基于重叠延伸pcr法的基因突变、缺失、插入和重组片段的获取方法
【专利摘要】基于重叠延伸PCR法的基因突变、缺失、插入和重组片段的获取方法，设计2对或3对引物，相邻片段引物的末端含有15bp重叠序列，外引物末端含有酶切位点，利用所设计的引物，加入含有所需融合的基因片段或者质粒DNA为模板，进行平行的完整PCR反应，获得融合位点处含有15个碱基重叠的两组或三组PCR产物，取含有目的片段PCR产物为模板，加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，进行二次PCR反应，得到所需融合的目的基因。本发明解决了常规SOE?PCR重叠引物较长，会导致退火温度过高和引物合成时不必要的浪费，有时PCR产物电泳没有条带，也容易产生弥散带、非特异性条带的问题，具有操作简单、快捷、高效的特点。
【专利说明】
基于重叠延伸PCR法的基因突变、缺失、插入和重组片段的获 取方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种基因突变、缺失、插入和重组片段的获取方法，具体的说是利用重 叠延伸PCR法获取基因突变、缺失、插入和重组片段。
【背景技术】
[0002] 基因功能研究中经常需要对基因进行突变、缺失、插入和重组，虽然目前有好多可 供利用的试剂盒可以达到此目的，但大都价格昂贵，操作技术要求较高。而重叠延伸PCR技 术（splicing by overlap extension PCR，S0E_PCR)被Horton等 1989年报道以来，该技术 得到了完善和发展并被广泛应用。重叠延伸PCR采用融合位点处Y末端碱基互补的引物，使 PCR产物变性退火后可形成重叠部分互补链，在随后的扩增反应中通过重叠链3'的延伸，将 所要融合的扩增片段准确完整拼接起来，再在两个末端引物存在条件下进行PCR扩增获得 目的片段。S0E-PCR在基因的定点突变、基因片段删除、插入以及多个片段重组上具有独特 的优势。重叠 PCR按引物和模板进行扩增，中间不易发生移码，可避免表达蛋白的功能异常。 具有准确、简便、高效、易于操作等优点。
[0003] 但是我们在重叠延伸PCR构建融合基因的时候，发现重叠引物过长会导致退火温 度过高和不必要的合成浪费，有时PCR没有条带，难以获得预期结果。虽然孟祥平等发明了 高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法(CN 103820430A)改善了常 规重叠延伸PCR的耗时较长、循环数偏多及其过程中需要复杂的纯化步骤，操作比较繁琐等 问题，但该方法中间的过程产物无法检测，不能确定引物和退火温度及PCR条件是否合适， 有时S0E-PCR没有条带，原因难以判断。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是通过对重叠延伸PCR技术的改进，设计15bp的重叠引物，优化S0E-PCR过程，两步法PCR获得融合前的产物和融合后的产物，通过琼脂糖凝胶电泳直观分析结 果，方便切胶回收进行克隆和测序，建立一种简单、经济、高效的构建融合基因的方法。
[0005] 本发明利用重叠延伸PCR法获取基因突变、缺失、插入和重组片段，其具体步骤包 括：
[0006] 步骤一、引物设计:根据所需融合的DNA片段序列设计引物，融合位点两个相邻DNA 片段的一对引物的5'末端设计一个重叠区段，长度为15bp，引物与模板特异性结合部分序 列的Tm值多60°C，符合引物GC含量、不形成二聚体、无错配等设计原则；
[0007] 步骤二、PCR扩增反应:采用所设计的引物，以所需融合的基因片段为模板，加入高 保真pfu酶和buff er，分别进行平行的PCR反应，PCR设置为25-30个循环，得到所要融合的基 因单一片段PCR产物并进行电泳检测；
[0008] 步骤三、S0E-PCR反应：分别取步骤二中所得的未纯化的目的片段PCR产物1-2μ1 (约30-50ng)进行混合(如果步骤二中产物有非目的条带，则需纯化回收，并加入重叠引物 各ΙμL (Ο . ΙμΜ))，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物各ΙμL ( ΙΟμΜ)，在pfu高保真 聚合酶的作用下进行第二轮PCR反应，体系50μ1，通过DNA片段重叠末端的延伸反应使目的 片段连接成所需融合的全长基因；
