杀虫毒素蛋白hs487及其基因在生物防治中的应用
【专利摘要】本发明公开一种杀虫毒素蛋白HS487。本发明还公开编码杀虫毒素蛋白的基因hs487。发明还公开了含有杀虫毒素蛋白基因hs487的重组载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。本发明还公开杀虫毒素蛋白基因hs487、上述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在制备杀虫毒素蛋白HS487中的应用。本发明还公开杀虫毒素蛋白HS487的制备方法。本发明还公开制备方法制备得到的杀虫毒素蛋白HS487制剂。由嗜线虫沙雷氏菌R187?2杀虫毒素蛋白HS487编码基因hs487推导其氨基酸序列，合成的杀虫毒素蛋白HS487对很多农业害虫有着很高的致病率。该杀虫毒素蛋白具有杀虫活性高、杀虫谱广、杀虫效率高的有益特点。CCTCC NO：M 201624020160503
【专利说明】
杀虫毒素蛋白HS487及其基因在生物防治中的应用
技术领域
[0001 ] 本发明涉及嗜线虫沙雷氏菌（Serratia nematodiphila)菌株R187-2的杀虫毒素 蛋白HS487及其基因和在生物防治中的应用，属于生物农药领域。
【背景技术】
[0002] 在农业种植的漫长过程中，化学农药起到了推动其发展的不可磨灭的作用。但是， 由于长期大量的使用甚至滥用农药，使抗性问题越来越严重，引起了人们高度的重视。不仅 是抗性问题，化学农药对农副产品所产生的污染也引起了人们的担忧，我国每年都会发生 大量的农药事故，由此带来了巨额的经济损失达到了 1亿元。同时，化学农药也对环境产生 了越来越大的负面影响。因此，农业领域开始减少对化学农药的依赖，更加倡导使用绿色生 物农药。生物农药，是利用生物活体或者相关的代谢产物对农业有害生物进行防治的相关 制剂(Appl Microbiol Biotechnol，1995,43(2) :p. 310)。生物农药是实现绿色农业的关键 环节之一，低毒、低残留、易降解、对环境无不良影响的生物农药成为当今农药界研究的热 点。目前市面上的生物农药种类繁多，以微生物类、基因工程类和植物源类农药为主，其中 微生物农药应用最为广泛。
[0003] 微生物农药指具有杀虫，杀菌，除草和调节植物生长功能的微生物和其代谢物，包 括昆虫病原线虫(Entomopathogenic nematodes，EPNs)及其共生菌、昆虫病原真菌、昆虫病 原细菌、昆虫病原原生动物、农用抗生素和人工合成的代谢产物和合成产品。其中，具有代 表性的为苏云金芽孢杆菌(简称Bt)相关产品，Bt制剂应用广泛，技术成熟，在全球范围内得 到了认可。病毒类生物制剂分为有质型多角体病毒(CPV)和核型多角体病毒(NPV)。而真菌 类型的生物农药主要是绿僵菌、赤僵菌、白僵菌等。其中昆虫病原线虫（由于其侵染期幼虫 消化道内携有引起昆虫致病的共生菌，导致昆虫病害而被称为昆虫病原线虫)是一种高效 安全的绿色农药，对人畜、植物及有益生物安全，在欧美一些国家可以豁免注册生产和释放 (Commun Agric Appl Biol Sci，2003,68(4Pt A):3_16)。在上世纪80年代，许多新种、新品 系被开发利用，昆虫病原线虫作为生物杀虫剂已经广泛用于害虫的综合治理之中，并已经 实现商品化。目前，世界上昆虫病原线虫杀虫剂的年销售额约为140亿美元，并每年以2-3% 增长。在昆虫病原线虫中发挥杀虫作用的关键致病因子是与其共生的共生菌。 Heterorhabditidoides类昆虫病原线虫及其共生菌Serratia nematodiphila为本课题组 发现的昆虫病原线虫新属及昆虫病原线虫共生菌新种（J Invertebr Pathol. ,2008,98: 153-168; Int J Syst Evol .Microbiol .2009,59:1603-1608·)。该类新型生物防治因子是 我国泛长三角地区昆虫病原线虫的优势类群。对该类昆虫病原线虫杀虫机理的初步分析表 明，其中起主要杀虫作用的是共生菌Serratia nematodiphila(J Invertebr Pathol·, 2008,98:153-168)。