一种植物多肽/蛋白的清洁制备方法

一种植物多肽/蛋白的清洁制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种分子量区间可控的植物多肽/蛋白的清洁制备方法，包括以下步骤：(1)原料预处理；(2)调浆；(3)提取与分离；(4)净化，得蛋白液；(5)酶解：将上述蛋白液加热变性；加入Na2SO3，再加入蛋白酶；蛋白酶选自：Alcalase碱性蛋白酶，AS1398中性蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶；(6)多肽脱苦；(7)用纳滤膜进行分离，得多肽溶液；(8)干燥失水得多肽产品。通过该方法制备得到的产品，分子量区间可控，具有高溶解性、低粘度、酸溶稳定性、低苦味等特性。本发明的产品可被广泛应用于食品、运动食品、疗效保健食品、蛋白饮料、减肥食品、新型发酵食品中。
【专利说明】
一种植物多肽/蛋白的清洁制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种植物多肽/蛋白的清洁制备方法，特别涉及一种以玉米、小麦、大 豆等为原料，首先经过预处理、分离、纯化制备预备型植物蛋白，然后经现代生物技术、分离 技术制备的分子量区间可控的多肽产品的清洁制备方法。
【背景技术】
[0002] 肽由2个或2个以上氨基酸脱水缩合而成，是蛋白质机构和功能的片段，并使蛋白 质具有各种生理功能，其本身也具有很强的特殊的生理功能。由2个或3个氨基酸脱水缩合 而成的，分别成为二肽和三肽，以此类推为四肽、五肽等。一般而言，肽链上氨基酸数目在10 以下为寡肽，达到10~50个为多肽，50个以上为蛋白质。多肽是人体自身存在而且必须的活 性物质、营养物质，几乎广泛分布于动物及人类全身，特别是大脑，几乎对所用的细胞都有 调节作用，如缺失，免疫系统、各功能系统就会发生紊乱。
[0003] 过去人们认为，动物摄取的蛋白质在消化道内经蛋白酶和肽酶的作用降解为寡肽 片段和游离氨基酸，而只有游离氨基酸才能被动物直接吸收利用，寡肽则只有再降解成游 离氨基酸才能被利用。但现代营养学研究发现，人类摄食蛋白质经消化道的酶作用后，大多 是以2~7个氨基酸组成的寡肽形式被消化吸收的，以游离氨基酸形式吸收的比例很小。进 一步的试验又揭示了寡肽比游离氨基酸消化更快、吸收更多，表明肽的生物效价和营养价 值比游离氨基酸更高。寡肽有助于肠道吸收，这是因为:肽中氨基酸残基吸收速度大于等量 游离氨基酸吸收速度，肽吸收可避免游离氨基酸之间的吸收竞争，间接提高吸收效果，减少 不必要的能量消耗，因为吸收一个寡肽所消耗的动能等同于吸收多个氨基酸所需的动能。 因此寡肽较易吸收，且不受氨基酸的影响，因此，当动物由于疾病或其他因素对某种氨基酸 不能很好吸收时，可通过添加含有此种氨基酸的寡肽来提供氨基酸。寡肽的这种吸收优势 具有很大的潜在的营养作用。近年来，天然药物、自然疗法己开始被西方社会认识。美国FDA 1999年开始允许大?蛋白制品标注预防心血官疾病的功能，这就意味着健康与保健品将 被人类社会重新认识。
[0004] 功能性植物多肽是将大分子植物蛋白质（植物蛋白由于溶解度低，无法作为功能 性成分在乳品、饮料、糖果等食品体系中加以利用;而且，有些植物蛋白具有一定的抗原性， 再加上植物蛋白质的消化率和生物效价远不及牛奶、鸡蛋等动物性蛋白，这大大限制了植 物蛋白的利用范围）利用现代生物技术切割成小分子片段，以产生原植物蛋白所不具有的 生物调节功能，一方面供人体生长发育所需的营养物质，促进人体对蛋白质、维生素及微量 元素的吸收；另一方面发挥其特有的生理学功能，如：降低血脂、延缓衰老、美体养颜、抗氧 化、抗忧郁、改善睡眠、增强记忆、抑制肿瘤等。现已广泛的应用于医药、保健、食品、化妆品 等tx业。
