能够诱导针对猪蓝耳病毒的免疫应答的亚单位疫苗的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种如SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列的融合基因。本发明还公开一种如SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列的融合基因所编码的蛋白。本发明还公开一种能够诱导针对猪蓝耳病毒的免疫应答的亚单位疫苗，其特征在于，所述亚单位疫苗包含如上所编码的蛋白。本发明提供的亚单位疫苗不仅能够激发B细胞免疫产生抗体，更能够充分激发T细胞免疫，T细胞免疫对PRRSV这类对免疫系统有抑制作用的病毒的清除是非常重要的，从而能够有效保护猪只，减少被蓝耳病病毒感染，用于防治猪蓝耳病。
【专利说明】
能够诱导针对猪蓝耳病毒的免疫应答的亚单位疫苗
技术领域
[0001] 本发明涉及分子免疫学和农学的基因工程技术领域，特别涉及一种能够诱导针对 猪蓝耳病毒的免疫应答的亚单位疫苗，用于预防猪呼吸和免疫系统综合征(PRRS，俗称蓝耳 病)。
【背景技术】
[0002] 猪蓝耳病(PRRS)是一种具有高度传染性和高度破坏性的疾病，呈地域性爆发和流 行性，是养猪业头号传染病威胁。随着社会的发展和人民生活水平的提高，对肉、蛋、奶等畜 牧养殖业产品的需求越来越高。而基于我们的传统和生活习惯，猪肉又是占了需求中的重 中之重。生猪养殖业在市场需求的刺激下迅速蓬勃发展，已经逐渐形成了集约化，规模化的 养殖模式。
[0003] 这种模式在提高效率和节约成本的同时，也带来了由于养殖密度过大等原因造成 的各种传染病多发。例如，养猪业最常见的猪生殖与呼吸综合症(俗称)蓝耳病等病毒性疾 病。蓝耳病是由猪生殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)引起的。该病毒传染性极强，可通过空气， 接触，体液，血液等多种方式传播，且感染后死亡率极高。被感染的断奶前仔猪的死亡率高 达80-100%。
[0004]由于PRRSV的基因组DNA复制不具有严格的纠错机制，所以病毒在全世界各地传播 时，随着时间的推移和空间距离的增大，产生出了各种变种亚型。已知在中国主要流行的的 蓝耳病亚型-中国高致病性亚型(HP-PRRSV)就是PRRSV北美亚型病毒的在进入中国之后，由 于基因突变产生的一个变种。
[0005] 蓝耳病病毒具有很强的种属特异性，只感染猪类，各种品种、不同年龄和性别的猪 只均可感染，但以妊娠期母猪和断奶前一月龄以内的仔猪最易感染。患病猪和无临床症状 的病毒携带者是本病的重要传染源。传染途径多样化，包括接触感染、体液传播、空气传播 和精液传播，蓝耳病病毒可以穿透血胎屏障，因此孕猪可以通过胎盘垂直传播给仔猪。易感 猪与带毒猪直接接触或与污染有PRRSV的猪舍、运输工具、水源和食物接触均可受到感染。 猪群一旦感染蓝耳病，用常规方法就很难清除。持续性感染是PRRS流行病学的重要特征， PRRSV可在感染猪体内存在很长时间。
[0006] 在国内，接种传统的灭活病毒疫苗和减毒疫苗是防治蓝耳病等的主要方式。
[0007] 目前的减毒苗主要分为两类，第一类是源自经典毒株的减毒苗，例如哈兽研、海 利、大北农和易邦生产的CH1R株苗，南农高科和瑞普生产的R98株和勃林格VR2332株等。该 类苗毒力相对较低，虽然注射后在猪群中持续存在，但是不容易产生病毒复活感染的现象。 缺点是与目前流行毒株亲缘关系较远;对高致病性蓝耳病仅仅有部分同源性，保护力不足。 第二类是源自高致病性蓝耳病病毒的弱毒苗，目前有江西株和湖南株两种，源自变异的高 致病性蓝耳病毒株，分离自2006年。这一类弱毒苗与现在国内流行毒株同源性较高，相对于 灭活苗的免疫保护效率更高，表现为可降低感染压力，减轻病毒血症，减少排毒，防止由蓝 耳病引起的呼吸系统、生殖系统疾病，防止由蓝耳病引起的繁殖障碍。但是弱毒苗的缺点也 十分明显:残余毒力较强，对于种猪和低日龄仔猪应用安全性不确定，并且在猪体内存在时 间长，容易发生毒力返强，在这种情况下，减毒疫苗非但不能治病，反而成了助纣为虐的特 洛伊木马，协助病毒攻破猪的免疫系统。存在免疫抑制作用，接种毒力偏强的PRRS弱毒疫苗 可能导致免疫抑制，主要表现为持续免疫某种PRRS弱毒疫苗一定时期后，猪群继发感染加 重，猪场生产水平持续恶化。这是许多猪场认为免疫PRRS疫苗无效甚至有害的根源。