菌株R187-2是S.nematodiphila的高毒力菌株;该菌株对銷翅目、鱗翅 目和半翅目的部分害虫具有较强的毒杀作用。该微生物的分类命名为嗜线虫沙雷氏菌 (Serratia nematodiphila)的高毒力菌株R187-2，2016年5月3日保藏于中国典型培养物保 藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:Μ 2016240;地址：中国.武汉.武汉大学，邮编:430072。该 菌株的主要生物学特性:革兰氏染色反应阴性菌菌株G -，菌体短杆状，大小约1.05X0.65μ m，具有1根鞭毛;好氧;有酪蛋白水解酶活性;不能水解淀粉、纤维素、糖原、明胶和密二糖； 无脲酶，精氨酸二水解酶活性;有半乳糖苷酶，鸟氨酸脱羧酶，和DNA酶活性;有α-甲基-D-糖甙酶苯丙氨酸脱羧酶，赖氨酸脱羧酶活性;可以还原硝酸盐;可从D-麦芽糖、D-果糖、D-葡 萄糖、鹿糖、水杨苷、L-岩藻糖、D-核糖、D-山梨醇、木糖醇、D-甘露糖、肌醇、D-甘露醇和D-半 乳糖产生酸；但不能从D-乳糖、淀粉、二阿拉伯糖、D-鼠李糖、L-山梨糖、L-棉子糖、L-阿糖 醇、纤维二糖、D-松三糖、D-蜜二糖产生酸;不能利用苯丙氨酸和苏氨酸。
[0004] 发明人将R187-2菌株的杀虫毒素蛋白HS487全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进 行搜索比较，未发现有任何相同的多肽。发明人将本发明的R187-2菌株杀虫毒素蛋白HS487 编码基因经基因数据库进行搜索比较，未发现有任何相同的基因。
【发明内容】
[0005] 发明目的：针对现有技术问题，本发明的目的在于提供一种新的具有广谱杀虫活 性(主要对鳞翅目、鞘翅目和双翅目的部分害虫）的嗜线虫沙雷氏菌毒素蛋白HS487。
[0006] 本发明的第二个目的是提供了编码上述杀虫毒素蛋白的基因 hs487。
[0007] 本发明的第三个目的是提供了含有上述的杀虫毒素蛋白基因 hs487的重组载体、 转基因细胞系统或转基因重组菌。
[0008] 本发明的第四个目的是提供了杀虫毒素蛋白基因 hs487、上述的重组表达载体、转 基因细胞系统或转基因重组菌在制备杀虫毒素蛋白HS487中的应用。
[0009] 本发明的第五个目的是提供杀虫毒素蛋白HS487的制备方法。
[0010] 本发明的第六个目的是提供了上述制备方法制备得到的杀虫毒素蛋白HS487制 剂。
[0011]本发明的第七个目的是提供了上述的杀虫蛋白HS487、上述的杀虫毒素蛋白HS487 制剂在生物防治中的应用。
[0012]技术方案:为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为:一种杀虫毒素蛋 白基因 hs487,其核苷酸序列如SEQ N0:1所示。
[0013] -种编码上述的杀虫毒素蛋白基因 hs487的杀虫毒素蛋白HS487,其氣基酸序列如 SEQN0:2**。
[0014] 含有上述的杀虫毒素蛋白基因 hs487的重组载体、转基因细胞系统或转基因重组 菌。
[0015] 将上述的杀虫毒素蛋白基因 hs487序列插入到大肠杆菌中，筛选得到转基因重组 菌。
[0016] 上述的杀虫毒素蛋白基因 hs487、上述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因 重组菌在制备杀虫毒素蛋白HS487中的应用。
[0017]上述的杀虫毒素蛋白HS487的制备方法，包括以下步骤：
[0018] 1)杀虫毒素蛋白基因 hs487的PCR克隆：嗜线虫沙雷氏菌R187-2总DNA提取;重组载 体PET-HS487的构建;重组质粒PET-HS487的转化和阳性菌落的筛选得到成功转化的重组载 体;杀虫毒素蛋白基因 hs487序列的结果测定；
[0019] 2)将步骤1)筛选得到的重组载体转入大肠杆菌BL21进行表达获得杀虫毒素蛋白 HS487〇
