用于鉴定狼山鸡种特异性的snp标记及测定snp位点的方法
【专利摘要】本发明涉及用于鉴定狼山鸡种特异性的SNP标记及测定SNP位点的方法。采用特异性SNP位点进行鉴定。本发明根据结果得到的是与其他鸡种相比存在差异的一些SNP位点。根据这些SNP位点的差异，可以把黑羽狼山鸡在不同鸡种中鉴别出来。应用这种分子标记鉴定鸡种，操作相对简单，特异性高而且重复性高，为家禽品种资源的正确保存和合理利用增添了新的科学依据。
【专利说明】
用于鉴定狼山鸡种特异性的SNP标记及测定SNP位点的方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及动物育种学、分子遗传学和分子生物学领域。
【背景技术】
[0002] 狼山鸡(Langshan Chicken)，属兼用型品种，因产地的游览胜地--狼山而得名； 1989年被《中国家禽品种志》收录，2000年被列入国家级畜禽品种资源保护名录。狼山鸡是 我国古老的优良地方品种，并在世界家禽品种中负有盛名。原产地为江苏省南通市如东县， 现全国各地均有饲养。该鸡曾于19世纪后叶输往英国，继而又从英国传入美、德、法、日等 国，载入各国的家禽品种志，并参与当代著名鸡种奥品顿、澳洲黑等鸡种的育成。狼山鸡体 型较大，头昂尾翘，背部较凹，呈"U"字型。头部短圆，俗称蛇头大眼。羽毛多呈黑色，少数呈 白色，偶见黄色。喙呈黑褐色，尖端稍淡。单冠，冠齿5个~6个，冠、肉髯、耳叶均为红色。虹彩 以黄色为主，间有黄褐色。皮肤呈白色。胫呈黑色。 狼山鸡屠体洁白美观、肉质鲜美，具有较好的产蛋性能和蛋品质，在我国为数不多的黑 羽地方鸡种中具有明显特色，是培育黑色鸡种的良好素材。狼山鸡作为一种优良鸡种，不管 是为其保种，还是建立家系和品系工作，都要对鸡种进行明确鉴定和分类。
[0003] 长期以来，主要是以常规形态学标记分析手段进行动物品种分类和真伪鉴定。形 态学标记分析简便、经济，但由于形态学特征常常受环境因素的影响，具有表型可塑性和遗 传可变性，容易导致不正确的分类与鉴定;并且形态学方法无法鉴定许多群体中普遍存在 的隐存分类单元，应用分子生物学技术将有利于品种鉴定。形态学鉴定的局限性和不断缩 减的分类学家队伍，使分类学的发展面临巨大的挑战。
【发明内容】
[0004] 本发明本专利利用简化基因组测序手段对不同鸡种进行测序，通过对不同鸡种间 的DNA序列进行筛查比对，找到含特异性SNP位点的鸡种序列，并对这段序列设计引物进行 PCR扩增和重测序验证，以期通过分子生物学技术手段，找到一种分子标记，可以对不同鸡 种进行更精确的分类。
[0005] 为此本发明采用的技术方案是:一种狼山鸡种的鉴定方法，采用特异性SNP位点进 行鉴定。
[0006]所述SNP位点包括以下位点：
应用时采用其中的一个位点或者几个位点进行狼山鸡种的鉴定。
[0007] -种测定SNP位点的方法，按照以下步骤进行： 1) 提取若干不同鸡种的DNA，进行简化基因组测序，选取Gallus_gallus. WASHUC2.70 作为参考基因组； 2) SNP位点检测:获得每份种质资源平均原始reads，通过与参考基因组比对，过滤低深 度和低完整度，获得位于ddRAD标签上的SNP; 3) 特异性SNP位点筛选:利用perl script程序对这些SNP位点进行比对，找到特异性存 在于狼山鸡中的SNP位点，并对这些SNP位点进行质控，最终筛选得到满足这些条件的特异 性SNP位点。
[0008] 3)步骤后进行引物设计和PCR扩增和检测； 所述PCR扩增和检测:PCR扩增总体积为20仙:1 uL DNA模板，其浓度为100 ngAiL，2 μ L 10XPCR Buffer，1.5 yL dNTP，浓度为 10 m mol/L，上下游引物各 1 yL，浓度为 10 ρ mol/yL，Taq酶为0.2 yL，浓度为5 U/yL，ddH20 13.3 yL;PCR 扩增程序：95 °C预变性5 min，94 °C变性40 s，适宜退火温度40 s，72 °C延伸40 s，35个循环，最后72°C延伸10 min， 4 °C保存备用;把PCR产物进行测序验证。