[0008] 目前国内养殖业预防和治疗蓝耳病等病毒性传染病还依赖大量使用化学药物，例 如病毒灵(盐酸吗啉胍)等。而化药除了治疗病毒性传染病特异性差、副作用强等缺点外，另 一个重要缺陷就是存在药物残留，目前药物残留已成为猪肉安全最大的隐患之一。人吃了 含药物和激素残留的猪肉食品，能诱发儿童提前发育、女性乳腺癌、卵巢癌等疾病，还会引 起过敏反应。药物残留也可能导致病原菌产生耐药性，经常食用低剂量药物残留的食品可 使细菌产生耐药性并破坏人体肠道的菌群平衡。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的之一是提供一种融合基因。
[0010] 本发明的目的之二是提供一种根据融合基因所编码的蛋白。
[0011]本发明的目的之三是提供一种能够诱导针对猪蓝耳病毒的免疫应答的亚单位疫 苗，所述亚单位疫苗包含所编码的蛋白，所述亚单位疫苗不仅能够激发B细胞免疫产生抗 体，更能够充分激发T细胞免疫，T细胞免疫对PRRSV这类对免疫系统有抑制作用的病毒的清 除是非常重要的，从而能够有效保护猪只，减少被蓝耳病病毒感染，用于防治猪蓝耳病。 [0012]本发明公开了一种如SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列的融合基因。
[0013] 一种如SEQ ID No. 1所示的多核苷酸序列的融合基因所编码的蛋白。
[0014] 一种能够诱导针对猪蓝耳病毒的免疫应答的亚单位疫苗，其特征在于，所述亚单 位疫苗包含所编码的蛋白。
[0015] 优选的是，其中，上述所编码的蛋白包括：
[0016] 猪蓝耳病病毒(PRRSV)GP5蛋白T-细胞抗原表位部分连续多核苷酸序列和猪蓝耳 病病毒(PRRSV)GP4蛋白T-细胞抗原表位部分连续多核苷酸序列相拼接的第一部分，白喉毒 素 DT的部分连续多核苷酸序列的第二部分和转运结构域-内质网定位信号肽的第三部分；
[0017] 其中，
[0018]所述第一部分的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0019] 所述第二部分的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；
[0020] 所述第三部分的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0021] 优选的是，其中，上述所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
[0022] 优选的是，其中，所述第一部分的多核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
[0023] 所述第二部分的多核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述第三部分的多 [0024] 核苷酸序列如SEQ ID No .8所示。
[0025]优选的是，其中，所述亚单位疫苗的有效浓度为200_300ug/剂。
[0026] 一种能够诱导针对猪蓝耳病毒的免疫应答的亚单位疫苗，其特征在于，所述亚单 位疫苗包含根据如SEQ ID No.9所示的多核苷酸序列所编码的蛋白，所编码的蛋白包括：
[0027]铜绿假单胞菌外毒素的细胞结合和转膜结构域的部分连续多核苷酸序列的第一 部分，猪蓝耳病病毒(PRRSV)GP5蛋白T-细胞抗原表位部分连续多核苷酸序列和猪蓝耳病病 毒(PRRSV)GP4蛋白Τ-细胞抗原表位部分连续多核苷酸序列相拼接的的第二部分和转运结 构域-内质网定位信号肽的第三部分；
[0028]其中，
[0029]所述第一部分的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0030] 所述第二部分的氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示；