[0020] 其中，上述步骤2)中是通过IPTG诱导表达转化重组质粒PET-HS487成功的大肠杆 菌BL21菌落，然后将诱导好的样品用超声波破碎仪进行破碎，收集沉淀，使用NI -NTAHi s亲 和柱层析脱盐、纯化复性即得。
[0021] 本发明的内容还包括上述制备方法制备得到的杀虫毒素蛋白HS487制剂。
[0022] 其中，上述制剂为液体制剂或固体制剂。
[0023]上述的杀虫蛋白HS487、所述的杀虫毒素蛋白HS487制剂在生物防治中的应用。
[0024] 有益效果:本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：由嗜线虫沙雷氏菌 R187-2杀虫毒素蛋白HS487编码基因 hs487推导其氨基酸序列，合成的杀虫毒素蛋白HS487 对很多农业害虫（如大錯峡)有着很尚的致病率。该杀虫毒素蛋白具有杀虫活性尚、杀虫谱 广、杀虫效率高的有益特点。
【附图说明】
[0025] 图1目的基因 hs487的PCR产物；
[0026]图2A双酶切前后的pET-32a( + )电泳图；图2B双酶切前后的hs487电泳图；
[0027]图3转化菌落的PCR鉴定电泳图；
[0028]图4A重组蛋白的可溶性分析电泳图；图4B重组蛋白的亲和柱纯化电泳图；箭头表 示重组蛋白；
[0029] 图5透析复性后的融合蛋白。
【具体实施方式】
[0030] 下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于 本发明的保护范围。
[0031 ]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说 明书选择。本发明的昆虫病原线虫共生菌菌株R187-2以甘油菌的形式保藏在-80°C冰箱中。 [0032]实施例1:杀虫毒素蛋白hs487基因的克隆
[0033] I.嗜线虫沙雷氏菌R187-2(菌种保藏号为CCTCC Μ 2016240)总DNA提取：
[0034] Α、分别取扩大培养的R187-2菌液各1.5mL于灭菌离心管中，标记后，6000rpm/min 离心10min，弃上清后，保留菌体沉淀。
[0035] B、在离心管中加入lmL ddH2〇中，祸旋均勾后，6000rpm/min离心10min，弃上清后， 保留菌体沉淀。
[0036] C、在离心管中再次加入lmL ddH20中，涡旋均匀后，得到浓菌液。
[0037] D、取100以1^浓菌液于1.5mL灭菌离心管中，加入668yL TE和32yL 50mg/ml溶菌酶 液，充分混匀后，37度恒温水浴2h。
[0038] E、此后加入10%SDS 200yL，轻摇均匀，再加入5yL 20mg/ml的蛋白酶K溶液，充分 混匀后，55度恒温水浴3h。
[0039] F、然后将总液平分两管中，分别加入Tris-饱和酚500yL，混匀后再加入氯仿-异戊 醇500yL，再次混勾后15000rpm/min离心10min。将上清液转移至1.5ml灭菌离心管中，弃中 层蛋白沉淀和下油层。
[0040] G、加入2倍体积冰冻无水乙醇，充分混匀后室温静置2min，至有絮状DNA沉淀产生， 4度12000rpm/min离心5分钟。
[0041] H、将所得沉淀室温晾干后，溶于20yL TE中，跑1%琼脂糖凝胶进行检测。
[0042] Π .PET32a( + )重组载体的构建：
[0043] A、hs487基因片段的扩增：
[0044]采用聚合酶链式反应(PCR)方法以嗜线虫沙雷氏菌R187-2的总DNA为模板，用引物 hs487Al和hs487A2组成的引物对进行扩增。
[0045] l、hs487基因片段PCR反应体系：
[0046]
[0047] 2、hs487基因片段扩增条件：
[0048]
[0049] 循环次数为32。
[0050] 3、循环结束后，将PCR产物跑1%的琼脂糖凝胶检测试验结果并进行切胶回收，如 图1所示。
[0051] B、PCR产物用鼎国生物公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，步骤如下：
