一种制备单克隆腹水抗体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备单克隆腹水抗体的方法，该方法为将远交系小鼠腹腔注射降脂烷后，接种骨髓瘤杂交瘤细胞，3~7天开始每天采集腹水；采集的腹水立即用离心机离心，放置4℃，次日取出再离心和用虑紙过滤，即可用硫酸氨沉淀、柱层析纯化，获得抗体。本发明采用远交系小白鼠代替BALB/c小白鼠，用于制备单克隆腹水抗体，该品系小白鼠的优点是繁殖能力强，对饲养条件要求低，价格很便宜，仅为BALB/c小鼠的1/5左右；而且体型较大，对实验耐受性好，因此腹水产量大，是BALB/c小鼠的数倍，抗体效价不低于BALB/c小鼠，而且抗体对温度的稳定性远高于BALB/c小鼠。
【专利说明】
一种制备单克隆腹水抗体的方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种制备单克隆腹水抗体的方法。
【背景技术】
[0002]单克隆抗体由于具备高特异性的特点而广泛用于生物领域的基础研究和疾病诊断;近年来随着科技的发展，解决了抗体异原性的问题开始逐步用于临床疾病的治疗，取得了很好的效果;随之单克隆抗体的用量急速增加，而现在制备单克隆抗体的方法成本高、产量低无法满足市场日益扩大的需求。
[0003]目前制备单克隆抗体的方法分两类，一类是采用近交系的BALB/c小白鼠制备腹水抗体，该品系小鼠遗传一致性好，实验个体差异小，腹水中抗体含量大;缺点是该品系小鼠繁殖力低、饲养条件要求很高，因此价格就很高，另外，该鼠体型小，对实验的耐受性差，因此腹水产量低。另一类是随着细胞发酵技术的发展，目前已开始用于单克隆抗体杂交瘤细胞的规模化培养，但该方法对生产设备和生产环境的要求极其高，设备价格也非常昂贵;生产线运行的成本高，对技术和生产人员的要求也非常高。因此造成抗体产品的价格非常昂虫贝ο
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种制备单克隆腹水抗体的方法。
[0005]本发明所采取的技术方案是:
一种制备单克隆腹水抗体的方法，利用远交系小鼠进行单克隆腹水抗体的制备。
[0006]进一步的，所述远交系小鼠为NIH鼠、昆明鼠。
[0007]进一步的，上述方法具体包括以下步骤:
1)杂交瘤细胞制备:用所需抗原免疫BALB/c小鼠，再用免疫鼠的B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞融合，经筛选获得分泌抗体的阳性克隆，即获得骨髓杂交瘤细胞；
2)抗体腹水制备:将NIH小鼠或昆明小鼠腹腔注射降脂烷，3?4天后再腹腔注射上步所得的杂交瘤细胞；
3)腹水收集:接种杂交瘤细胞后3?7天开始采集小鼠腹水；
4)抗体纯化:将采集的腹水离心去沉淀后于卜6°C静置10?14h，再离心取上清，上清用滤纸过滤后再用硫酸氨沉淀，取沉淀用PBS缓冲液溶解稀释，通过柱层析纯化，得到纯化的抗体。
[0008]进一步的，步骤I)所述骨髓瘤细胞为骨髓瘤细胞SP2/0。
[0009]进一步的，步骤2)所述NIH小鼠或昆明小鼠均为25?30天大的小鼠。
[0010]进一步的，步骤2)所述腹腔注射降脂烷的量为0.5ml/只。
[0011]进一步的，步骤2)所述注射杂交瘤细胞的量为每只小鼠注射接种1.0 X 16个细胞。
[0012]进一步的，步骤3)采集小鼠腹水时平均每只小鼠采集腹水4?6次，采集腹水量为7?20ml ο
[0013 ]远交系小鼠NI H鼠或昆明鼠在制备单克隆腹水抗体中的应用。
[0014]本发明的有益效果是:
本发明采用远交系小白鼠代替BALB/c小白鼠，用于制备单克隆腹水抗体，该品系小白鼠的优点是繁殖能力强，对饲养条件要求低，价格很便宜，仅为BALB/c小鼠的1/5左右;而且体型较大，对实验耐受性好，因此腹水产量大，是BALB/c小鼠的数倍，抗体效价不低于BALB/c小鼠，而且其抗体对温度的稳定性也远优于BALB/c鼠。
【附图说明】
[0015]图1为BALB/c小鼠、NIH小鼠和昆明小鼠产腹水产量的比较；
图2为BALB/c小鼠、NIH小鼠和昆明小鼠所产抗体效价的比较；
图3为BALB/c小鼠、NIH小鼠和昆明小鼠所产抗体的稳定性比较。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0017]实施例1
I)杂交瘤细胞制备:流感病毒经鸡胚培养，收集鸡胚尿囊液，提纯病毒，常规免疫BALB/c小鼠后取脾脏，分离B淋巴细胞，于骨髓瘤细胞SP2/0融合，在选择培养基中培养，再采用有限稀释法进行克隆，挑选分泌抗体的阳性克隆进行扩大培养，收获骨髓杂交瘤细胞。
[0018]2)抗体腹水制备:分三组:BALB/c小鼠组、NIH小鼠组和昆明小鼠组，各组20只，均4周龄，BALB/c小鼠体重18克，NIH小鼠和昆明小鼠组体重20克，腹腔注射降脂烷0.5ml/只，第3天腹腔注射流感病毒杂交瘤融合细胞，每只小鼠接种量为1.0X 16个细胞
3)腹水收集:接种细胞后3~7天开始采集腹水，直至小鼠死亡。
[0019]BALB/c小鼠组:产生腹水率90%，平均每只采集腹水3次，腹水量在4?6ml之间，平均每只产腹水量5ml。
