备:
[0014]将琼脂、PVA在90-100°C左右的温度下加热完全溶解于清水，得到琼脂质量百分含量为5?9%，PVA质量百分数为7.5?15%的溶液，再加入S12,控制S12在混合物中质量浓度为I?3mg/L，待混合交替冷却至500C，记为溶液C;
[0015](4)交联剂硫酸铝饱和硼酸溶液的制备:
[0016]将硫酸铝粉末溶于饱和硼酸溶液中，得到摩尔浓度为0.1?lmol/L的硫酸铝的饱和硼酸溶液，记为溶液D ；
[0017](5)纳米铁/两种微生物菌剂制备:
[0018]在50-70°C恒温水浴条件下，按体积比分别取15?18%溶液B，6?15%的菌体A加入到57?66 %溶液C中，搅拌混合均匀，在氮气保护的环境下滴加至室温的1- 22 %溶液D中，在交联处理，清洗，保存，得到纳米铁/两种微生物菌剂。
[0019]为进一步实现本发明目的，优选地，所述营养液主要成分为牛肉膏6.0g/L，NaCl 5.0g/L，蛋白胨 10.0g/L，大豆粉 2.0g/L ,pH 6.5,其余为水。
[0020]优选地，所述增殖培养基主要成分为酪蛋白20.0g/L，磷酸氢钾3.0g/L，葡萄糖3.0g/L，大豆粉4.0g/L，氯化钠5.0g/L，其余为水。
[0021]优选地，按体积百分比计，所述磷酸盐缓冲液的成分为氯化钠9.0g/L，氯化钾0.3g/L，磷酸氢二钾1.2g/L和磷酸二氢钾0.3g/L，其余为水。
[0022]优选地，所述的保存是指在无菌生理盐水中浸泡并放置冰箱中4°C下保存。
[0023]优选地，所述恶臭假单胞菌(Ps eudomonas pu t i da.)和施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzer1.)2环分别转移到30_40mL营养液中。
[0024]优选地，所述交联处理是指4_6°C条件下交联10?36h。
[0025]优选地，步骤I)所述的离心处理是指以4000-5000rpm的速度离心15-30min。
[0026]优选地，所述的清洗是用0.8-1.2%的NaCl溶液洗涤。
[0027]—种包埋型纳米铁/两种微生物菌剂，由上述制备方法制得。
[0028]相对于现有技术，本发明具有如下优点:
[0029]I)本发明埋型纳米铁/两种微生物复合菌剂，利用纳米铁对三氯生的强还原性、对微生物的吸附性，以及纳米铁可与微生物的线粒体的细胞色素c作用，改变细胞色素c的氧化还原电位和加强电子传递能力，复合菌剂能够产生协同效应共同促进三氯生的降解，本发明制备的复合菌剂与相同实验条件下单一的微生物实验和单一的纳米铁实验对比，证明复合菌剂能够产生协同效应共同促进三氯生的降解，效果显著。
[0030]2)本发明所选用的包埋剂琼脂原材料来源广，廉价无毒，具有良好的生物相容性。所制得的菌剂强度高、微生物毒性低，同时解决吸附于无机多孔S12材料微生物的不稳定问题，纳米铁与微生物形成协同效应加强三氯生降解效率，适合大规模的工业生产。
[0031]3)本方法使用简单方便，可将制成菌剂活化后直接投放在污染水体中，实现污染水体的原位修复，有效避免微生物的流失，不存在二次污染。
【具体实施方式】
[0032]为更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
[0033]实施例步骤I)和步骤6)中所述营养液主要成分为牛肉膏6.0g/L，NaC15.0g/L，蛋白胨1.0g/L，大豆粉2.0g/L ,pH 6.5,其余为水。
[0034]增殖培养基主要成分为酪蛋白20.0g/L，磷酸氢钾3.0g/L，葡萄糖3.0g/L，大豆粉
4.0g/L，氯化钠5.0g/L，其余为水。
[0035]实施例1
[0036](I)三氯生降解菌液的制备
[0037]分别挑取恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida.)、施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzer1.)2环，将其分别转移到30mL营养液中，细菌在35°C的条件下培养2天，以10%的体积比例接种至增殖培养基中，在35°C的条件下培养2天，以5000rpm的速度离心15min后，分别获得上述菌体的对数生长期细胞。
