一种倍半萜类化合物及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种倍半萜类化合物及其制备方法和应用，所述倍半萜类化合物是从烤烟烟叶中分离得到，化合物命名为6?羟甲基?4?异丙基?7?甲氧基?1?萘甲酸甲酯，其分子式为C17H20O4，具有下述结构式：所述倍半萜类化合物的制备方法，是以烤烟烟叶为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到。所述倍半萜类化合物经活性测试，具有较好的抑菌作用。本发明化合物结构新颖，且具有较好的抗菌活性。将该化合物用于卷烟接装纸，能够消除或降低卷烟接装纸中细菌滋生和繁殖的可能性。
【专利说明】
-种倍半瞄类化合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于烟草化学技术领域，具体设及一种从烟草中首次提取得到的倍半祗类 化合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 烟草是世界上化学成分最为复杂的植物，次生代谢产物非常丰富，经过几十年的 研究，人们目前从烟草中鉴定出来的单体化学物质就超过3000多种，而且还有许多成分尚 未鉴定出来。烟草除主要用于卷烟抽吸用途外，还可从中提取多种有利用价值的化学成分， 从中发现有开发利用价值的先导性化合物。
[0003] 倍半祗是指分子中含15个碳原子的天然祗类化合物。倍半祗类 化合物分布较广，在植物体内常W醇、酬、内醋等形式存在于挥发油中，是挥发油中高沸点 部分的主要组成部分。多具有较强的香气和生物活性，是医药、食品、化妆品工业的重要原 料。为充分利用我省烟草资源优势，进一步寻找新的活性天然产物，我们对烟草化学成分进 行了研究，并从云南烤烟烟叶中分离得到了一种新的倍半祗类化合物，该化合物至今尚未 见到相关报道，值得一提的是该化合物具有显著的抗菌活性。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一目的在于提供一种倍半祗类化合物;第二目的在于提供所述倍半祗 类化合物的制备方法;第=目的在于提供所述倍半祗化合物在制备抗菌药物中的应用。
[0005] 本发明的第一目的是运样实现的，所述的倍半祗类化合物是从烤烟烟叶中分离得 到，其分子式为Cl?也地4，具有下述结构式：
该化合物命名为6-径甲基-4-异丙基-7-甲氧基-1-糞甲酸甲醋，英文名为[methyl 6- (hydroxymethyl)-4-isopropyl-7-methoxyn曰phth曰Iene-I- c曰rboxyl曰te]〇
[0006] 本发明的第二目的是运样实现的，所述倍半祗类化合物的制备方法，是W烤烟烟 叶为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱步骤，具体为： A、 浸膏提取：W烟叶为原料，将烟叶粉碎或切成小段，用有机溶剂提取3~5次，每次24 h~72 h，合并提取液、过滤，减压浓缩成浸膏； B、 硅胶柱层析:浸膏用重量比2~4倍量的160~300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析； W氯仿-丙酬溶液进行梯度洗脱，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩； c、高压液相色谱分离:B步骤洗脱液的8:2部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所 述的倍半祗类化合物。
[0007] W上述方法制备的倍半祗类化合物的结构是通过W下方法鉴定出来的： 本发明化合物为浅黄色胶状物；高分辨质谱（HRESIMS)给出准分子离子峰m/z 311.1253 [M+Na]+ (计算值311.1259)。结合Ih和U C NMR谱给出一个分子式Ci7出〇〇4,不饱 和度为9。红外光谱数据证实化合物中存在幾基（1708U650 cnfi)和芳环（1610,1563， 1460 cnfi)功能团，紫外光谱在332和238 nm处有强吸收也证实化合物中存在芳环结构。 从Ih和I3C NMR谱（数据归属见表1)信号可W看出化合物中有一个1，4,6,7-四取代的糞环 (〇1~〇10山-2，护3，护6和护8)、一个异丙基（(：-11~(：-13山-11，化-12，13)、一个甲酸醋基 (〇14、-016-14)、1个径甲基((：-15，出-15)、1个甲氧基(-016-7);运些信号表明化合物为芳 构化的倍半祗[J.化t. Prod.，2013, 76 (6)，PP 1058-1063]。化合物的母核得到确认 后，剩余的甲酸醋基、径甲基、异丙基和甲氧基为母核上的取代基。根据H-Il和03、(：-4、(：- 10，H-12，13和C-4，W及H-3和C-11的HMBC(图2)相关可证实异丙基取代在糞环的C-4位;根 据此-15和C-5、C-6、C-7的HMB讨目关，可证实径甲基取代在母核的C-6位;根据甲氧基氨（Sh 3.83 S)和C-7有HMBC相关，可证实甲氧基分别取代在母核的C-7位;根据H-8和C-I，H-2和醋 幾基(C-14)有HMBC相关，W及H-3和醋幾基(C-14)没有HMBC相关，可推测甲酸醋基取代在母 核的C-I位。至此本化合物的结构得W确定，该化合物命名为:6-径甲基-4-异丙基-7-甲氧 基-1-糞甲酸甲醋。
[000引表1.化合物的Ih NMR和"C NMR数据（溶剂为CsDsN)
本发明的第=目的是运样实现的，所述的倍半祗类化合物在制备抗菌药物中的应用。
[0009] 所述的倍半祗类化合物在制备抗菌包装中的应用。