[0031] 所述第三部分的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0032] 应用上述能够诱导针对猪蓝耳病毒的免疫应答的亚单位疫苗防治猪蓝耳病。
[0033] -种上述的能够诱导针对猪蓝耳病毒的免疫应答的亚单位疫苗防治猪蓝耳病的 方法，其特征在于，辅以佐剂。
[0034]优选的是，其中，所述佐剂为无机佐剂、白油佐剂以及福氏佐剂。其中，所述无机佐 剂包括氢氧化铝佐剂、明矾佐剂等；所述白油佐剂可为油包水型白油佐剂（例如：法国 SEPPIC MONTANIDE ISA11R VG)，或者水包油型白油佐剂（例如：法国SEPPIC M0NTANIDE ISA61 VG)，优选油包水型白油佐剂（例如：法国SEPPIC MONTANIDE ISA 11R VG)。
[0035]本发明的有益效果是：
[0036]本申请发明人通过对在全国四个有代表性的不同地域的PRRSV生物样本进行亚型 分析和全基因组序列分析，进行T-细胞抗原表位筛选，来针对性地筛选特异性的、高效的病 毒抗原。根据序列分析和T-细胞、B-细胞抗原表位筛选的结果，有针对性地设计特异性抗原 序列。并加入白喉杆菌外毒素或者铜绿假单胞菌外毒素的细胞结合和转运结构域序列，使 得PRRSV的T-细胞抗原能够进入被免疫猪只的细胞内部，激发细胞免疫。在疫苗表达基因的 3 ' -末端加入RDEL-KKDLKDEL内质网定位信号肽，构建PM-PRRSV-KDEL新型蓝耳病基因工程 亚单位疫苗。所述亚单位疫苗能够进入动物细胞内部，并且通过信号肽的引导，长期停留在 动物细胞的内质网中，使得疫苗蛋白可以进入被免疫猪只细胞的内质网中，经过处理后能 够被MHC-I呈递，在激发体液免疫的同时，还能有效激发细胞毒性T-细胞的免疫应答，从而 使得B细胞和T细胞协同作战，能对免疫系统进行全面性的保护，安全且无抗体依赖性增强 (ADE)作用，可对中国多发的蓝耳病病毒亚型能有效免疫和杀灭。市场前景广阔。
[0037]本发明所涉及到的术语定义
[0038]除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者 类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
[0039] 术语"亚单位疫苗"意指通过化学分解或有控制性的蛋白质水解方法，提取细菌、 病毒的特殊蛋白质结构，筛选出的具有免疫活性的片段制成的疫苗。
[0040] 术语"表达载体"意指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、 RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。如本申请中提及的表达载体pET-15b是一个 具有典型表达结构的大肠杆菌高效表达载体。其中，目的基因为本申请中的指导编码 PRRSV-DT-ER融合蛋白或者PRRSV-PE-ER融合蛋白的融合基因。
[0041] 术语"多核苷酸"意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷(DNA)、核 糖核苷或核糖核苷酸(RNA)及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸 的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的 核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括 PNA(肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指 定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取 代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或 所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代 (Batzer等人，Nucleic Acid Res · 19:5081 (1991) ;Ohtsuka等人，J.Biol ·Chem. 260:2605-2608(1985);和 Cassol 等人，（1992) ;Rossolini 等人，Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。