[0038]将上述菌体的对数生长期细胞取出，用磷酸盐缓冲液(其主要成分氯化钠9.0g/L，氯化钾0.3g/L，磷酸氢二钾1.2g/L和磷酸二氢钾0.3g/L，其余为水)洗涤2次。按体积百分比计，取37%恶臭假单胞菌、63%的施氏假单胞菌混合，获得用于三氯生降解的施氏假单胞菌菌体。菌体悬浮于生理盐水中，在4°C冷藏备用。记为菌体A;
[0039](2)纳米铁溶液的制备
[0040]采用液相还原法，在氮气保护的液相体系中，强还原剂KBH4还原FeSO4.7H20得到Fet3，用Fet3制备浓度为0.4g/L的纳米铁溶液。记为溶液B。
[0041 ] (3)包埋剂琼脂、PVA、Si02溶液的制备
[0042]将琼脂、PVA在90°C的温度下加热完全溶解于清水，得到琼脂质量百分含量为5%，PVA质量百分数为7.5%的溶液，再加入S12,控制S12在混合物中质量浓度为lmg/L，待混合交替冷却至55°C，记为溶液C;
[0043](4)交联剂硫酸铝饱和硼酸溶液的制备
[0044]将硫酸铝粉末溶于饱和硼酸溶液中，得到摩尔浓度为0.5mol/L的硫酸铝的饱和硼酸溶液。记为溶液D。
[0045](5)包埋型菌剂的制备
[0046]在600C恒温水浴条件下，按体积比分别取15 % 0.lmg/L的溶液B，6 %的菌体A加入到57 %的溶液C中，搅拌混合均匀。在氮气保护的环境下滴加至室温22 %溶液D (溶液A、B、C、D用量之和为100 % )中，在4 °C条件下交联1h，之后用0.9wt %的NaCl溶液清洗、保存，得到纳米铁/微生物(两种)菌剂。
[0047](6)三氯生污染的降解效果
[0048]取值得的纳米铁两种微生物复合菌剂3mg//L投入营养液中进行培养6h，使其活化后直接投入1L浓度为5mg/L的三氯生模拟污染废水中，曝气处理5d，曝气量为2L/h。以质量浓度计，营养液为牛肉膏6.0g/L，NaCl5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，大豆粉2.0g/L，pH 6.5，其余为水。
[0049]三氯生采用Waters高效液相色谱测定，测定条件为色谱柱:Waters Cis柱(I50 X4.6mm 1.D.，5μηι) ； 35°C柱温，以乙腈/水(75: 25，v/v)为流动相，总流速1.0mL/min，进样量1yL，检测波长为230nm。目标物质出峰时间约是7.2min，样品总检测时间为12min。通过测试水样中二氯生初始浓度Co和反应后浓度Ct，得到二氯生去除率。
[0050]采用本实施例方法处理水中5mg//L的三氯生5L废水中投加2g包埋型纳米铁/两种微生物菌剂;直接将菌剂投入营养液培养6h，活化后，直接投放使用，曝气处理5d后三氯生去除率达87%，明显高于单一菌种(施氏假单胞菌)的对照组24%，表明包埋型纳米铁/两种微生物菌剂对三氯生具有良好的降解效果，且明显优于单一菌种。因为纳米铁对三氯生的强还原性、对微生物的吸附性，以及纳米铁可与微生物的线粒体的细胞色素c作用，改变细胞色素c的氧化还原电位和加强电子传递能力，复合菌剂能够产生协同效应共同促进三氯生的降解。
[0051]本发明制备的包埋型纳米铁/两种微生物菌剂不仅在对三氯生的降解上有优势，且该包埋剂可以利用纳米铁颗粒高的比表面积和表面活性，还可以保证微生物的稳定性和活性，制成的包埋型菌剂适合原位修复且无二次污染，制成的包埋剂只需简单活化后即可投入使用，具有大规模工业化生产的前景。
[0052]实施例2
[0053](I)三氯生降解菌液的制备
[0054]分别挑取恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida.)、施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzer1.)2环，将其分别转移到30mL营养液中，细菌在35°C的条件下培养2天，以10%的体积比例接种至增殖培养基的容器中，在35°C的条件下培养2天，以5000rpm的速度离心15min后，分别获得上述菌体的对数生长期细胞。