[0009] 步骤四、融合目的片段纯化一一胶回收:按照胶回收试剂盒操作说明进行琼脂糖 电泳和胶回收纯化，获得融合的全长基因片段；
[0010] 步骤五、克隆测序:通过酶切与目的载体连接或者平端连接克隆载体，转化大肠杆 菌，筛选阳性克隆，提取质粒DNA，测序比对分析。
[0011] 本发明包含以下有益效果：
[0012] 本发明适用于获取基因突变、缺失、插入和重组片段，具有简单、快捷、高效的优 势。
[0013] 本发明在重叠延伸PCR方法的基础上，优化了重叠引物的长度，利用获得的所需融 合片段的PCR产物为模板，直接进行S0E-PCR扩增，提供了简单、高效的获取基因突变、缺失、 插入和重组片段的方法。常规S0E-PCR重叠引物较长，会导致退火温度过高和引物合成时不 必要的浪费，有时PCR产物电泳没有条带，也容易产生弥散带、非特异性条带。而本发明所提 供的方法在电泳确定各个DNA片段正确后，PCR产物不必纯化，直接将PCR产物与融合目的片 段外侧引物混合，进行PCR扩增，所获得的产物既有融合前的各个片段，又有融合后的目的 片段，通过凝胶电泳可直观地观察到各个片段，省略了小片段产物的纯化步骤和再次加入 融合位点引物的麻烦（出现非特异性条带的情况除外），因而具有操作简单、快捷、高效的特 点，节省了时间和试剂，引物合成也比较经济。另外，本发明对利用改进的重叠延伸PCR方法 获取基因突变、缺失、插入和重组片段均适用。
【附图说明】
[0014] 图1为重叠延伸PCR方法对基因进行碱基突变的示意图；
[0015]图2为重置延伸PCR方法对基因进彳丁喊基缺失的不意图；
[0016] 图3为重叠延伸PCR方法对基因进行碱基插入的示意图；
[0017] 图4为重叠延伸PCR方法对基因进行片段重组的示意图；
[0018] 图5为要构建的目的重组基因示意图，分别将Nrf2基因重组在eGFP荧光蛋白Ν端结 构域的两端；
[0019] 图 6为Nrf2-Linker、Linker_eGFPN基因片段和eGFPN-Linker、Linker-Nrf2片段的 PCR扩增电泳图，其中Μ是lkb分子量标准；泳道1为Nrf2-Linker片段的PCR扩增；泳道2为 Linker-eGFPN片段的PCR扩增；泳道3为eGFPN-Linker片段的PCR扩增；泳道4为Linker-Nrf2 片段的PCR扩增；
[0020] 图7为Nrf2-Linker-eGFPlPeGFPN-Linker-Nrf2基因重组的特异性扩增的PCR产物 电泳图，其中Μ是lkb分子量标准;CK是对照；泳道1是S0E-PCR产物Nrf2-Linker-eGFP N基因 的特异性扩增产物;泳道2是S0E-PCR产物eGFPN-Linker-Nrf 2基因的特异性扩增产物；
[0021] 图8为eGFPN-Linker和Linker-Nrf2不同量的PCR产物，加入或无内侧引物eGFP N+RL R ΙμΙ(Ο.ΙμΜ)和RL+Nrf2F ΙμΙ(Ο.ΙμΜ)，加入外侧引物eGFPN F ΙμΙ(ΙΟμΜ)和Nrf2R 1μ1(10 μΜ)的重组PCR产物电泳图，其中Μ是lkb分子量标准;泳道1、2、3分别是0.25μ1、0.5μ1、ΙμL的 Nrf2-Linker和物无内侧引物的重组PCR产物;4、5、6分别是0.25μ1、0.5μ1、 ΙμL的Nrf 2-Linker和物有内侧引物的重组PCR产物；
[0022]图 9 为Nrf2-Linker-eGFPN和 eGFPN-Linker-Nrf2 分别和 pET28a 载体重组后的酶切 电泳图，其中Μ是lkb分子量标准；泳道1是重组载体pET28a - Nrf2-Linker-eGFP%^酶切产 物;泳道 2 是 pET28a - eGFPN-Linker-Nrf2 酶切产物；
[0023]图 10 为 pET28a - eGFPN-Linker_Nrf2 测序验证 linker 正确连接结果。
【具体实施方式】
[0024]【具体实施方式】一:本实施方式的基于重叠延伸PCR法的基因突变、缺失、插入和重 组片段的获取方法，它是按照以下步骤进行的：
