一株乳酸片球菌jqq2及其应用
【专利摘要】本发明提供了一株乳酸片球菌JQQ2，该乳酸片球菌JQQ2的分类命名为乳酸片球菌Pediococcus acidilactici，保藏号为CGMCC No.11929，保藏时间为2015年12月24日。本发明还提供了上述菌株在制备发酵乳制品食品添加剂和调节胃肠道微生态平衡产品方面的应用。本发明所得菌株具有优秀的抗菌性能；本发明所得菌株具有优秀的耐高温性能和优秀的耐极端pH性能；本发明所得菌株在制备发酵乳制品食品添加剂和调节胃肠道微生态平衡产品方面具有良好的应用前景。CGMCC No.1192920151224
【专利说明】
-株乳酸片球菌JQQ2及其应用
技术领域
[0001 ]本发明属于微生物领域，设及一株乳酸片球菌JQQ2及其应用，具体设及一株对高 溫和宽泛抑具有优秀耐受力的乳酸片球菌JQQ2及其应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，由于功能食品日益受到重视，人们对益生菌的研发热情也越发高涨。其 中，乳酸片球菌是重要的一种。然而，目前所得的乳酸片球菌的抗逆性能力尚不尽人意，主 要表现在对高溫和极端抑的耐受性较差。如《乳酸片球菌PA003抑菌作用及体外耐受性的研 究》报道了一株乳酸片球菌PA003,其对高溫的耐受力却较差。再如《化aracterization of two bacteriocins produced by Pediococcus acidilactici isolated from"Alheira''， a fermented sausage traditionally produced in Portugal》公布的两株乳酸片球菌对 抑和溫度的耐受性均较差。
[0003] 因此，寻求一株均有良好抗菌性能且具有优秀抗逆性(特别对于高溫和极端抑)的 乳酸片球菌，成为本领域亟待解决的问题。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一株乳酸片球菌JQQ2,该乳酸 片球菌JQQ2的分类命名为乳酸片球菌化diococcus acidilactici，保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中屯、CGMCC(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生 物研究所邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 11929,保藏时间为2015年12月24日。
[0005] 如本发明的实施例所示，本发明所得菌株的耐高溫性能优异，当于12TC处理 SOmin后，菌株的抑菌活性保留率仍高达81.09%。同时，本发明所得菌株对于极端抑的耐受 能力也很好，在pH=2时，抑菌活性保留率高达81.3%，在PH= 10下，抑菌活性仅仅丧失 39.86%。
[0006] 因此，本发明的对于现有技术的贡献之一在于提供了一株对于高溫和极端抑具有 优秀耐受力的乳酸片球菌，拓展了乳酸片球菌的应用范围和潜力。
[0007] 基于本发明菌株上述优秀的特性，本领域技术人员容易结合本领域的常规技术手 段将其应用在制备发酵乳制品食品添加剂方面。因此，本发明的另一个目的在于提供乳酸 片球菌JQQ2在制备发酵乳制品食品添加剂方面的应用。
[000引基于本发明菌株上述优秀的特性，本领域技术人员容易结合本领域的常规技术手 段将其应用在制备制备调节胃肠道微生态平衡产品方面。因此，本发明的另一个目的在于 提供乳酸片球菌JQQ2在制备发酵制备调节胃肠道微生态平衡产品方面的应用。
[0009] 本发明的有益效果：
[0010] 1、本发明所得菌株具有优秀的抗菌性能；
[0011] 2、本发明所得菌株具有优秀的耐高溫性能，当于12rC处理30min后，菌株的抑菌 活性保留率仍高达81.09 %;
[0012] 3、本发明所得菌株具有优秀的耐极端师性能，在pH = 2时，抑菌活性保留率高达 81.3%，在PH= 10下，抑菌活性仅仅丧失39.86% ;
[0013] 4、本发明所得菌株在制备发酵乳制品食品添加剂和调节胃肠道微生态平衡产品 方面具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0014] 图1为JQQ2的镜检形态结果图；
[0015] 图2为JQQ2的PCR结果图。
【具体实施方式】
[0016] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是W下实施例只是用 于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练 人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。 [0017]实施例1
[0018] 1、实验原料及方法
[0019] 1.1菌株来源
[0020] 自制的传统自然发酵泡菜。
[002U 1.2培养基
[0022] MRS培养基：牛肉膏（粉）10g，蛋白腺lOg，酵母膏（粉)5g，葡萄糖20g，吐溫-80 ImL， 巧樣酸锭2g，K2HP〇42g，乙酸钢5g，硫酸儀0.58g，硫酸儘0.25g，蒸馈水1000 mU配制固体培养 基需加琼脂粉18g)，加热溶解，调节抑至6.0~6.4，121°C灭菌15min。
[0023] 1.3 16S rDNA序列分析