[0055]将上述菌体的对数生长期细胞取出，用磷酸盐缓冲液(其主要成分氯化钠9.0g/L，氯化钾0.3g/L，磷酸氢二钾1.2g/L和磷酸二氢钾0.3g/L，其余为水)洗涤2次。按体积百分比计，取37%恶臭假单胞菌、63%的施氏假单胞菌混合，获得用于三氯生降解的施氏假单胞菌菌体。菌体悬浮于生理盐水中，在4°C冷藏备用。记为菌体A;
[0056](2)纳米铁溶液的制备
[0057]采用液相还原法，在氮气保护的液相体系中，强还原剂KBH4还原FeSO4.7H20得到Fet3，用Fet3制备浓度为0.4g/L的纳米铁溶液，记为溶液B。
[0058](3)包埋剂琼脂、PVA、S12溶液的制备
[0059]将琼脂、PVA在90°C的温度下加热完全溶解于清水，得到琼脂质量百分含量为7%，PVA质量百分数为11.5%的溶液，再加入S12，S12在混合物中质量浓度为2mg/L，待混合交替冷却至55 °C，记为溶液C;
[0060](4)交联剂硫酸铝饱和硼酸溶液的制备[0061 ]将硫酸铝粉末溶于饱和硼酸溶液中，得到摩尔浓度为0.5mol/L的硫酸铝的饱和硼酸溶液。记为溶液D。
[0062] (5)包埋型菌剂的制备
[0063 ]在60 0C恒温水浴条件下，按体积比分别取16 % 0.4mg//L的溶液B ,10%的菌体A加入到61 %的溶液C(含质量百分数7 %琼脂、11.5%PVA,2mg/L S12)中，搅拌混合均匀。在氮气保护的环境下滴加至13 %溶液D(室温)中，在4°C条件下交联23h，之后用0.9wt %的他(:1溶液清洗、保存，得到纳米铁/微生物(两种)菌剂。
[0064](6)三氯生污染的降解效果
[0065]取值得菌剂3mg/L投入营养液中进行培养6h，使其活化后直接投入1L浓度为5mg/L的三氯生模拟污染废水中，曝气处理5d，曝气量为2L/h。以质量浓度计，营养液的成分为牛肉膏 6.0g/L，NaCl 5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，大豆粉 2.0g/L ,pH 6.5,其余为水。
[0066]采用本实施例方法处理水中5mg//L的三氯生5L废水中投加2g包埋型纳米铁/两种微生物菌剂;直接将菌剂投入营养液培养6h，活化后，直接投放使用，，曝气处理5d后三氯生去除率达96%，明显高于单一菌种(施氏假单胞菌)的对照组30%，表明包埋型纳米铁/微生物(两种)菌剂对三氯生具有良好的降解效果，且明显优于单一菌种。因为纳米铁对三氯生的强还原性、对微生物的吸附性，以及纳米铁可与微生物的线粒体的细胞色素c作用，改变细胞色素c的氧化还原电位和加强电子传递能力。因此复合菌剂能够产生协同效应共同促进二氯生的降解。
[0067]三氯生采用Waters高效液相色谱测定，测定条件为色谱柱:Waters Cis柱(I50 X4.6mm 1.D.，5μηι) ； 35°C柱温，以乙腈/水(75: 25，v/v)为流动相，总流速1.0mL/min，进样量10yL，检测波长为230nm。目标物质出峰时间约是7.2min，样品总检测时间为12min。
[0068]实施例3
[0069](I)三氯生降解菌液的制备
[0070]分别挑取恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida.)、施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzer1.)2环，将其分别转移到30mL营养液中，细菌在35°C的条件下培养2天，以10%比例接种至增殖培养基的容器中，在35°C的条件下培养2天，以5000rpm的速度离心15min后，分别获得上述菌体的对数生长期细胞。
[0071]将上述菌体的对数生长期细胞取出，用磷酸盐缓冲液(其主要成分氯化钠9.0g/L，氯化钾0.3g/L，磷酸氢二钾1.2g/L和磷酸二氢钾0.3g/L，其余为水)洗涤2次。按体积百分比计，取37%恶臭假单胞菌、63%的施氏假单胞菌混合，获得用于三氯生降解的施氏假单胞菌菌体。菌体悬浮于生理盐水中，在4°C冷藏备用。记为菌体A;
[0072](2)纳米铁溶液的制备
[0073]采用液相还原法，在氮气保护的液相体系中，强还原剂KBH4还原FeSO4.7H20得到Fet3，用Fet3制备浓度为0.4g/L的纳米铁溶液。记为溶液B。
[0074](3)包埋剂琼脂、PVA、S12溶液的制备