[0025] 一、根据所需融合的DNA片段序列设计两对或三对引物，在对应突变、缺失、插入和 重组位点设计的两个相邻引物Y末端设计一个长度为15bp的重叠区段，3'末端为引物与模 板特异性结合序列，然后利用设计的引物，以含有所需融合的基因片段或者质粒DNA为模 板，分别进行平行的PCR反应，获得融合位点处含有15个碱基重叠的两组或三组PCR产物； [0026] 二、若步骤一的PCR产物为单一目的条带，则取两组或三组未纯化的PCR产物1~2μ 1二、若步骤一的PCR产物为单一目的条带，则取两组或三组未纯化的PCR产物1~2μ1进行混 合，以混合的PCR产物为模板，然后加入所需融合的目的基因的一对外侧引物（ΙΟμΜ)各ΙμL， 采用pfu高保真DNA聚合酶进行PCR反应(50μ1反应体系），通过DNA片段重叠末端的延伸使两 个或三个DNA片段连接成所需融合的目的基因片段，即完成所述的获取方法。
[0027] 本实施方式所述的外侧引物是指融合片段1的5'末端引物和融合片段2的3'末端 引物。
【具体实施方式】 [0028] 二:本实施方式与一不同的是:获取基因突变过程中， 在引物设计时将所要突变的碱基位点包含在步骤一所述的15bp的重叠区段内（图1)。其它 与一相同。
【具体实施方式】 [0029] 三:本实施方式与一不同的是:获取基因缺失过程中， 在引物设计时将所要缺失的片段删掉，融合位点两侧引物的5'端要有步骤一所述的15bp片 段的重叠区（图2)。其它与一相同。
【具体实施方式】 [0030] 四：本实施方式与一不同的是:获取基因插入过程中， 若重组片段序列小于50bp，在引物设计时将插入序列直接合成在引物5'端并保证步骤一所 述的15bp片段的重叠区；若序列片段大于50bp，并在该片段第三对引物设计时保证与插入 点前后两个融合片段在引物5'端的15bp片段的重叠区上（如图3)。其它与一 相同。
[0031 ]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:获取基因片段重组过 程中，在引物设计时保证所要重组片段位点两侧引物的5'端各自含有步骤一所述的15bp的 重叠区段(图4)。其它与【具体实施方式】一相同。
[0032]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤一中所述的PCR反 应体系如下： 休系50μ1 用量 Μ板（30-5() ng) 1 - 2:μ1 融合片段1或2上游引物(1 ΟμΜ) 1 μ!
[0033] 融合片段i或2下游引物(ΙΟμΜ) 1 μL 2xPCR premix 25 μL 綱 2〇 21·22μ1
[0034] 插入片段大于50bp时，需要平行进行片段3(插入片段)PCR反应。
[0035] PCR反应条件：98°C lOsec; 56°C5sec，72°C20sec，30个循环。其它与【具体实施方式】 一相同。
[0036]
【具体实施方式】七:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤二中所述的PCR反 应体系如下： 体系 用量 模板（30-50 ng) 1-2 μL 融合片段1上游引物(1 ΟμΜ) I μL
[0037] 融合片段2下游引物(ΙΟμΜ) 1 μL 2xPCR Premix 25 μL ddH.O 21-22 μL
[0038] 插入片段大于50bp时，以融合片段1，2和插入片段3作为模板。
[0039] PCR反应条件：98 °C lOsec; 56°C5sec，72°C60sec，30个循环。其它与【具体实施方式】 一相同。
【具体实施方式】 [0040] 八:本实施方式的基于重叠延伸PCR法的基因突变、缺失、插入和重 组片段的获取方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
[0041] 一、根据所需融合的DNA片段序列设计两对或三对引物，在对应突变、缺失、插入和 重组位点设计的两个相邻引物Y末端设计一个长度为15bp的重叠区段，3'末端为引物与模 板特异性结合序列，然后利用设计的引物，以所需融合的基因片段或者质粒DNA为模板，分 别进行平行的PCR反应，获得融合位点处含有15个碱基重叠的两组或三组PCR产物；