[0009] 所述引物设计： 对筛选得到的特异性SNP位点在参考基因组中进行染色体定位，获得包含这些SNPs位 点的一段序列。利用不同鸡种DNA作为模板，使用Oligo等软件设计引物进行PCR扩增，引物 序列为：
[0010]所述3)步骤中，质控要求保证所有SNP最小检出率大于85%且保证发生突变的等位 基因频率为100%。
[0011] 所述1)步骤中，鸡种包括黑羽狼山鸡、藏鸡、河南斗鸡、丝羽乌骨鸡、文昌鸡、清远 麻鸡、安义瓦灰鸡、边鸡、寿光鸡、汶上芦花鸡、东乡绿壳蛋鸡、崇仁麻鸡、金湖乌凤鸡、瓢鸡、 大围山微型鸡、惠阳胡须鸡、茶花鸡、仙居鸡、固始鸡、白耳黄鸡、大骨鸡、北京油鸡、萧山鸡、 鹿苑鸡、隐性白羽鸡、淮南麻黄鸡、琅琊鸡、麻城绿壳蛋鸡、如皋黄鸡。
[0012] 所述1)步骤中：对每个鸡品种采集30个样本，其中公鸡10只，母鸡20只；翅静脉采 血0.4 ml，加入0. 5 m ol/L Na2 EDTA抗凝剂2 uL，加入裂解液4 ml后于4°C保存备用； 利用苯酚抽提法提取DNA，进行简化基因组测序，选取Gal lus_gal lus. WASHUC2.70作为参 考基因组。
[0013] 本发明的优点是:本发明根据结果得到的是与其他鸡种相比存在差异的一些SNP 位点。根据这些SNP位点的差异，可以把黑羽狼山鸡在不同鸡种中鉴别出来。应用这种分子 标记鉴定鸡种，操作相对简单，特异性高而且重复性高，为家禽品种资源的正确保存和合理 利用增添了新的科学依据。
【具体实施方式】
[0014] 材料与方法： 实验材料： 选取藏鸡、河南斗鸡、丝羽乌骨鸡、文昌鸡、清远麻鸡、安义瓦灰鸡、边鸡、寿光鸡、汶上 芦花鸡、东乡绿壳蛋鸡、崇仁麻鸡、金湖乌凤鸡、瓢鸡、大围山微型鸡、惠阳胡须鸡、茶花鸡、 仙居鸡、固始鸡、狼山鸡、白耳黄鸡、大骨鸡、北京油鸡、萧山鸡、鹿苑鸡、隐性白羽鸡、淮南麻 黄鸡、琅琊鸡、麻城绿壳蛋鸡、如皋黄鸡29种不同地方鸡种，这些鸡种均来自中国农业科学 研究院家禽科学研究所国家地方禽种资源基因库。其中每个鸡种采集30个样品。
[0015] 简化基因组测序： 对每个鸡品种采集30个样本，其中公鸡10只，母鸡20只。翅静脉采血0.4 ml，加入0. 5 m ol/L Na2 EDTA抗凝剂2 uL，加入裂解液4 ml后于4°C保存备用；利用苯酚抽提法提取 DNA，进行简化基因组测序，选取Gallus_gallus. WASHUC2 · 70作为参考基因组。
[0016] SNP位点检测： 对870份鸡进行简化基因组技术测序，获得每份种质资源平均原始reads，通过与参考 基因组比对，过滤低深度和低完整度，获得ddRAD标签。在与参考基因组比对的基础上，过滤 低完整度和低深度，可以检测到位于ddRAD标签上的SNP。
[0017] 特异性SNP位点筛选： 得到了存在于不同鸡种上的SNP位点，利用perl script程序对这些SNP位点进行比对， 找到特异性存在于狼山鸡中的SNP位点，并对这些SNP位点进行质控(保证SNP检出率100%且 保证发生突变的等位基因频率为100%)，最终筛选得到满足这些条件的特异性SNP位点。 [0018]引物设计： 对筛选得到的特异性SNP位点在参考基因组中进行染色体定位，获得包含这些SNPs位 点的一段序列。利用不同鸡种DNA作为模板，使用Oligo等软件设计引物进行PCR扩增，引物 序列为：
PCR扩增和检测： PCR扩增总体积为20 yL:l yL DNA模板，其浓度为 100 ng/yL，2 yL 10XPCR Buffer， 1.5 yL dNTP，浓度为10 m mol/L，上下游引物各1 yL，浓度为10 p mol/yUTaq酶为0.2 μ L，浓度为5 UAiL，ddH20 13.3 uMPCR扩增程序:95 °C预变性5 min，94 °C变性40 s，适宜 退火温度40 s，72 °C延伸40 s，35个循环，最后72°C延伸10 min，4 °C保存备用;把PCR产物 送入上海生工生物工程股份有限公司进行测序验证。