[0042] 术语"氨基酸"意指构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使 他的分子具有生化活性。蛋白质是生物体内重要的活性分子，包括催化新陈代谢的酵素和 酶。不同的氨基酸脱水缩合形成肽(蛋白质的原始片段），是蛋白质生成的前体。
[0043] 术语"外源蛋白"和"蛋白"意指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于天然产生氨 基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。
[0044] 术语"PCR"意指聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR。聚合酶链 反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温 延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度 高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可 用于疾病的诊断或任何有DNA、RNA的地方.聚合酶链反应(Polymerase Chain React ion，简 称PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
[0045]术语"引物"意指一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，除非特定限制，否 则所述术语涵盖自然中生物的DNA复制和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物(通常为 DNA引物）。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有 的DNA链上。除非特定限制，否则上游引物为在DNA复制时，作为DNA模板3'端的复制起始点 的引物，下游引物为在DNA复制时，作为DNA|旲板5端的复制起始点的引物。
[0046] 术语"缓冲液"意指一类当往某些溶液中加入一定量的酸和碱时，有阻碍溶液pH变 化作用的溶液。
【附图说明】
[0047] 图1为本发明所述的亚单位疫苗中包含的所编码的蛋白的结构简图，其中，A为第 一部分，B为第二部分，C为第三部分；
[0048] 图2为本发明实施例1中的基因克隆的过程简图，用于构建融合基因；
[0049] 图3为本发明实施例1的疫苗融合蛋白的纯化过程中进行的跑SDS-PAGE蛋白胶后 的考马斯亮蓝染色照片，其中，1.蛋白分子量标准，2.全细胞裂解液，3. Ni-IDA亲和层析未 结合流穿液，4.低浓度咪唑漂洗流穿液，5.Ni-IDA纯化的疫苗蛋白，经过DEAE-sephaorse离 子交换层析和羟基磷灰石层析纯化的疫苗蛋白；
[0050] 图4为本发明实施例3中应用本发明所述的能够诱导针对猪蓝耳病毒的免疫应答 的亚单位疫苗进行猪只攻毒保护实验的结果对比图。
【具体实施方式】
[0051] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文 字能够据以实施。
[0052] 实施例1:
[0053] 1)编码疫苗融合蛋白的基因克隆和原核表达
[0054]将编码PRRSV T-细胞抗原-白喉毒素 DT-细胞结合和转运结构域-内质网定位信号 肽(简称PRRSV-DT-ER)融合蛋白（如图1所示）的基因序列分段扩增，用多片段同源重组的方 法克隆到大肠杆菌高效表达载体pET-15b中（如图2所示）。