[0042]二、若步骤一中所得的PCR产物除了目的条带还含有非目的条带，则通过电泳胶回 收目的基因片段，取回收产物30~50ng进行混合，以混合的PCR产物为模板，同时加入各内 侧引物(融合位点两侧的融合片段1的3'端引物和融合片段2的5'端引物，如果插入片段大 于50bp，则同时加入插入片段3的5'端引物和V端引物）1μ1(0.1μΜ)和目的基因的一对外侧 引物(融合片段1的5'端引物和融合片段2的3'端引物)各1μ1(10μΜ)，在含有pfu高保真DNA 聚合酶反应体系进行PCR反应，获得融合的全长基因。
[0043] 本实施方式所述的外侧引物是指融合片段1的5'端引物和融合片段2的3'端引物。
[0044]
【具体实施方式】九:本实施方式与【具体实施方式】八不同的是:获取基因突变过程中， 在引物设计时将所要突变的碱基位点包含在步骤一所述的15bp的重叠区段内。其它与具体 实施方式八相同。
【具体实施方式】 [0045] 十:本实施方式与八不同的是:获取基因缺失过程中， 在引物设计时将所要缺失的片段删掉，融合位点两侧引物的5'端要有步骤一所述的15bp片 段的重叠区。其它与八相同。
【具体实施方式】 [0046] 十一:本实施方式与八不同的是:获取基因插入过程 中，若重组片段序列50bp以内，在引物设计时将插入序列直接合成在引物5'端并保证步骤 一所述的15bp片段的重叠区;若序列片段大于50bp，需要先合成该片段模板，并在该片段第 三对引物设计时保证与插入点前后两个融合片段在引物Y端的15bp片段的重叠区上。其它 与八相同。
【具体实施方式】 [0047] 十二:本实施方式与八不同的是:获取基因片段重组 过程中，在引物设计时保证所要重组片段位点两侧引物的5'端各自含有步骤一所述的15bp 的重叠区段。其它与八相同。
[0048]通过以下实施例验证本发明的有益效果：
[0049] 以下实施例如无特殊说明，均为常规实验方法:关于实验材料:DH5a感受态细胞， pET28a质粒DNA本实验室保存。LB培养基购自Merck公司，CloneAmp HiFi PCR Premix购自 Clontech公司，胶回收试剂盒、质粒提取盒、lkb DNA marker购自NEB公司、引物合成由IDT 完成、测序由Fish公司完成。
[0050] 实施例1
[0051 ]以含有Nrf2和eGFP基因的克隆载体为基础，分别将Nrf2与eGFP的N端功能域序列 两端进行融合，且Nrf2和eGFP基因 N端功能域eGFPN序列之间插入一段RSIAT (CGCTCCATCGCCACG) 1 inker进行连接(示意图如图5所示），并重组入pET28a表达载体：
[0052] 步骤一、根据老鼠 Nrf2基因全长序列（GenBank登陆号：NM_010902.4)和eGFP基因 全长序列（Genbank U55762.1)，设计四对引物eGFPN F和eGFPN+RL R，RL+Nrf2 F和Nrf2 R, Nrf2 F和Nrf2+RL R，RL+eGFPN R，其中eGFPN F和eGFPN+RL R用于扩增出eGFPN的N 端片段并在：^末端加上15&?的1^111?^，此+处€2?和处€2 1?用于扩增出处€2全长并在5/末 端加上15bp的Linker，其中15bp的Linker为融合位点的重叠区，eGFPN ?和处€2 R可用于扩 增eGFPN+Nrf2整个融合基因的全长。同样，Nrf2 F和Nrf2+RL R用于扩增出Nrf2全长并在3' 末端加上15&?的1^1?^，1^+66??〃？和66??〃1?用于扩增出66??%伽端片段并在5 /末端加上 15bp的Linker，其中15bp的Linker为融合位点的重叠区，Nrf2F和eGFPN R可用于扩增Nrf2+ eGFPN整个融合基因的全长。各引物序列如表1:
[0053] 表1 S0E-PCR引物碱基序列
[0054]
[0055] 注:eGFPN ?与1?2?下划线为Nde I酶切位点，Nrf2R与eGFPN 1?下划线为Sac I酶切 位点;浪线为15bp的Linker重叠区。