[0020]NIH小鼠和昆明小鼠组:产生腹水率65%，平均每只采集腹水5次，腹水量7?20ml之间，平均每只产腹水量14ml dALB/c小鼠、NIH小鼠和昆明小鼠产腹水的具体情况如图1所示，从图1中可以看出，BALB/c小鼠通常只能采集3次腹水，腹水总量约6 ml;而NIH小鼠和昆明小鼠可采集5次腹水，问题可达14ml。
[0021]4)抗体效价比较:将采集的三组小鼠腹水分别混合，离心取上清，倍比稀释:1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000，采用酶联免疫方法，用相同浓度的抗原包被酶标板，用相同浓度的羊抗鼠IgG酶结合物，分别测定抗体效价。结果:三组实验稀释浓度至1:32000时，OD值均大于阴性对照的2.1倍，判为阳性，BALB/c组OD数值略高于其他组，1:64000稀释浓度均为阴性(如图2所示)。说明NIH小鼠和昆明小鼠产生的抗体效价与目前常用的Babl/c小鼠产生的抗体效价相当。
[0022]5)抗体纯化:
BALB/c小鼠产生的腹水比较清澈，但容易出现血性腹水，离心后即可用硫酸氨沉淀，通过柱层析得到纯化抗体。
[0023]NIH小鼠和昆明小鼠组产生的腹水较浑浊，近乳白色，离心去沉淀后至4°C过夜，再离心取上清，上清用滤纸过滤后用硫酸氨沉淀，取沉淀用PBS缓冲液溶解并稀释，通过柱层析得到纯化I gG抗体。
[0024]6)抗体水平及抗体的稳定性:
BALB/c小鼠、NIH小鼠、昆明小鼠三组腹水抗体含量基本一致，纯化后的抗体恢复到腹水原体积测定蛋白量，均为7mg/ml左右，酶联法测定抗体效价均能达到30000倍。
[0025]将三组纯化抗体分别放置37 °C温箱，3天后BALB/c小鼠抗体效价出现下降，5天下降明显。而NIH小鼠、昆明小鼠抗体效价5天后才开始下降，1天下降明显(如图3所示)。说明本发明用NIH小鼠、昆明小鼠产生的抗体对温度的稳定性远优于BALB/c鼠。
[0026]实施例2
I)杂交瘤细胞制备:用Hela细胞培养的呼吸道合胞病毒，经低温反复冻融，高速离心去沉淀，超速离心去上清，沉淀用蔗糖密度梯度离心，得到纯化病毒抗原;抗原常规免疫BALB/c小鼠后取脾脏，分离B淋巴细胞，于骨髓瘤细胞SP2/0融合，在选择培养基中培养，再采用有限稀释法进行克隆，挑选分泌抗体的阳性克隆进行扩大培养，收获骨髓杂交瘤细胞。
[0027 ] 2 )抗体腹水制备:NI H小鼠组和昆明小鼠组，各组20只，均4周龄NI H小鼠和昆明小鼠组体重20克，腹腔注射降脂烷0.5ml/只，第3天腹腔注射流感病毒杂交瘤融合细胞，每只小鼠接种量为1.0 X 16个细胞
3)腹水收集:接种细胞后一周开始采集腹水，直至小鼠死亡。
[0028]NIH小鼠和昆明小鼠组:产生腹水率65%，平均每只采集腹水5次，腹水量7?20ml之间，平均每只产腹水量14ml。
[0029]4)抗体纯化:
NIH小鼠和昆明小鼠组产生的腹水均浑浊，近乳白色，离心去沉淀后至4°C过夜，再离心取上清，上清用滤纸过滤后用硫酸氨沉淀，取沉淀用PBS溶解并稀释再通过柱层析得到纯化IgG抗体。
[0030]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种制备单克隆腹水抗体的方法，其特征在于，利用远交系小鼠进行单克隆腹水抗体的制备。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述远交系小鼠为NIH鼠、昆明鼠。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤: 1)杂交瘤细胞制备:用所需抗原免疫BALB/c小鼠，再用免疫鼠的B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞融合，经筛选获得分泌抗体的阳性克隆，即获得骨髓杂交瘤细胞； 2)抗体腹水制备:将NIH小鼠或昆明小鼠腹腔注射降脂烷，3?4天后再腹腔注射上步所得的杂交瘤细胞； 3)腹水收集:接种杂交瘤细胞后3?7天开始采集小鼠腹水； 4)抗体纯化:将采集的腹水离心去沉淀后于1~6°C静置10?14h，再离心取上清，上清用滤纸过滤后再用硫酸氨沉淀，取沉淀用PBS缓冲液溶解稀释通过柱层析纯化，得到纯化的抗体。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤I)所述骨髓瘤细胞为骨髓瘤细胞SP2/O。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)所述NIH小鼠或昆明小鼠均为25?30天大的小鼠。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)所述腹腔注射降脂烷的量为0.5ml/只。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)所述注射杂交瘤细胞的量为每只小鼠注射接种1.0 X 16个细胞。8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)采集小鼠腹水时平均每只小鼠采集腹水4~6次，采集腹水量为7?20ml。9.远交系小鼠NIH鼠或昆明鼠在制备单克隆腹水抗体中的应用。
【文档编号】C12N5/20GK105925539SQ201610327059
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】李川江
【申请人】广东华银医药科技有限公司