[0010] 本发明化合物是首次从烤烟烟叶中分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法确 定为倍半祗类化合物，并表征了其具体结构。对该化合物进行抗菌活性筛选，结果表明其对 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、埃希菌、枯草杆菌、变形杆菌等具有显著的活性，抑制率超过 96%。该化合物经安全性评价，表明对动物无毒，使用安全。该化合物应用到卷烟接装纸中， 和对照相比较，添加过本化合物的接装纸检测细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、绿脈 杆菌、溶血性链球菌、真菌总数显著减少；对大肠杆菌（ATCC25922)、金黄色葡萄球菌 (ATCC6538)的抑菌率全部达到96%W上，能够降低或消除卷烟接装纸及在胆存过程中细菌 滋生和繁殖的可能性，另外，在卷烟吸食、传递过程中，该抗菌作用也能够对卷烟烟支上的 接装纸被污染的微生物起到抑制作用。本发明化合物结构简单活性较好，可作为抗菌药物 研发的先导性化合物，具有良好的应用前景。
[0011] 与现有技术相比，本发明具有W下突出优点：（1)本发明的化合物原料易得，提取 方法简单，容易分离得到;分子结构也简单，容易实现人工合成。（2)采用了常规柱层析和 高效液相色谱结合的制备方法，化合物制备操作流程简单，所获得的本发明化合物纯度高， 后续的工业化生产容易实现。（3)本发明化合物对动物无毒，使用安全，展现出良好的抗菌 活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等的抑菌率全部达到96%W上;应用于卷烟接装纸，能够 对卷烟接装纸被污染的微生物起到抑制作用。卷烟接装纸直接和口腔接触，该化合物在卷 烟接装纸中的使用可避免在卷烟在吸食、传递过程中被微生物污染，有效提高了卷烟的卫 生和安全性。
【附图说明】
[0012] 图1为本发明倍半祗类化合物的核磁共振碳谱； 图2为本发明倍半祗类化合物的核磁共振氨谱； 图3为本发明倍半祗类化合物的主要HMBC相关。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但不W任何方式对本发明 加 W限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
[0014] 除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
[001引本发明所述的倍半祗类化合物，是从烤烟烟叶中分离得到，其分子式为Cl讯2004，具 有下述结构式：
该化合物命名为6-径甲基-4-异丙基-7-甲氧基-1-糞甲酸甲醋，英文名为[methyl 6- (hydroxymethyl)-4-isopropyl-7-methoxyn曰phth曰Iene-I- c曰rboxyl曰te]〇
[0016] 本发明所述倍半祗类化合物的制备方法，是W烤烟烟叶为原料，经浸膏提取、硅胶 柱层析、高压液相色谱步骤，具体为： A、 浸膏提取：W烟叶为原料，将烟叶粉碎或切成小段，用有机溶剂提取3~5次，每次24 h~72 h，合并提取液、过滤，减压浓缩成浸膏； B、 硅胶柱层析:浸膏用重量比2~4倍量的160~300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析； W氯仿-丙酬溶液进行梯度洗脱，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩； C、 高压液相色谱分离:B步骤洗脱液的8:2部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所 述的倍半祗类化合物。
[0017] 所述A步骤的有机溶剂为80%~100%的甲醇或乙醇、60%~90%的丙酬。
[0018] 所述A步骤有机溶剂与烟叶的重量比是2~4:1。
[0019] 所述B步骤中浸膏在经硅胶柱层析粗分前，用重量比1.5~3倍量的纯甲醇或纯乙 醇或纯丙酬溶解后，用重量比0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样。
[0020] 所述B步骤中氯仿-丙酬溶液的体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1: 2。
[0021] 所述C步骤中高压液相色谱分离纯化是采用21.2 mm X 250 mm，5 的Ci8色谱 柱，流速为20 mL/min，流动相为50%的甲醇，紫外检测器检测波长为332 nm，每次进样200 // L，收集26.7 min的色谱峰，多次累加后蒸干。
[0022] 所述C步骤中高压液相色谱分离纯化后的化合物再次用纯甲醇溶解，再W纯甲醇 为流动相，用凝胶柱层析分离，W进一步分离纯化。
[0023] 本发明的应用为所述倍半祗类化合物在制备抗菌药物中的应用。
[0024] 所述的倍半祗类化合物在制备抗菌包装中的应用。
[0025] 所述的倍半祗类化合物在制备抗菌卷烟用接装纸中的应用。