[0019]结果： 通过简化基因组测序，发现了狼山鸡特异性SNP位点较为丰富且与其他鸡种相比存在 差异的一段序列，设计引物PCR扩增并进行重测序验证。发现黑羽狼山鸡与其他鸡种在这段 序列上存在特异性差异，差异在于在这段序列上黑羽狼山鸡存在特异性的12个SNP位点，其 他鸡种在此区域无这些SNP位点。因此，这些SNP位点可以作为一种鉴定狼山鸡特异性的分 子标记。应用这种分子标记鉴定鸡种，操作相对简单，特异性高而且重复性高，也为家禽品 种资源的正确保存和合理利用增添了新的科学依据。
【主权项】
1. 一种狼山鸡种的鉴定方法，其特征在于，采用特异性SNP位点进行鉴定。2. 根据权利要求1所述的一种狼山鸡种的鉴定方法，其特征在于，所述SNP位点包括W 下位点：应用时采用其中的一个位点或者几个位点进行狼山鸡种的鉴定。3. -种测定如权利要求2所述的SNP位点的方法，其特征在于，按照W下步骤进行： 1) 提取若干不同鸡种的DNA，进行简化基因组测序，选取Gal lus_gal Ius. WAS册C2.70 作为参考基因组； 2. SNP位点检测：获得每份种质资源平均原始reads,通过与参考基因组比对，过滤低深 度和低完整度，获得位于ddRAD标签上的SNP; 3) 特异性SNP位点筛选:利用perl script程序对运些SNP位点进行比对，找到特异性存 在于狼山鸡中的SNP位点，并对运些SNP位点进行质控，最终筛选得到满足运些条件的特异 性SNP位点。4. 根据权利要求3所述的测定SNP位点的方法，其特征在于，3)步骤后进行引物设计和 PCR扩增和检测； 所述PCR扩增和检测:PCR扩增总体积为20 yL:l yL DNA模板，其浓度为100 ng/yL，2 y L IOXPCR Buffer，1.5 yL dNTP，浓度为10 m mol/L，上下游引物各1化，浓度为10 P mol/yL，Taq酶为0.2化，浓度为5 U/yL，ddH20 13.3化;PCR扩增程序：95 °C预变性5 min，94 °C变性40 S，适宜退火溫度40 s，72 °C延伸40 s，35个循环，最后72°C延伸10 min， 4 °C保存备用;把PCR产物进行测序验证。5. 根据权利要求4所述的测定SNP位点的方法，其特征在于，所述引物设计： 对筛选得到的特异性SNP位点在参考基因组中进行染色体定位，获得包含运些SNPs位 点的一段序列； 壬||田末同7应壬由。~14化击照? /(击田…1-。。竺：恤化巧'^+曰1物1*；世分；口(-口壬广+齒引物I良列为.6. 根据权利要求3所述的测定SNP位点的方法，其特征在于，所述3)步骤中，质控要求保 证SNP检出率100%且保证发生突变的等位基因频率为100%。7. 根据权利要求3所述的测定SNP位点的方法，其特征在于，所述1)步骤中，鸡种包括黑 羽狼山鸡、藏鸡、河南斗鸡、丝羽乌骨鸡、文昌鸡、清远麻鸡、安义瓦灰鸡、边鸡、寿光鸡、议上 芦花鸡、东乡绿壳蛋鸡、崇仁麻鸡、金湖乌凤鸡、瓢鸡、大围山微型鸡、惠阳胡须鸡、茶花鸡、 仙居鸡、固始鸡、白耳黄鸡、大骨鸡、北京油鸡、萧山鸡、鹿苑鸡、隐性白羽鸡、淮南麻黄鸡、巧 挪鸡、麻城绿壳蛋鸡、如皋黄鸡。8. 根据权利要求3所述的测定SNP位点的方法，其特征在于，所述1)步骤中：对每个鸡品 种采集30个样本，其中公鸡10只，母鸡20只；翅静脉采血0.4 ml,加入0. 5 m ol/L Na2 EDTA抗凝剂2化，加入裂解液4 ml后于4°C保存备用；利用苯酪抽提法提取DNA，进行简化 基因组测序，选取Gallus_galIus. WAS皿C2.70作为参考基因组。
【文档编号】C12Q1/68GK105907867SQ201610354470
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】韩威, 李国辉, 王洪志, 朱云芬, 张会永, 殷建玫, 盛中伟, 邹剑敏, 王克华, 苏军, 苏一军
【申请人】江苏省家禽科学研究所