[0005] 目前，市场上的植物多肽产品，平均分子量较大，特定区间分子量占比不可控，而 不同分子量多肽的作用机理、作用效果不同，所以其发挥作用的可控性较差。因此，尚有改 进的必要。

【发明内容】

[0006] 针对上述现有技术，本发明提供了一种分子量区间可控的植物多肽/蛋白的清洁 制备方法，通过该方法制备得到的产品，分子量区间可控，具有高溶解性、低粘度、酸溶稳定 性、低苦味等特性;在营养及生理功能方面，具有易消化吸收、低抗原性、加速肌肉恢复疲 劳、促进脂肪代谢、降低胆固醇、防治肝性脑病、辐射保护作用、强抗氧化性以及降血压等生 理功能。本发明的产品可被广泛应用于食品、运动食品、疗效保健食品、蛋白饮料、减肥食 品、新型发酵食品中。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008] -种分子量区间可控的植物多肽/蛋白的清洁制备方法，包括以下步骤：
[0009] (1)原料预处理:取原料(选自大豆柏、花生柏、玉米黄粉、小麦胚芽），进行超声波 预处理300~800秒，然后粉碎，过10~100目筛，备用；
[0010] (2)调浆:在搅拌条件下，将上述粉碎过筛的原料缓慢加入pH值为9~10的碱溶液 中，控制固液比为1:5~15 (质量比），得浆液；
[0011] 所述碱溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钙溶液或/和氨水；
[0012] (3)提取与分离:在搅拌条件下，将上述浆液升温至40~70°C，反应1~5h，以充分 浸提，使蛋白充分溶出；反应后，固液分离(过滤），得上清液，备用;所得固态物质，干燥后可 作为尚纤维副广品，用于制备食品或伺料广品；
[0013] (4)净化:调节上述上清液的pH至3~5(用酸调节，可以是盐酸、硫酸、乙酸等），静 置(使蛋白质充分絮凝），然后固液分离，得到粗蛋白，用95% (体积百分数)乙醇溶液洗涤两 次，以除去醇溶性物质，然后再用水洗至中性，得质量浓度为5%~20%的中性蛋白液(可直 接负压干燥制备得植物蛋白质产品）；
[0014] (5)酶解:将上述蛋白液加热至80°C~100°C，变性lOmin~30min;然后，加入0.1% 的Na 2S03(按干物质计），搅拌均匀，再加入蛋白酶（蛋白酶的加入量为粗蛋白质量的1 %~ 5 % )，在30~70 °C下酶解3~24h，得水解液；
[0015] 所述蛋白酶选自以下蛋白酶中的一种或任几种:Alcalase碱性蛋白酶（可购自 Novo公司），AS1398中性蛋白酶(可购自Novo公司），胃蛋白酶(可购自Sigma公司），木瓜蛋白 酶(可购自河南郑州酶制剂厂）；
[0016] (6)多肽脱苦:上述水解液，在25~30°C条件下，通过活性碳柱，或直接加入活性炭 (活性炭的用量为多肽质量的30%~50%)，活性炭脱色后固液分离，再加入β-环糊精（用量 为多肽质量的6 %~10 % )，进行脱苦处理，得无苦味水解液；
[0017]优选的，所述活性碳柱的规格为直径0.5米，高3.5米活性碳柱，控制流速为0.5方/ 小时；
[0018] (7)上述无苦味水解液，用纳滤膜进行分离(操作压力为10~500psi)，得多肽，调 整纳滤膜的截留分子量，可得到不同分子量区间的产品，比如:通过调整纳滤膜的截留分子 量，可得到以下液体产品：
[0019] ①具有高ACE活性抑制率产品：多肽相对分子质量为628.7，氨基酸序列为Tyr-Gly-Asn-Leu-Tyr〇