[0055]引物设计：用引物1:5' -GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCGCTGGCGGCGCTGATTTG-3 '（5 '-端为与pET15b Ndel酶切位点以及上游同源的序列，3 '端为GP5同源序列）和引物2:5'_ ATGAGCTACC TACTGA AATTGCCAAC AGAATGGCAA-3'（5'_端为与白喉毒素 DT-细胞结合和转运 结构域同源的序列，3'端为PRRSV GP4同源序列）来扩增合成的PRRSV GP5和GP4的优选T-细 胞抗原表位编码序列（通过人工合成原始序列）；用引物3:5'_ CTGTTGGCAATTTCAGTAGGTAGCTCATTGTC-3'（5'_端为PRRSV GP4同源序列，3'端为与DT细胞结 合和转运结构域同源的序列）和引物4 : 5 ' - GCTTTGTTAGCAGCCGGATCCCAGTTCATCTTTCAGATCTTTTTTCAG TTCATCGCGGCTTTTGATTTCAAAAAATA-3'（5'_端为与pET 15b Bamm酶切位点以及下游同源的 序列，中间的36个碱基编码ER定位信号肽，3 '端为与白喉毒素 DT-细胞结合和转运结构域同 源的序列）来PCR扩增DT细胞结合和转运结构域以及ER定位信号肽。PCR产物经过胶回收纯 化以后，再使用闪电克隆试剂盒(金福赛(北京)生物科技），通过同源重组的方法，与Ndel/ BamM酶切过的pET-15b载体连接，得到表达编码PRRSV-DT-ER疫苗融合蛋白的克隆。
[0056]上述引物1的序列表示在序列表中为，如SEQ ID No. 11所示的多核苷酸序列；上述 引物2的序列表示在序列表中为，如SEQ ID No.12所示的多核苷酸序列；上述引物3的序列 表示在序列表中为，如SEQ ID No.13所示的多核苷酸序列；上述引物4的序列表示在序列表 中为，如SEQ ID No. 14所示的多核苷酸序列。
[0057] 2)疫苗融合蛋白的原核表达和纯化：
[0058] 将表达疫苗融合蛋白的pET-15b-DT-Epit〇pe-KDEL质粒转化到大肠杆菌表达菌株 BL21/DE3感受态细胞，37°C温箱培养过夜。接种一个单菌落到50毫升LB液体培养基或其他 适于大肠杆菌生长的培养基+50ug/ml羧节青霉素，37°C，250rpm震荡培养过夜。接种25ml过 夜培养菌液到1.5L预热到37°C的、100ug/ml氨苄青霉素的2xYT培养基中（六瓶，每瓶1.5L， 共9L)，37°C，150-250rpm震荡培养至0D600到达0 · 6。在每1 · 5升菌液中加入7 · 5毫升100mM IPTG，继续震荡培养8-16小时诱导蛋白表达。结束培养，4700rpm离心10分钟收集细胞。将所 有细胞用约2000ml预冷的双蒸水重悬，再次离心洗涤细胞。去掉上清，将细胞冻存于-80°C。
[0059] 3)疫苗融合蛋白的纯化：大肠杆菌中表达的疫苗蛋白是存在于胞内的，通过跑 SDS-PAGE蛋白胶并进行考马斯亮蓝染色发现（如图3所示），疫苗蛋白主要以包涵体的形式 存在。收集表达疫苗蛋白的菌体，用lxHis Binding缓冲液（20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl，5mM咪唑，ImM PMSF)吸打重悬细胞，重悬后加入Complete蛋白酶抑制剂以防止疫苗蛋 白降解，然后将含有主要含有目的疫苗蛋白的组分加入Complete蛋白酶抑制剂，利用疫苗 基因序列前端的His标签进行亲和层析柱纯化。用超声破碎仪或者高压均质机等方法破碎 大肠杆菌细胞，13000rpm离心20分钟。小心地将上清液转移至新离心管中，不要碰到沉淀。 用包涵体重悬缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.5,2mM EDTA，10mM DTT，6M Gu-HCl)将沉淀重新 吸打溶解。用3倍体积的超纯水冲洗100ml的Ni-IDA介质柱，再用三倍体积的lxHis Binding 缓冲液平衡Ni-IDA介质柱，然后把重悬的包涵体缓慢上样到Ni-IDA介质柱进行亲和层析纯 化，漂洗后加上1 OmM到500mM的咪唑梯度来洗脱蛋白，分别收集每一个洗脱峰。然后使用弱 阴离子交换树脂DEAE_sepharose(30升发酵产物菌体需要约300ml的DEAE-Sepharose柱料） 去除绝大部分的内毒素和其他杂质，最后使用羟基磷灰石介质浓缩和去除DNA污染，最后得 到纯度达到99%以上的，药品级别的疫苗蛋白。