[0075]将琼脂、PVA在90°C的温度下加热完全溶解于清水，得到琼脂质量百分含量为9%，PVA质量百分数为15 %的溶液，再加入S12，S12在混合物中质量浓度为3mg/L，待混合交替冷却至55 °C，记为溶液C;
[0076](4)交联剂硫酸铝饱和硼酸溶液的制备
[0077]将硫酸铝粉末溶于饱和硼酸溶液中，得到摩尔浓度为0.5mol/L的硫酸铝的饱和硼酸溶液。记为溶液D。
[0078](5)包埋型菌剂的制备
[0079 ]在60 0C恒温水浴条件下，按体积比分别取18 % 0.6mg//L的溶液B ,15%的菌体A加入至IJ66%的溶液C(含质量百分数9 %琼脂、15 %PVA、3mg/L S12)中，搅拌混合均匀。在氮气保护的环境下滴加至I %溶液D(室温)中，在4°C条件下交联36h，之后用0.9wt %的他(:1溶液清洗、保存，得到纳米铁/微生物(两种)菌剂。
[0080](6)三氯生污染的降解效果
[0081 ]取值得菌剂3mg/L投入营养液中进行培养6h，使其活化后直接投入1L浓度为5mg/L的三氯生模拟污染废水中，曝气处理5d，曝气量为2L/h。以质量浓度计，营养液的成分为牛肉膏 6.0g/L，NaCl 5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，大豆粉 2.0g/L ,pH 6.5,其余为水。
[0082]采用本实施例方法处理水中5mg/L的三氯生5L废水中投加2g纳米铁两种微生物复合菌剂;活化后，直接将菌剂投入营养液中培养6h，直接投放使用。，曝气处理5d后三氯生去除率达95%，明显高于单一菌种(施氏假单胞菌)的对照组24%，表明包埋型纳米铁/微生物(两种)菌剂对三氯生具有良好的降解效果，且明显优于单一菌种。因为纳米铁对三氯生的强还原性、对微生物的吸附性，以及纳米铁可与微生物的线粒体的细胞色素c作用，改变细胞色素c的氧化还原电位和加强电子传递能力。因此复合菌剂能够产生协同效应共同促进三氯生的降解。
[0083]三氯生采用Waters高效液相色谱测定，测定条件为色谱柱:Waters Cis柱(I50 X4.6mm 1.D.，5μηι) ； 35°C柱温，以乙腈/水(75: 25，v/v)为流动相，总流速1.0mL/min，进样量10yL，检测波长为230nm。目标物质出峰时间约是7.2min，样品总检测时间为12min。
[0084]在本发明中，纳米铁与微生物的协同作用，纳米铁对三氯生的强还原性、对微生物的吸附性，以及纳米铁可与微生物的线粒体的细胞色素c作用，改变细胞色素c的氧化还原电位和加强电子传递能力。因此复合菌剂能够产生协同效应共同促进三氯生的降解，克服了菌种降解三氯生过程中容易受到中间代谢产物抑制的问题，同时将纳米铁和微生物进行包埋制成菌剂，不仅可以利用纳米铁颗粒高的比表面积和表面活性，还可以保证微生物的稳定性和活性，使其在三氯生污染物的处理上形成协同效应，去除率明显增高。制成的包埋型菌剂适合原位修复且无二次污染。
[0085]根据相关细菌降解三氯生的报道:真菌漆酶(laccases)/氧化还原介体体系降解三氯生的降解率为90 %[ Muruge san K , Chang Y Y, Kim Y M , e t al.Enhancedtransformat1n of trielosanbylaccase in the presence of redox mediators[J].Water Research,2010,44(1): 298-308.]，白腐真菌对三氯生的降解率亦为90% [InoueY,Hata T,Kawai S,et al.Eliminat1n and detoxificat1n of triclosan bymanganeseperoxidase from white rot fungus[J].Journal of Hazardous Materials,2010,180(1-3): 764-767.]。这些细菌对三氯生的降解效率低于本发明的菌剂，因此该菌剂在处理三氯生废水方面具有良好的应用前景。本发明制备的包埋型纳米铁单一微生物菌剂不仅在对三氯生的降解上有优势；而且该包埋剂可以利用纳米铁颗粒高的比表面积和表面活性，还可以保证微生物的稳定性和活性，制成的包埋型菌剂适合原位修复且无二次污染；制成的包埋剂只需简单活化后即可投入使用，具有大规模工业化生产的前景。
