一种对基因甲基化硫化转化修饰的方法及其试剂盒的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种对基因甲基化硫化转化修饰的方法及其试剂盒。准备硫化转化反应体系：100ul DNA样品+190ul硫化试剂+30ul DNA保护液，80°C反应1小时，之后20°C保存至20小时；所述硫化试剂为亚硫酸氢铵和无水亚硫酸钠的混合溶液，所述DNA保护液为四氢呋喃和VE的混合液。试剂盒，包括硫化试剂和DNA保护液，所述硫化试剂为亚硫酸氢铵和无水亚硫酸钠的混合溶液，所述DNA保护液为四氢呋喃和VE的混合液。本发明首次使用亚硫酸氢铵和无水亚硫酸钠的混合溶液作为DNA甲基化的硫化试剂。本发明具有硫化完全、受污染小、操作简单省时、安全性等优点。
【专利说明】
一种对基因甲基化硫化转化修饰的方法及其试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及基因硫化转化领域，特别是涉及一种对基因甲基化分析中硫化转化修饰的方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002]DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DWT)的催化下，S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3，上，其中，80%的CpG二核苷酸是被甲基修饰的，其余的20%非甲基化的CpG二核苷酸高度聚集，广泛分布于启动子区域以及编码基因的第一外显子区，命名为CpG岛。CpG岛异常甲基化是肿瘤发生发展的一个重要因素，由于CpG岛的局部高度甲基化要早于细胞恶性增生，故其甲基化的检测可用于肿瘤的预测。甲基化可作为肿瘤等早期诊断的生物标记物和预后评估指标，对肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测都具有重要的意义。
[0003]DNA甲基化分析通常需要对DNA进行硫化转化修饰。提取的游离DNA经过硫化试剂作用，DNA上未甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，再通过特异性的引物和探针进行PCR即可得到目的基因的甲基化情况及水平。
[0004]目前市场上常见的甲基化硫化方法大部分都是使用亚硫酸氢钠作为硫化试剂。亚硫酸氢钠极其难溶，配制不方便且浪费时间，而且其硫化强度较弱，硫化所需时间较长，一般需要2-3个小时甚至是过夜。
【发明内容】
[0005]为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种对基因甲基化硫化转化修饰的方法及其试剂盒，硫化效率高、硫化完全、操作简单省时。
[0006]—种对基因甲基化硫化转化修饰的方法，准备硫化转化反应体系:10ul DNA样品+ 190ul硫化试剂+30ul DNA保护液，80° C反应I小时，之后20° C保存至20小时;所述硫化试剂为亚硫酸氢钱和无水亚硫酸钠的混合溶液，所述DNA保护液为四氢呋喃和VE的混合液。
[0007]所述DNA样品为人类基因组DNA。
[0008]所述DNA样品为人类正常基因组DNA或病变基因组DNA;来源于组织细胞DNA、外周血细胞DNA、外周血血清或血浆DNA、体液DNA或排泄物细胞DNA。
[0009]—种采用根据所述方法的对基因甲基化硫化转化修饰的试剂盒，包括硫化试剂和DNA保护液，所述硫化试剂为亚硫酸氢铵和无水亚硫酸钠的混合溶液，所述DNA保护液为四氢呋喃和VE的混合液。
[0010]所述的试剂盒，进一步包括阴性质控品、阳性质控品和无模板对照，所述阳性质控品为亚硫酸氢盐修饰的全甲基化人类基因组DNA，所述阴性质控品为亚硫酸氢盐修饰的非甲基化人类基因组DNA。
[0011]本发明的有益效果是:本发明的对基因甲基化检测中硫化转化修饰的方法，具有硫化效率高、硫化完全、试剂配制省时便宜、操作简单快速、安全性等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，对基因甲基化硫化转化修饰提供了一种更好的方法。
【附图说明】
[0012]图1是本发明的对基因甲基化检测中硫化转化修饰后中甲基化模板和非甲基化模板的不意图；
图2是利用本发明的对基因甲基化硫化转化修饰方法一较佳实施例中septin9甲基化检测扩增曲线图。
[0013]图3是利用本发明的对基因甲基化硫化转化修饰方法和市场上常用的硫化转化修饰方法一较佳实施例中septin9甲基化检测扩增曲线对比图。
【具体实施方式】
[0014]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0015]如图1所示，经过硫化转化修饰后，DNA上未甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，再通过特异性的引物和探针进行PCR即可得到目的基因的甲基化情况及水平。
实施例
[0016]材料:待检血浆样本、阳性质控品、阴性质控品。
[0017]仪器:Lightcycler 480、nanodrop 1000、高速离心机、水浴锅、漩祸震荡仪、灭菌锅。
[0018]试剂:亚硫酸氢铵(日本WAKO公司)、无水亚硫酸钠(Aladdin)、四氢呋喃(Aladdin)、VE(Aldrich)；
硫化反应的体系和反应条件:所述硫化反应体系的组成为:10ul DNA+190ul硫化试剂+30ul DNA保护液。所述DNA—般为0.5ng?2ng。硫化试剂为90%(v/v)的亚硫酸氢铵和
0.1g/mL的无水亚硫酸钠的混合液。所述DNA保护液为四氢呋喃和VE的混合液。
[0019]所述硫化转化反应的具体条件为:80°C反应I hours，20°C保存至20 hours。
[0020]进行上述硫化转化反应后，对修饰后DNA进行纯化回收，最后进行P CR检测，septin9甲基化扩增曲线如图2所示。
[0021]本技术发明人用市场上常用的zymo硫化方法和本发明提供的硫化方法做对比实验，验证了本发明提供的DNA甲基化硫化转化修饰反应对后续反应不会产生负面影响，如图3所示。
[0022]本发明中的对基因甲基化检测方法中硫化转化修饰方法的优点有:(I)无水亚硫酸钠在亚硫酸氢铵中极易溶解，硫化试剂配制简单省时。(2)该方法全过程只需I个小时，且不需要98°C高温解链，实验操作简便快捷。(3)硫化完全，在(90%)非甲基化DNA存在的背景下仍能检测到目的基因的甲基化；(4)硫化效率高，0.1ng阳性DNA经过本发明提供的硫化转化修饰方法仍能全部检出。(5)安全，整个体系不包含有毒有害物质，对试验人员以及环境都无危害。
[0023]以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1.一种对基因甲基化硫化转化修饰的方法，其特征在于，准备硫化转化反应体系:10ul DNA样品+ 190ul硫化试剂+30ul DNA保护液，80° C反应I小时，之后20° C保存至20小时;所述硫化试剂为亚硫酸氢铵和无水亚硫酸钠的混合溶液，所述DNA保护液为四氢呋喃和VE的混合液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA样品为人类基因组DNA。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述DNA样品为人类正常基因组DNA或病变基因组DNA ；来源于组织细胞DNA、外周血细胞DNA、外周血血清或血浆DNA、体液DNA或排泄物细胞DNA。4.一种采用根据权利要求1所述方法的对基因甲基化硫化转化修饰的试剂盒，其特征在于，包括硫化试剂和DNA保护液，所述硫化试剂为亚硫酸氢铵和无水亚硫酸钠的混合溶液，所述DNA保护液为四氢呋喃和VE的混合液。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括阴性质控品、阳性质控品和无模板对照，所述阳性质控品为亚硫酸氢盐修饰的全甲基化人类基因组DNA，所述阴性质控品为亚硫酸氢盐修饰的非甲基化人类基因组DNA。
【文档编号】C12Q1/68GK105907854SQ201610272926
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】徐笑红
【申请人】浙江省肿瘤医院