[0024] 根据细菌基因组提取试剂盒的说明提取菌株DNA，WDNA为模板，PCR扩增其16S rDNA片段。上游引物Pl : 5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '，下游引物P2 : 5 ' - CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。
[0025] PCR扩增体系与扩增程序如表1和表2所示：
[0026] 表1 PCR扩增体系
[002引表2 PCR扩增程序
[0029]
[0030] 取PCR扩增产物及DNA Marker DL2000,采用1%琼脂糖凝胶(含Golden View)电泳 检测，电压100V，水平电泳30min，用凝胶成像仪观察。PCR产物委托英潍捷基(上海)贸易有 限公司测序。16S rDNA序列在NCBI网站进行比对。
[0031] WJQQ2基因组DNA为模板进行PCR后的产物，经过琼脂糖凝胶电泳，可见1000 bp- 2000bp区域出现清晰条带，如图2。
[0032] 将菌株JQQ2的PCR扩增产物测序结果在NCBI网站上通过BLAST工具进行分析，结果 如表3:
[0033] 表 3
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[0036] 1.4乳酸菌的分离纯化
[0037] 采用10倍梯度稀释法将泡菜水样品稀释到i(T5、i(r6、i(r7的稀释度。每个稀释度吸 取ImL菌液，并用含1.5 %化C〇3的MRS固体培养基倾注平板，37 °C培养4她，挑选有明显溶巧 圈的不同形态的菌落进行革兰氏染色观察，挑取革兰氏阳性的菌落到另一个含有1.5% CaO)3的MRS固体平板上划线培养，并将固体培养基平板上得到的单个菌落接种在一个装有 SmL MRS液体培养基的试管中，于37°C下培养2地，然后用接种环挑取菌液继续划线，重复2- 3次，直至菌落镜检结果表现为菌体形态一致，即可保存菌株。
[003引 1.5菌株的保存
[0039] 将得到的单一菌株在液体培养基中活化2-3次，划线接种于MRS固体斜面中培养 4化后置于4°C冰箱内短期保存，或将液体培养物与40%的灭菌甘油按1:1的比例混合，在- 20°C条件下进行长期保存。
[0040] 1.6乳酸菌的鉴定
[0041] (1)乳酸菌的形态特征
[0042] 将菌液划线接种于固体培养基上，37°C培养4她观察并记录菌落形态，同时进行革 兰氏染色镜检，观察并记录其菌体形态特征。
[0043] (2)生理生化特征
[0044] 对初步分离筛选得到的耐受消化道环境的菌株进行产出S试验、硝酸盐还原试验、 明胶液化试验、吗I噪产生试验、乳糖试验、甘露糖试验、棉巧糖试验、海藻糖试验、屯叶巧试 验、麦芽糖试验、纤维二糖试验、果糖试验、鼠李糖试验、木糖试验、半乳糖试验、阿拉伯糖试 验、苦杏仁巧试验，参照伯杰细菌鉴定手册(第八版)对比生化反应结果，并对菌株进行初步 种群归类。
[0045] JQQ2的菌落特征与个体形态如表4所示;JQQ2的镜检形态如图1所示。
[0046] 表 4
[0047]
[00
[00
[00
[00引]注："+"呈阳性；"一"呈阴性。
[0化2] 1.7抑菌实验
[0053]采用双层琼脂牛津杯法，将IOmL灭菌的素琼脂培养基冷却至50~60°C后倾倒于无 菌平皿，凝固后倾倒IOmL含200UL 1〇-化即/血指示菌悬液的营养琼脂培养基。静置惊干后放 入牛津杯(直径约6mm)，每个平板均匀放置4个，并用移液枪吸取200UL被检菌上清液注入牛 津杯中，标记。将培养皿放入4°C冰箱预扩散6~12h后转移至恒溫培养箱，于37°C下静置培 养2地。选取有明显抑菌圈的菌株做下一步实验。
[0054] 1.8pH耐受性实验
[0055] 37°C条件下，在试管中培养12h的菌液按1 %的接种量接种于IOOmLMRS液体培养基 中，37 TTC静置培养2地。将菌液按1 %的接种量(调整菌液浓度为IO7C化/mL)分别接种至pH = 2.0，pH=4.0，pH=7，pH = 10的MRS培养基中（盐酸调节），37°C静置培养地，测定抑菌活性 保留率，判断菌株在酸性环境下的耐受情况。每组设3个重复。
[0056] 表6为JQQ2的抑耐受性实验结果。
[0化7] 表6
[0化引
[0化9] 1.9耐溫实验
[0060] 将纯化后的细菌素 W40:1复溶于无菌超纯水中，分别置于20°C、40°C、60°C、80°C、 100°C水浴和12rC(高压)下处理20min，W2(TC处理过的样液作为对照，W藤黄微球菌为指 示菌，用牛津杯做抑菌试验。
[0061 ]表7为JQQ2的耐溫实验结果。
[0062]表 7
[00W
【主权项】
1. 一株乳酸片球菌JQQ2,其特征在于，所述乳酸片球菌JQQ2的分类命名为乳酸片球菌 Pediococcus acidiIactici，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 CGMCC，保藏号为CGMCC No. 11929，保藏时间为2015年12月24日。2. 权利要求1所述的乳酸片球菌JQQ2在制备发酵乳制品食品添加剂方面的应用。3. 权利要求1所述的乳酸片球菌JQQ2在制备调节胃肠道微生态平衡产品方面的应用。
【文档编号】C12N1/20GK105925499SQ201610281244
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】周康, 杨梦露, 吴葭清, 陈淑娟, 韩新锋, 王亮, 何利, 陈洪, 刘密
【申请人】四川农业大学