[0052] 1、在紫外灯下切取含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。 计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(如1 〇〇mg = 1 OOyL体积）。
[0053] 2、加入3个凝胶体积的凝胶熔化剂，混合均匀后于75度加热，间断混合（每2-3min)，直至凝胶块完全恪化(约6-8min)。
[0054] 3、加0.5个凝胶熔化剂体积的结合液，混合均匀。
[0055] 4、吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2m 1离心管）中，12000g离心 lmin。弃滤液。
[0056] 5、将制备管置回2ml离心管，加 500yL洗涤液，12000g离心30s，弃滤液。
[0057] 6、将制备管置回2ml离心管，加700yL去盐液，12000g离心30s，弃滤液。以同样的方 法再用700yL去盐液洗涤一次，弃滤液。
[0058] 7、将制备管置回2ml离心管中，12000g离心lmin。
[0059] 8、将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加25-30yL洗脱液或去离 子水，室温静置lmin，12000g离心lmin洗脱DNA。将洗脱液置于-20度保存备用。
[0060] C、pET_32a( + )质粒载体用鼎国生物公司的质粒小量提取试剂盒提取，步骤如下：
[0061 ] 1、取l_4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000g离心lmin，弃尽上清。
[0062] 2、加250yL细菌悬浮液悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。
[0063] 3、加250yL细菌裂解液，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解， 直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min。
[0064] 4、加 350yL中和液，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12000g离心10min。
[0065] 5、吸取步骤4中的离心上清并转移到制备管（置于2ml离心管中），12000g离心 lmin，弃滤液。
[0066] 6、将制备管置回离心管，加500yL洗涤液，12000g离心lmin，弃滤液。
[0067] 7、将制备管置回离心管，加700yL去盐液，12000g离心lmin，弃滤液；以同样的方法 再用700yL去盐液洗涤一次。弃滤液。
[0068] 8、将制备管置回2ml离心管中，12000g离心lmin。
[0069] 9、将制备管移入新的1.5ml离心管中，在制备膜中央加60-80ul洗脱液或去离子 水，室温静置lmin。12000g离心lmin。将收集液置于-20度保存备用。
[0070] D、质粒载体和目的基因的双酶切、酶连：
[0071] 1、将提取的PET_32a( + )质粒载体和回收的PCR产物分别按酶切体系加入到PCR管 中于37度同时双酶切20min，酶切体系如下：
[0072]
[0073]分别将PET_32a( + )质粒载体和回收的含有目的片段的PCR产物的酶切产物跑琼脂 糖电泳并切胶回收，-20度保存备用，跑胶结果如图2所示。
[0074] 2、将回收的线性化PET-32a( + )质粒与插入片断用T4DNA连接酶于22度连接lOmin。 连接体系如下：
[0075]
[0076]
[0077] ΙΠ 、重组质粒PET-HS487的转化和阳性菌落的筛选：
[0078] A、大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备：
[0079] 1、将过夜培养的大肠杆菌BL21 (DE3)菌液按1:100接种至lml新鲜的普通LB液体培 养基中，在37°C下180rpm振荡培养2h-3h直到0D600略小于0.4时，取出培养基。