[0086]本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.包埋型纳米铁/两种微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)菌体的制备: 挑取恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida.)和施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzer1.)2环，分别转移到营养液中，细菌在35-37°C的条件下培养1-3天，以5-18%的体积比例接种至含增殖培养基的容器中，在35-37°C的条件下培养1-3天，离心处理，获得上述菌体的对数生长期细胞;用磷酸盐缓冲液洗涤，按体积百分比计，取37 -45 %恶臭假单胞菌、55 - 63 %的施氏假单胞菌混合，获得两种微生物菌剂的菌体A; (2)纳米铁溶液的制备: 采用液相还原法，在氮气保护的液相体系中，强还原剂KBH4还原FeSO4.7H20得到Fe'用Fet3制备浓度为0.1?0.6g/L的纳米铁溶液，记为溶液B; (3)包埋剂琼脂、PVA、S12溶液的制备: 将琼脂、PVA在90-100°C左右的温度下加热完全溶解于清水，得到琼脂质量百分含量为5?9%，PVA质量百分数为7.5?15 %的溶液，再加入S12，控制S12在混合物中质量浓度为I?3mg/L，待混合交替冷却至500C，记为溶液C; (4)交联剂硫酸铝饱和硼酸溶液的制备: 将硫酸铝粉末溶于饱和硼酸溶液中，得到摩尔浓度为0.1?lmol/L的硫酸铝的饱和硼酸溶液，记为溶液D; (5)纳米铁/两种微生物菌剂制备: 在50 - 70 °C恒温水浴条件下，按体积比分别取15?18 %溶液B，6?15 %的菌体A加入到57?66 %溶液C中，搅拌混合均匀，在氮气保护的环境下滴加至室温的1- 22 %溶液D中，在交联处理，清洗，保存，得到纳米铁/两种微生物菌剂。2.根据权利要求1所述的制备方法，所述营养液主要成分为牛肉膏6.0g/L，NaC15.0g/L，蛋白胨1.0g/L，大豆粉2.0g/L ,pH 6.5,其余为水。3.根据权利要求1所述的制备方法，所述增殖培养基主要成分为酪蛋白20.0g/L，磷酸氢钾3.0g/L，葡萄糖3.0g/L，大豆粉4.0g/L，氯化钠5.0g/L，其余为水。4.据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，按体积百分比计，所述磷酸盐缓冲液的成分为氯化钠9.0g/L，氯化钾0.3g/L，磷酸氢二钾1.2g/L和磷酸二氢钾0.3g/L，其余为水。5.据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的保存是指在无菌生理盐水中浸泡并放置冰箱中4°C下保存。6.据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida.)和施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzer1.)2环分别转移到30_40mL营养液中。7.据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述交联处理是指4-6°C条件下交联10?36h08.据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤I)所述的离心处理是指以4000-5000rpm 的速度离心 15 - 30min。9.据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的清洗是用0.8-1.2%的NaCl溶液洗涤。10.一种包埋型纳米铁/两种微生物菌剂，其特征在于其由权利要求1 - 9任一项所述制备方法制得。
【文档编号】C12N11/14GK105925560SQ201610508394
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】陈元彩, 张君亚, 黎良浩
【申请人】华南理工大学