[0020] ②具有高清除.0H的多肽产品：以相对分子质量为268的二或三肽为主，并含有少 量相对分质量为670的组分，主要由Ser、Gly、Tyr、Phe和I le组成。
[0021] ③具有抗氧化功能的玉米多肽产品：分子量分布在lOOODa以下，主要集中在500~ 600Da 左右，富含 Glu、Ala、Leu 和 Pro。
[0022] ④分子量2000Da以下的大豆肽，具有较强的抗氧化活性，试验确认具有抗氧化活 性的大豆肽的主要分子量在llOODa左右。
[0023] (8)上述液体产品，经过冷冻干燥、负压干燥等方式失水得产品，产品纯度较产品 质量标准GB/T22492-2008要求蛋白含量(90 % )提高5 %~10 %，肽含量(80 % )提高15 %~ 20 % ;较质量标准QB/T4707-2014要求蛋白含量(80 % )提高10 %~15 %，肽含量（70 % )提 20%~30%。国家标准和行业标准基于目前市场产品制定，总体体现和代表了传统市场流 通产品的质量水平，本发明的产品的纯度明显高于国家标准和行业标准，产品的质量水平 更尚。
[0024] 植物多肽ACE活性的测定方法为:样品溶于超纯水，离心（7200 X g，15min)，取上清 液进行ACE抑制活性测定。取10yL样品和40yL2.17mmol/L底物(hippuryl-L-His-L-Leu溶于 pH8.30.05mol/L硼酸缓冲液，其中含0.3mol/LNaCl)于 37°C 保温6min，加入 20yLACE(0.1U 溶 于1. OmL相同的缓冲液中），37°C下反应30min后，加入80yL lmol/L的HCI溶液终止反应，至 室温取10此反应产物进样，通过RP-HPLC洗脱图谱测定马尿酸生成量，以马尿酸的生成量来 判断样品对ACE活性的抑制作用，同时做空白对照。
[0025]
[0026] 色谱条件：
[0027] HPLC系统：HEWLETT PACKARD SERIES1050;
[0028] 色谱柱：Symmetry C183 · 9mm X 150mm PN；
[0029] 流速：1 .OmL/min;
[0030] 检测波长：228nm;
[0031] 进样量：10yL;
[0032] 柱温：30 Γ;
[0033] 流动相：12%乙腈(含0.5%乙酸）。
[0034] 本发明的分子量区间可控的植物多肽/蛋白的清洁制备方法，具有以下优点：
[0035] (1)利用"碱溶酸沉"法制备出高含量的植物蛋白，为提取植物活性肽提供高品质 的原料。
[0036] (2)采用纳滤分离技术，实现了对特殊功效分子量区间产品的有效控制。
[0037] (3)采用活性炭柱的方式，提高了生产效率，实现了工序的连续运行，和β_环糊精 搭配使用，使脱苦效果提高，增加了植物多肽的使用范围。
[0038] 利用本发明的方法制备得到的产品，分子量区间可控，具有高溶解性、低粘度、酸 溶稳定性、低苦味等特性;在营养及生理功能方面，具有易消化吸收、低抗原性、加速肌肉恢 复疲劳、促进脂肪代谢、降低胆固醇、防治肝性脑病、辐射保护作用、强抗氧化性以及降血压 等生理功能。本发明的产品可被广泛应用于食品、运动食品、疗效保健食品、蛋白饮料、减肥 食品、新型发酵食品中。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0040] 下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有 的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检 测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