[0080] 2、将菌液置冰上冷却10分钟，4°C，5000rpm，离心10min，弃上清液。
[0081] 3、加入lml已经在冰上预冷的lOOmM CaCl2溶液，轻柔吹打，重悬菌体，置于冰上 30_40min。
[0082] 4、将步骤3的菌悬液于4°C，5000rpm，离心5min，弃上清液，倒置lmin。
[0083] 5、向步骤4的离心管中加100yL预冷的CaCl2溶液轻轻重悬细胞，4度放置备用。
[0084] B、重组质粒PET-HS487的转化：
[0085]使用热激法将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，具体步骤如下： [0086] 1、将待转化的DNA加入到100yL感受态细胞中，轻轻弹匀，冰上孵育30min。
[0087] 2、将离心管置于42度水浴(不要晃动），准确热激90s后，立刻置于并水浴中，静置 3min〇
[0088] 3、向离心管中加入900yL液体LB或S0C培养基，37度，150rpm振荡培养1小时，使菌 体复苏，抗性基因表达。
[0089] 4、2500rpm离心5分钟，去掉900yL上清液。用剩余培养基将菌体重悬混匀，用无菌 涂布棒在含有氨苄抗性的平板上轻轻混匀。室温正置l〇min，待菌液被平板吸收后，37度倒 置培养过夜。
[0090] C、阳性菌落的筛选：
[0091] 通过菌落PCR筛选出阳性单菌落。扩增的引物hs487Al的长度为31个核苷酸，其序 列为5 ' GAGGAATTCATGCAATCTACTAAAAAGGCAA 3 '，PCR另一扩增引物hs487A2的长度为27个核 苷酸，其序列为5'TATAAGCTTTTACACGATAAAGTCCGT 3'。菌落PCR反应体系如下：
[0092]
[0093] PCR反应在如下条件下进行:941€3〇8,65°(：1111丨11，721€21^11，32个循环。然后72°(：延 伸 10min，4°C 保存。
[0094]将PCR产物跑1%的琼脂糖凝胶如图3所示，筛选出含有目标基因的阳性菌落并接 种于含氨节的液体LB中，37度，180rpm/min，培养12h，取培养菌液lml送生物公司测序，检验 插入序列是否与原基因序列完全一致。
[0095] IV、杀虫毒素蛋白基因 hs487序列的测定和结果：
[0096] 测序上游引物hs487Al序列为5'GAGGAATTCATGCAATCTACTAAAAAGGCAA 3'，下游引 物hs487A2序列为5 ' TATAAGCTTTTACACGATAAAGTCCGT 3 '。基因测序结果自5 '端至3 '端序列 如SEQ ID N0:1 所示。
[0097] 杀虫毒素蛋白hs487基因核苷酸的序列表为：序列长度为1464个碱基，序列类型： 核酸，链数:双链，拓扑学:直链状，序列种类:DNA，来源:嗜线虫沙雷氏菌R187-2。
[0098] 杀虫毒素蛋白HS487氨基酸序列为:SEQIDN0:2所示。
[0099]嗜线虫沙雷氏菌R187-2杀虫毒素蛋白HS487对很多农业害虫(如大蜡螟)有着很高 的致病率，可以作为防治农业害虫的生物杀虫剂被应用。
[0100] 实施例2:
[0101] 制备杀虫毒素蛋白HS487的制备方法:在37°C200rpm条件下，于100yg/mL Amp的LB 液体培养基中过夜培养含pET-32a( + )-hs487重组质粒的BL21(DE3)菌株作为转接的种子菌 液。1:1000转入抗性为100yg/mL Amp的LB液体培养基中，37°C，200rpm培养5小时，使菌液的 0D600达到0.6左右，取lmL菌液于无菌的1.5ml EP管中，剩余菌液加入IPTG至终浓度0.2mM， 28°C低转速（150rpm)诱导3小时，取出菌液置于冰上10分钟，4°C，8000rpm，离心15分钟，用 5011^1^ 8-!1(：1缓冲液(？!17.8)洗涤菌体沉淀2次，每次洗涤后均需在4°(：，8000印111，离心 lOmin，收集菌体沉淀。