[0060] 实施例2
[0061] 1)表达PRRSV疫苗融合蛋白毕赤氏酵母菌株的构建及疫苗在毕赤氏酵母中的分泌 表达和纯化
[0062] 毕赤氏酵母是真核生物，能够对表达的外源蛋白进行翻译后修饰，有助于提高疫 苗蛋白的免疫原性和帮助形成正确的空间结构。
[0063] 设计引物，用PCR的方法，将实施例1中的PRRSV-DT-ER序列从pET-15b中扩增出来， 再用闪电克隆试剂盒克隆到酵母质粒PPIC9K的Notl/EcoRI位点中，经测序确认后，用SacI 限制性内切酶线性化PPIC9K-PRRSV-DT-ER质粒，用电击法转换毕赤氏酵母GS115感受态细 胞，在YM基础培养基平板上筛选PRRSV-DT-ER序列整合到GS115酵母基因组中的阳性克隆。 然后将各个阳性克隆涂到YPD+100到400ug/ml G-418抗生素平板上，筛选多拷贝插入，表达 量尚的克隆。
[0064] 2)疫苗融合蛋白的真核表达和纯化：
[0065]通过甲醇诱导A0X1启动子驱动的疫苗蛋白在毕赤氏酵母中的表达。毕赤氏酵母表 达的疫苗蛋白是分泌到胞外的，所以可以直接离心或过滤去除菌体，取上清，超滤浓缩后直 接上柱纯化。用Ni-NTA(镍柱）（30升发酵产物菌体需要约200ml的镍柱填料进行纯化)进行 第一步亲和层析纯化，可以用温和条件来进行镍柱纯化。第二步用弱阴离子交换树脂DEAE-sepharose去除绝大部分的内毒素和其他杂质，最后使用羟基磷灰石介质浓缩和去除DNA污 染，最后得到纯度达到99%以上的，药品级别的疫苗蛋白。
[0066] 实施例3:
[0067] 使用本发明所提供的猪蓝耳病基因工程重组蛋白疫苗进行猪只攻毒保护实验。10 只无特定病原（SPF)的月龄仔猪被分为两组，第一组五只为疫苗组，第二组为对照组，分别 饲养在环境相同的两个通风良好，带有空气过滤设施的恒温恒湿培养室内。配合佐剂，第一 组的每只猪分别注射250微克PRRSV基因工程重组蛋白疫苗，而对照组的仔猪分别注射lml 的无菌生理盐水。2周后，进行第二次增强免疫，所用方法和注射剂量与第一次免疫相同。第 二次免疫两周后，两组仔猪都用鼻内滴注的方式接种3 X105TCID5Q的高蓝蓝耳病病毒 JXwn06培养物(在Marc-145中细胞培养）。
[0068] 病毒接种后一周内，每天定时测量体温作为感染程度的一个指标，结果如表1所 示；
[0069] 表1:仔猪接种病毒后一周内体温的变化
[0070]
[0071] 从表1的结果可以看到，未接种疫苗的对照组，猪只都出现了不同程度的发热。以 体温达到40.5°C为界，对照组猪只在第三天后已经开始全面有发热现象，而且其中两只在 第6、7天相继死亡。而疫苗接种组的五只仔猪，在接种病毒三天后均未出现明显发热，只是 体温较接种前略有升高。到第四天，才有一只出现发热现象，到第7天也只有两只有发热现 象，说明接种本发明所述疫苗能有效缓解PRRSV感染所带来的发热症状。
[0072]为了检测病毒接种后PRRSV在仔猪血液中的感染情况，分别在病毒接种前和接种 后5日抽血，用血液RNA提取试剂盒去除血液中的红细胞，离心收集白细胞，再用柱离心法提 取血液白细胞总RNA，然后用反转录-荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法检测仔猪血液中蓝耳病 病毒的核酸含量。检测方法为用相对突变较少的PRRSV核壳蛋白N(0RF7编码)为目的基因， 以猪alpha肌动蛋白ACTA1作为内参基因，计算攻毒实验组猪只与对照组猪只的相对病毒核 酸含量。血液中？1?^￥病毒核酸相对含量计算公式为 ：2~[(01^7^4(^1^)棚齟-(01^7^-ACTAkt)^鎺]。结果如图4所示。通过qRT-PCR检测攻毒组与对照组的PRRSV核酸含量，结果发 现，病毒接种前，实验组和对照组均未检测出蓝耳病病毒;而当病毒接种后第五天，未注射 疫苗的仔猪都不同程度感染了 PRRSV，而注射了 PRRSV基因工程重组蛋白疫苗的实验仔猪则 只有一头出现感染，一头有疑似低浓度感染，另外三头均无病毒感染。该实验说明，通过接 种本发明所述的PRRSV基因工程重组蛋白疫苗能够有效地保护仔猪抵抗蓝耳病病毒的侵 染。