[0041 ]实施例1以大豆柏为原料制备植物多肽 [0042] 步骤如下：
[0043] (1)原料预处理:首先对大豆柏进行检测，保证无腐败发霉现象，然后，进行超声波 预处理360秒，然后粉碎，过60目筛，备用。
[0044] (2)调浆:在搅拌条件下，将上述粉碎过筛的原料缓慢加入pH值为9.5的氢氧化钠 溶液中，固液比为1:1 〇(质量比）。
[0045] (3)提取与分离：在搅拌条件下，升温至55±2°C，反应2.5h，以充分浸提;反应后， 固液分离，得上清液，备用。
[0046] (4)净化:调节上述上清液的pH至5,静置以使蛋白质充分絮凝，然后固液分离，得 到粗蛋白，用95%乙醇溶液洗涤2次，除去醇溶性物质，水洗至中性，配制得质量浓度为 12.5%的中性蛋白液。
[0047] (5)酶解:上述蛋白液加热至90°C，变性25min，然后加入0.1 %Na2S03预处理;然后， 再加入质量分数为1.5 %的碱性蛋白酶(Alcalase碱性蛋白酶，购自Novo公司），60°C下酶解 3h，得水解液。
[0048] (6)多肽脱苦:上述水解液，经过28 °C活性碳柱(直径0.5米，高3.5米，控制流速为 〇. 5方/小时），再加入2%β-环糊精(按多肽含量计)进行脱苦处理(40°C，25min);得无苦味 水解液。
[0049] (7)上述无苦味水解液，过纳滤膜系统:一号膜孔径为2000,二号膜孔径为1000;操 作压强为60pis;膜分离后干燥得到产品：过一号膜前为产品A;过一号膜后、二号膜前产品 为B;过二号膜后产品为C，产品A、B、C的情况如表1所示:产品A与质量标准(GB/T2249-2008) 要求粗蛋白（90% )妝含量（80% )相当，广品B车父标准粗蛋白含量提尚5.5%，妝含量提尚 16% ;广品Cfe标准粗蛋白含量提尚8.8%，妝含量提尚18.7%。
[0050] 表 1
[0051]
[0052]实施例2以花生柏为原料制备植物多肽 [0053] 步骤如下：
[0054] (1)原料预处理:首先对花生柏进行检测，保证无腐败发霉现象，然后，进行超声波 预处理600秒，然后粉碎，过80目筛，备用。
[0055] (2)调浆:在搅拌条件下，将上述粉碎过筛的原料缓慢加入pH值为9.5的碱溶液氢 氧化钠溶液中，固液比为1:12(质量比）。
[0056] (3)提取与分离:在搅拌条件下，升温至55±2°C，反应3h，以充分浸提;反应后，固 液分离，得上清液，备用。
[0057] (4)净化：调节上述上清液的pH至4.5,静置以使蛋白质充分絮凝，然后固液分离， 得到粗蛋白，用95%乙醇溶液洗涤2次，除去醇溶性物质，水洗至中性，配制得质量浓度为 15%的中性蛋白液。
[0058] (5)酶解:上述蛋白液加热至80°C，变性30min，然后加入0.1 %Na2S03预处理;然后， 再加入质量分数为3 %的碱性蛋白酶，60°C下酶解3h，得水解液。
[0059] (6)多肽脱苦：上述水解液，先用35%粉末状活性炭（按多肽含量计）25°C下吸附 40min，抽滤去除活性炭，再加入2%β-环糊精(按多肽含量计)进行脱苦处理(40°C，25min); 得无苦味水解液。
[0060] (7)上述无苦味水解液，过纳滤膜系统：一号膜孔径为2000,二号膜孔径为1000;操 作压强为60pis;膜分离后干燥得到产品：过一号膜前为产品A;过一号膜后、二号膜前产品 为B;过二号膜后产品为C，产品A、B、C的情况如表2所示:产品A与质量标准(GB/T2249-2008) 要求粗蛋白（90% )妝含量（80% )相当，广品B车父标准粗蛋白含量提尚6.7%，妝含量提尚 16.3% ;广品Cfe标准粗蛋白含量提尚10%，妝含量提尚21.25%。