[0102] 将收集到的诱导菌体沉淀物重悬于50mM Tris-HCl缓冲液(PH7.8)中，用超声波细 胞破碎仪充分裂解诱导菌体。采用6号超声波探头，25%的功率超声2秒，间隔4秒，为1个循 环，循环15分钟，重复超声两次。4 <€，12000印111，离心25111；[11。分别取上清液和沉淀跑12% SDS-PAGE电泳，结果如图4A所示，诱导蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中。
[0103] 将细胞破碎液离心，取沉淀用包涵体洗液I和包涵体洗液II进行洗涤，洗涤后沉淀 用8M尿素溶解。
[0104] 其中包涵体洗液I为： Iris 3.0 g Naci 2.9 r
[0105] Na2EDTA 1.46 g Trilonx-100 5 ml (终浓度 1%)
[0106] 450mL去离子水充分溶解，用HC1调pH至8 · 0，定容为500ml。
[0107] 包涵体洗液II为： Tris 3 0g Naci 2? g
[0108] Na2EDTA 1.46 g Tritonx-100 2.5 ml (终浓度 0.5%)
[0109] 450mL去离子水充分溶解，用HC1调pH至8 · 0，定容为500ml。
[0110] 8M尿素为：
[0111] 尿素 240.24g
[0112] 400mL去离子水充分溶解，定容为500ml，0.45μπι滤膜过滤除杂。
[0113] 主要步骤如下：
[0114] ①诱导产物经超声波破碎后，8000rpm，4°C，离心10min;
[0115] ②弃去上清液，用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)重悬沉淀，8000印111，4°(：，离心 lOmin；
[0116] ③用10ml包涵体洗液I重悬，4°C放置卟，8000印111，4°(：，离心151^11，弃上清，重复此 步骤2-3次；
[0117] ④用10ml包涵体洗液II重悬，4°C放置2h(或过夜），期间每隔25min摇晃一次， 8000rpm，4°C，离心15min，重复此步骤1次；
[0118] ⑤7ml 8M尿素重悬，4°C溶解12-2处，8000印111，4°(：，离心151^11保留上清液；
[0119]取经尿素溶解的融合蛋白液，用0.45μπι滤膜过滤，上样于利用20%乙醇平衡好Ni-NTA His Bind Resins亲和柱，结果如图4B所示。将亲和柱纯化的融合蛋白液，4°C，8000g， 离心5min，上清液用截留分子量为25000Da的透析袋在;4°C，2M尿素，20mM Tris-Hcl，0.4M L-Arg，5%甘油，PH=8.0的条件下透析6小时，收集复性好的蛋白溶液，4°C，12000g，离心30 分钟，收集上清液，跑12 % SDS-PAGE电泳，结果如图5所示。
[0120] 实施例3
[0121] 杀虫毒素蛋白HS487对大蜡螟血腔毒性检测：
[0122] 为了检测经原核表达得到的杀虫毒素蛋白HS487的杀虫活性，采用大蜡螟血腔注 射的方法分别对经发酵液粗提纯化的毒素蛋白HS487和经原核表达的毒素蛋白HS487进行 活性检测。用灭菌的昆虫生理盐水分别溶解发酵液蛋白粗提物冻干粉和原核表达的毒素蛋 白HS487冻干粉，分为两组，每组均有实验组和对照组，使用微量注射器从5龄大蜡螟老熟幼 虫的第二对腹节之间分别注射〇. lyg、〇.2yg、0.4yg、0.8yg、l .6yg、2.0yg蛋白至血腔内，对 照组注射昆虫生理盐水，将注射后的幼虫放置于30°C恒温箱中，每组取体重相似的30头幼 虫，记录虫体重量，每次实验重复3遍。每隔4h观察幼虫状态，记录24h内死亡情况，统计结果 并用SPSS Statistics软件进行数据处理。结果如表1和表2。
[0123] 表1经发酵液粗提纯化的毒素蛋白HS487对大蜡螟幼虫血腔毒力测定：
[0124]
[0125] *以上数据均为3次重复的平均数
[0126] 由表1可见，大蜡螟幼虫的死亡率随着经发酵液粗提纯化的毒素蛋白HS487剂量的 增大而增大，当剂量达到2 . Oyg时，大蜡螟死亡率为96.6 %。每组的大蜡螟体重均值为 230mg，通过SPSS Statistics软件数据处理得到经发酵液粗提纯化的毒素蛋白HS487血腔 毒力半数致死量为3 · 51 (2 · 95-4 · 15)ng/mg。