[0026] 本发明所述的烤烟烟叶不受地区和品种限制，均可W实现本发明，下面W来源于 云南不同产地的烟叶原料，对本发明做进一步说明： 实施例1 烟草样品来源于云南玉溪，品种为玉溪K326。将烟草取样2.0 kg粉碎W95%的甲醇提取 5次，每次提取24 h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏105 g。浸膏用重量比2.0倍 量的纯甲醇溶解后用120 g的100目粗硅胶拌样，0.6 kg的160目硅胶装柱进行硅胶柱层 析，用体积配比为1 :〇、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1: 2的氯仿-丙酬梯度洗脱，TLC监测合 并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为8:2的氯仿-丙酬洗脱部分用安捷仑1100半制 备高效液相色谱分离，W50%的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18 (21.2 X 250 mm, 5 M/)制 备柱为固定相，流速为20 ml/min，紫外检测器检测波长为332 nm，每次进样200 iiL，收集 26.7 min的色谱峰，多次累加后蒸干;所得产物再次用纯甲醇溶解，再W纯甲醇为流动相， 用Se地adex LH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
[0027] 实施例2 烟草样品来源于云南大理，品种为云烟200，将烟草取样3.5 kg切碎，W95%的乙醇提取 4次，每次提取48 h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏250 g。浸膏用重量比2.0倍 量的纯甲醇溶解后用250 g的80目粗硅胶拌样，1.2 kg的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析， 用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酬梯度洗脱，TLC监测合并相 同的部分，得到8个部分，其中体积配比为8:2的氯仿-丙酬洗脱部分用安捷仑1100半制备高 效液相色谱分离，W50%的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18 (21.2X 250 mm, 5皿)制备柱 为固定相，流速为20 ml/min，紫外检测器检测波长为332 nm，每次进样200化，收集26.7 min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再W纯甲醇为流动相，用 S巧hadex LH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
[0028] 实施例3 烟草样品来源于云南昆明，品种为红花大金元，将烟草取样5 kg粉碎，W75%的丙酬用 超声提取3次，每次提取72h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏380 g。浸膏用重量 比1.6倍量的纯甲醇溶解后用400 g的90目粗硅胶拌样，2.4 kg的180目硅胶装柱进行硅胶 柱层析，用体积配比为1: 0、20:1、9:1、8: 2、7 : 3、6:4、I: I、1:2的氯仿-丙酬梯度洗脱，TLC监 测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为8:2的氯仿-丙酬洗脱部分用安捷仑1100 半制备高效液相色谱分离，W50%的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18 (21.2 X250 mm, 5 y m)制备柱为固定相，流速为20 ml/min，紫外检测器检测波长为332 nm，每次进样200化，收 集26.7 min的色谱峰，多次累加后蒸干;所得产物再次用纯甲醇溶解，再W纯甲醇为流动 相，用Se地adex LH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
[00巧]实施例4 取实施例1制备的化合物，为浅黄色胶状物； 测定方法为:用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。
[0030] 高分辨质谱化RESIMS)给出准分子离子峰m/z 311.1253 [M+Na]+ (计算值 311.1259)。结合Ih和U C NMR谱给出一个分子式Cl讯2〇〇4,不饱和度为9。红外光谱数据证实 化合物中存在幾基（17〇8、1650 cnfi)和芳环（1610，1563，1460 cnfi)功能团，紫外光谱 在332和238 nm处有强吸收也证实化合物中存在芳环结构。从Ih和I3C NMR谱（数据归属见 表1)信号可W看出化合物中有一个1，4,6,7-四取代的糞环(C-1~C-10;H-2，H-3，H-6和H- 8)、一个异丙基（(：-11~(：-13;护11，也-12，13)、一个甲酸醋基((：-14、-016-14)、1个径甲基 (C-15,出-15)、1个甲氧基（-OMe-7);运些信号表明化合物为芳构化的倍半祗[J.化t. Prod.，2013, 76 (6)，PP 1058-1063]。化合物的母核得到确认后，剩余的甲酸醋基、径甲 基、异丙基和甲氧基为母核上的取代基。根据H-Il和(：-3、(：-4、(：-10，护12，13和(：-4，^及护3 和C-Il的HMBC(图2)相关可证实异丙基取代在糞环的C-4位;根据出-15和C-5、C-6、C-7的 丽BC相关，可证实径甲基取代在母核的C-6位;根据甲氧基氨（Sh 3.83 S)和C-7有丽BC相 关，可证实甲氧基分别取代在母核的C-7位;根据H-8和C-l，H-2和醋幾基(C-14)有丽BC相 关，W及H-3和醋幾基(C-14)没有HMBC相关，可推测甲酸醋基取代在母核的C-I位。至此本化 合物的结构得W确定，该化合物命名为:6-径甲基-4-异丙基-7-甲氧基-1-糞甲酸甲醋。