[0061] 表 2
[0062]
LUUW」 头施例3以土术頁粉艿原科制爸植物多肱 [0064] 步骤如下：
[0065] (1)原料预处理:首先对玉米黄粉进行检测，保证无腐败发霉现象，然后，进行超声 波预处理380秒，然后粉碎，过100目筛，备用。
[0066] (2)调浆:在搅拌条件下，将上述粉碎过筛的原料缓慢加入pH值为9.5的氢氧化钠 溶液中，固液比为1:8(质量比）。
[0067] (3)提取与分离:在搅拌条件下，升温至55±2°C，反应3h，以充分浸提;反应后，固 液分离，得上清液，备用。
[0068] (4)净化：调节上述上清液的pH至4.5,静置以使蛋白质充分絮凝，然后固液分离， 得到粗蛋白，用95%乙醇溶液洗涤2次，除去醇溶性物质，水洗至中性，配制得质量浓度为％ 的中性蛋白液。
[0069] (5)酶解:上述蛋白液加热至80°C，变性30min，然后加入0.1 %Na2S03预处理;然后， 再加入质量分数为3 %的碱性蛋白酶，60°C下酶解3h，得水解液。
[0070] (6)多肽脱苦:上述水解液，先过30 °C活性炭柱(直径0.5米，高3.5米，控制流速为 〇. 5方/小时），再加入2%β-环糊精(按多肽含量计)进行脱苦处理(40°C，25min);得无苦味 水解液。
[0071] (7)上述无苦味水解液，过纳滤膜系统:一号膜孔径为2000,二号膜孔径为1000;操 作压强为60pis;膜分离后干燥得到产品：过一号膜前为产品A;过一号膜后、二号膜前产品 为B;过二号膜后产品为C，产品A、B、C的情况如表3所示:产品A与质量标准(QB/T4707-2014) 要求粗蛋白（80% )妝含量(70 % )相当，广品B车父标准粗蛋白含量提尚12.5 %，妝含量提尚 6.3% ;广品Cfe标准粗蛋白含量提尚15%，妝含量提尚30%。
[0072] 表 3
[0073]
LUUM」买施例4以小麦胜芽为原科制爸桓物多肱 [0075] 步骤如下：
[0076] (1)原料预处理:首先对小麦胚芽进行检测，保证无腐败发霉现象，然后，进行超声 波预处理500秒，然后粉碎，过80目筛，备用。
[0077] (2)调浆:在搅拌条件下，将上述粉碎过筛的原料缓慢加入pH值为9.5的氢氧化钠 溶液中，固液比为1:11 (质量比）。
[0078] (3)提取与分离：在搅拌条件下，升温至60±2°C，反应3.5h，以充分浸提;反应后， 固液分离，得上清液，备用。
[0079] (4)净化：调节上述上清液的pH至5,静置以使蛋白质充分絮凝，然后固液分离，得 到粗蛋白，用95%乙醇溶液洗涤2次，除去醇溶性物质，水洗至中性，配制得质量浓度为1% 的中性蛋白液。
[0080] (5)酶解:上述蛋白液加热至90°C，变性25min，然后加入0.1 %Na2S〇3预处理;然后， 再加入质量分数为1.5 %的碱性蛋白酶，60°C下酶解3h，得水解液。
[0081] (6)多肽脱苦：上述水解液，先用40%粉末状活性炭（按多肽含量计）25°C下吸附 60min，抽滤去除活性炭，再加入2%β-环糊精(按多肽含量计)进行脱苦处理(40°C，25min); 得无苦味水解液。
[0082] (7)上述无苦味水解液，过纳滤膜系统:一号膜孔径为2000,二号膜孔径为1000;操 作压强为60pis;膜分离后干燥得到产品：过一号膜前为产品A;过一号膜后、二号膜前产品 为B;过二号膜后产品为C，产品A、B、C的情况如表4所示:产品A与质量标准(GB/T2249-2008) 要求粗蛋白（90% )妝含量（80% )相当，广品B车父标准粗蛋白含量提尚5.5%，妝含量提尚 16.3% ;广品Cfe标准粗蛋白含量提尚8.9%，妝含量提尚17.8%。