[0127] 表2,原核表达的融合蛋白对大蜡螟幼虫血腔毒力的测定：
[0128]
[0129] *以上数据均为3次重复的平均数
[0130]由表2可见，大蜡螟幼虫的死亡率随着经原核表达的毒素蛋白HS487剂量的增大而 增大，当剂量达到2.Oyg时，大蜡螟死亡率为100%。每组的大蜡螟体重均值为230mg，通过 SPSS Statistics软件数据处理得到经原核表达的毒素蛋白HS487血腔毒力半数致死量为 2.71(2.29-3.16)ng/mg〇
[0131] 通过表1和表2可见，在0.1以8、0.2以8、0.4以8、0.8以8、1.6以8、2.(^8不同剂量蛋白注 射进大蜡螟血腔后，经原核表达得到的毒素蛋白HS487比经发酵液粗提纯化的毒素蛋白 HS487具有更强的杀虫活性，SPSS Statistics软件数据处理结果也表明经原核表达得到的 毒素蛋白HS487具有更显著的杀虫活性。
[0132] 以上对本发明【具体实施方式】的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本 发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范 围。
【主权项】
1. 一种杀虫毒素蛋白基因 hs487,其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. 一种编码权利要求1所述的杀虫毒素蛋白基因 hs487的杀虫毒素蛋白HS487，其特征 在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3. 含有权利要求1所述的杀虫毒素蛋白基因 hs487的重组载体、转基因细胞系统或转基 因重组菌。4. 根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，将权利要求1所述的杀虫毒素蛋 白基因 hs487序列插入到大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。5. 权利要求1所述的杀虫毒素蛋白基因 hs487、权利要求3所述的重组表达载体、转基因 细胞系统或转基因重组菌在制备杀虫毒素蛋白HS487中的应用。6. 权利要求2所述的杀虫毒素蛋白HS487的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 杀虫毒素蛋白基因 hs487的PCR克隆：嗜线虫沙雷氏菌R187-2总DNA提取；重组载体 PET-HS487的构建；重组质粒PET-HS487的转化和阳性菌落的筛选得到成功转化的重组载 体;杀虫毒素蛋白基因 hs487序列的结果测定； 2) 将步骤1)筛选得到的重组载体转入大肠杆菌BL21进行表达获得杀虫毒素蛋白 HS487。7. 根据权利要求6所述的杀虫毒素蛋白HS487的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中 是通过IPTG诱导表达转化重组质粒PET-HS487成功的大肠杆菌BL21菌落，然后将诱导好的 样品用超声波破碎仪进行破碎，收集沉淀，使用NI-NTA His亲和柱层析脱盐、纯化复性即 得。8. 权利要求6或7所述的制备方法制备得到的杀虫毒素蛋白HS487制剂。9. 根据权利要求8所述的制剂，其特征在于，所述制剂为液体制剂或固体制剂。10. 权利要求1所述的杀虫蛋白HS487、权利要求8所述的杀虫毒素蛋白HS487制剂在生 物防治中的应用。
【文档编号】C07K14/24GK105907769SQ201610302187
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月9日
【发明人】张克云, 杨欢, 柳李旺, 周桂信, 林 建, 严秀文, 莫国香, 侯祥龙, 阚飞, 徐良
【申请人】南京农业大学, 南京莱福佳农业科技有限公司