[0031] 实施例5 取实施例2-3制备的任一化合物，为浅黄色胶状物。测定方法与实施例4相同，确认实施 例2-3制备的化合物为所述的倍半祗类化合物一一6-径甲基-4-异丙基-7-甲氧基-1-糞甲 酸甲醋。
[0032] 实施例6 取实施例1-4制备的任一倍半祗类化合物进行抗菌活性试验，试验情况如下： 体外抗菌实验用琼脂扩散法进行，首先将受试菌均匀地涂在普通琼脂培养基(牛肉膏、 蛋白腺、氯化钢、血清、琼脂）的平板上，再将待测化合物（倍半祗化合物用10 ml DMSO溶 解，加水稀释成50 iig/血的溶液)浸泡好的药片(直径5 mm)放在带菌的培养基上，放入恒溫 箱内，于25°C解育24- 72 h后观察抑菌圈大小。结果表明：本发明化合物对金黄色葡萄球 菌、大肠杆菌、埃希菌、枯草杆菌、变形杆菌等具有很强的活性;抑制率超过96%。
[0033] 实施例7 取实施例1-4制备的任一倍半祗类化合物进行安全性评价，试验情况如下:通过小鼠骨 髓微核实验、Ames实验和TK基因突变实验，证明本发明化合物对动物无毒，使用安全。
[0034] 本化合物W50 iig/mL的浓度加到卷烟接装纸上;按中华人民共和国《一次性使用 卫生用品卫生标准》GB15979-2002的检测方法，取加过本发明化合物的卷烟用接装纸，2.0 X3.0 mm大小，检测细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、绿脈杆菌、溶血性链球菌、真 菌总数。结果表明，添加过本发明化合物的接装纸菌落总数明显减少，本化合物对几种测试 的细菌都有明显抑制作用，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等的抑菌率全部达到96%W上。
【主权项】
1. 一种倍半萜类化合物，其特征在于所述倍半萜类化合物是从烤烟烟叶中分离得到， 命名为：6_羟甲基-4-异丙基-7-甲氧基-1-萘甲酸甲酯，英文SS :[methy16-(hydroxymethy 1 )-4_isopropyl-7-methoxynaphthalene-1-carboxylate ]，其分子式 C17H2q〇4,具有下述结构：2. -种权利要求1所述倍半萜化合物的制备方法，其特征在于以烤烟烟叶为原料，经浸 膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱步骤，具体为： A、 浸膏提取：以烟叶为原料，将烟叶粉碎或切成小段，用有机溶剂提取3~5次，每次24 h~72 h，合并提取液、过滤，减压浓缩成浸膏； B、 硅胶柱层析:浸膏用重量比2~4倍量的160~300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析； 以氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩； C、 高压液相色谱分离:B步骤洗脱液的8:2部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所 述的倍半萜类化合物。3. 根据权利要求2所述的倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于所述A步骤的有机溶 剂为80%~100%的甲醇或乙醇、60%~90%的丙酮。4. 根据权利要求2所述的倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于所述A步骤有机溶剂 与烟叶的重量比是2~4:1。5. 根据权利要求2所述的倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于所述B步骤中浸膏在 经硅胶柱层析粗分前，用重量比1.5~3倍量的纯甲醇或纯乙醇或纯丙酮溶解后，用重量比 0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样。6. 根据权利要求2所述的倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于所述B步骤中氯仿-丙酮溶液的体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7 :3、6:4、1:1和1:2。7. 根据权利要求2所述的倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于所述C步骤中高压液 相色谱分离纯化是采用21.2 1111]1\25〇1111]1，5观的&8色谱柱，流速为2〇111171]1；[11，流动相为 50%的甲醇，紫外检测器检测波长为332 nm，每次进样200 A，收集26.7 min的色谱峰，多次 累加后蒸干。8. 根据权利要求2所述的倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于所述C步骤中高压液 相色谱分离纯化后的物质再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以 进一步分离纯化。9. 一种权利要求1所述的倍半萜类化合物在制备抗菌药物中的应用。10. -种权利要求1所述的倍半萜类化合物在制备抗菌包装中的应用。
【文档编号】C07C67/48GK105924356SQ201610338089
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月21日
【发明人】吴玉萍, 李薇, 孔光辉, 夏振远, 杨光宇, 陈永宽
【申请人】云南省烟草农业科学研究院