[0083]表 4
【主权项】
1. 一种分子量区间可控的植物多肽/蛋白的清洁制备方法，其特征在于：包括以下步 骤： (1) 原料预处理:取原料，进行超声波预处理300~800秒，然后粉碎，过10~100目筛，备 用;所述原料选自大豆柏、花生柏、玉米黄粉或/和小麦胚芽； (2) 调浆:在搅拌条件下，将上述粉碎过筛的原料加入pH值为9~10的碱溶液中，控制固 液比为1:5~15,得浆液； 所述碱溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钙溶液或/和氨水； (3) 提取与分离:在搅拌条件下，将上述浆液升温至40~70°C，反应1~5h;反应后，固液 分离，得上清液，备用； (4) 净化:调节上述上清液的pH至3~5,静置使蛋白质充分絮凝，然后固液分离，得到粗 蛋白，用95%乙醇溶液洗涤两次，然后再用水洗至中性，得蛋白液； (5) 酶解:将上述蛋白液加热至80°(：~100°(：，变性101^11~301^11;然后，加入0.1%的 Na2SO3，搅拌均匀，再加入蛋白酶，在30~70 °C下酶解3~24h，得水解液； 所述蛋白酶选自以下蛋白酶中的一种或任几种:Alcalase碱性蛋白酶，ASl 398中性蛋 白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶； (6) 多肽脱苦：上述水解液，在25~30°C条件下，通过活性碳柱，或直接加入活性炭，活 性炭脱色后固液分离，再加入β-环糊精，进行脱苦处理，得无苦味水解液； (7) 上述无苦味水解液，用纳滤膜进行分离，操作压力为10~500psi，得多肽溶液； (8) 上述多肽溶液，经干燥失水得多肽产品。2. 根据权利要求1所述的分子量区间可控的植物多肽/蛋白的清洁制备方法，其特征在 于:所述步骤(5)中，蛋白酶的加入量为粗蛋白质量的1%~5%。3. 根据权利要求1所述的分子量区间可控的植物多肽/蛋白的清洁制备方法，其特征在 于:所述步骤(6)中，活性炭的用量为多肽质量的30 %~50%，β-环糊精的用量为多肽质量 的6%~10%〇4. 根据权利要求1所述的分子量区间可控的植物多肽/蛋白的清洁制备方法，其特征在 于:所述步骤(6)中，活性碳柱的规格为直径0.5米，高3.5米活性碳柱，控制流速为0.5方/小 时。5. 利用权利要求1~4中任一项所述的分子量区间可控的植物多肽/蛋白的清洁制备方 法制备得到的多肽产品或蛋白产品。6. 根据权利要求6所述的多肽产品，其特征在于:所得多肽产品包括以下产品： ① 具有高ACE活性抑制率产品：多肽相对分子质量为628.7,氨基酸序列为Tyr-Gly-Asn-Leu-Tyr； ② 具有高清除.OH的多肽产品：以相对分子质量为268的二或三肽为主，并含有少量相 对分质量为670的组分，主要由 ③ 具有抗氧化功能的玉米多肽产品：分子量分布在1000 Da以下，主要集中在500~ 600Da 左右，富含 Glu、Ala、Leu 和 Pro; ④ 分子量2000Da以下的大太。
【文档编号】C12P21/06GK105907826SQ201610424855
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】刘钦松, 庄新霞, 刘孟刚, 张念强, 许彤, 陈小刚, 刘庆忠
【申请人】山东博奥克生物科技有限公司