[0073]猪蓝耳病最显著的病理特征是肺部的病变，主要的病变特征为:病猪的肺部与横 膈肌或胸膜粘连，肺脏红色胰样肉变，与正常组织界限明显，间质增宽，肺组织表面结节状 增生，组织坏死水肿，病灶切开后切面多汁，气管、支气管内充满出血性泡沫状黏液及黏膜 渗出物。为检验疫苗的保护效果，在攻毒试验进行两周后，将所有仔猪进行肺部解剖，在两 周之前已经死亡的仔猪也进行肺部解剖，进行病理观察，病变程度从轻到重，分别用数字1-5来表不，结果如表2所;^。
[0074]表 2
[0075]
[0076]
[0077] 肺部病理解剖结果显示，未接种疫苗的对照组的仔猪都发生了严重的典型蓝耳病 肺部病变，而接种疫苗的仔猪一只轻度病变，一只中度病变，而3只未见明显病变。
[0078] 通过分子生物学、免疫学和病理解剖学的实验说明，与对照组相比，通过接种本发 明所述的PRRSV基因工程重组蛋白疫苗，能够有效地保护仔猪抵抗蓝耳病病毒的侵染，大大 提高猪只的健康状况。
[0079]尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地 实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的图例。
【主权项】
1. 一种如SEQ ID No. 1所示的多核苷酸序列的融合基因。2. -种如SEQ ID No. 1所示的多核苷酸序列的融合基因所编码的蛋白。3. -种能够诱导针对猪蓝耳病毒的免疫应答的亚单位疫苗，其特征在于，所述亚单位 疫苗包含如权利要求2所编码的蛋白。4. 如权利要求3所述的能够诱导针对猪蓝耳病毒的免疫应答的亚单位疫苗，如权利要 求2所编码的蛋白包括： 猪蓝耳病病毒GP5蛋白T-细胞抗原表位部分连续多核苷酸序列和猪蓝耳病病毒GP4蛋 白T-细胞抗原表位部分连续多核苷酸序列相拼接的第一部分，白喉毒素 DT的部分连续多核 苷酸序列的第二部分和转运结构域-内质网定位信号肽的第三部分； 其中， 所述第一部分的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示； 所述第二部分的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示； 所述第三部分的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。5. 如权利要求4所述的能够诱导针对猪蓝耳病毒的免疫应答的亚单位疫苗，其特征在 于，所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。6. 如权利要求4所述的能够诱导针对猪蓝耳病毒的免疫应答的亚单位疫苗，其特征在 于，所述第一部分的多核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述第二部分的多核苷酸序列如 SEQ ID No.7所示，所述第三部分的多核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。7. 如权利要求3所述的能够诱导针对猪蓝耳病毒的免疫应答的亚单位疫苗，其特征在 于，所述亚单位疫苗的有效浓度为200-300ug/剂。8. 应用如权利要求2所编码的蛋白制备能够防治猪蓝耳病的亚单位疫苗。9. 一种如权利要求3所述的能够诱导针对猪蓝耳病毒的免疫应答的亚单位疫苗的使用 方法，其特征在于，辅以佐剂。10. 如权利要求9所述的能够诱导针对猪蓝耳病毒的免疫应答的亚单位疫苗的使用方 法，其特征在于，所述佐剂为无机佐剂、白油佐剂以及福氏佐剂。
【文档编号】A61P31/14GK105907776SQ201610333073
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】杨波, 杨建
【申请人】金福赛（北京）生物科技有限公司