[0056]步骤二、PCR反应扩增融合片段:取含有Nrf 2和eGFP基因的质粒(50ng)DNA为模板， 分别加入引物eGFPN R以及引物RL+Nrf2F和Nrf2R或者加入引物Nrf2F和Nrf2+ RL R以及引物RL+eGFPN F和eGFPN R(各 1μ1，10μΜ)，加入CloneAmp HiFi PCRPremix 25μ1， 加去离子水至50μ1，按下列程序在PTC-200PCR仪中反应：
[0057]
[0058] 得到以RL(Linker)序列为重叠区的两个片段PCR产物并电泳检测（图6)。
[0059] 步骤三、S0E-PCR反应:对电泳检测为单一目的条带的PCR产物，分别取片段PCR产 物各?μL作模板，如果步骤二中产物有非目的条带，则需纯化回收;并加入重叠引物各?μL (0 · ΙμΜ))，加入目的片段外侧引物eGFPN F和Nrf2R或者Nrf 2F和eGFPN R各ΙμL (10μΜ)，加入 CloneAmp HiFi PCRPremix 25μ补充去离子水至50μ1，按下列程序进行反应：
[0060]
[0061 ] 得到所需融合的全长基因 eGFPN-Nrf2和Nrf2 - eGFPN(图7)。单一条带的PCR产物 进行融合反应时，模板的量〇.25μ1 - ΙμL以及是否加入重叠引物ΙμΙ(Ο.ΙμΜ)，对结果几乎没 有影响（图8)。
[0062] 步骤四、融合目的片段纯化一一胶回收：按照胶回收试剂盒(Monarch DNA Gel Extraction Kit (NEB))操作说明进行琼脂糖电泳和胶回收纯化，切下含有目的片段的胶 带，加入4倍体积的融胶缓冲液，50 °C 5分钟，期间漩涡震荡2 - 3次，直到完全融解;液体过柱 12000rpm离心1分钟，弃废液;加入200μ1 DNA洗脱缓冲液12000rpm离心1分钟，弃废液，重复 洗脱一次;将DNA结合柱转移到新的离心管中室温放置5分钟;加入10μ1(ΗΗ 20,室温放置1分 钟，12000rpm离心1分钟，获得纯化的融合基因片段。
[0063] 步骤五、克隆测序:通过Ndel和SacI双酶切融合的基因片段和pET28a载体：
[0064]
[0065] 37 Γ，30分钟。电泳，切胶回收。
[0066]基因片段与目的载体连接：
[0067]
[0068] 室温反应15分钟，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒DNA，酶切验 证(图9)，测序结果分析基因融合正确（图10)。
【主权项】
1. 基于重叠延伸PCR法的基因突变、缺失、插入和重组片段的获取方法，其特征在于它 是按照以下步骤进行的： 一、 根据所需融合的DNA片段序列设计两对或三对引物，在对应突变、缺失、插入和重组 位点的两个相邻引物5'末端设计一个长度为15bp的重叠区段，3'末端为引物与模板特异性 结合序列，然后利用设计的引物，以含有所需融合的基因片段或者质粒DNA为模板，分别进 行平行的PCR反应，获得融合位点处含有15个碱基重叠的两组或三组PCR产物； 二、 若步骤一的PCR产物为单一目的条带，则取两组或三组未纯化的PCR产物1~2μ1进 行混合，以混合的PCR产物为模板，然后加入所需融合的目的基因的一对外侧引物各ΙμL，采 用Pfu高保真DNA聚合酶进行PCR反应，通过DNA片段重叠末端的延伸使两个或三个DNA片段 连接成所需融合的目的基因片段，即完成所述的获取方法。2. 根据权利要求1所述的基于重叠延伸PCR法的基因突变、缺失、插入和重组片段的获 取方法，其特征在于获取基因突变过程中，在引物设计时将所要突变的碱基位点包含在步 骤一所述的15bp的重叠区段内。3. 根据权利要求1所述的基于重叠延伸PCR法的基因突变、缺失、插入和重组片段的获 取方法，其特征在于获取基因缺失过程中，在引物设计时将所要缺失的片段删掉，融合位点 两侧引物的5'端要有步骤一所述的15bp片段的重叠区。4. 根据权利要求1所述的基于重叠延伸PCR法的基因突变、缺失、插入和重组片段的获 取方法，其特征在于获取基因插入过程中，若重组片段序列小于50bp，在引物设计时将插入 序列直接合成在引物5'端并保证步骤一所述的15bp片段的重叠区；若序列片段大于50bp， 并在该片段第三对引物设计时保证与插入点前后两个融合片段在引物5'端的15bp片段的 重叠区上。5. 根据权利要求1所述的基于重叠延伸PCR法的基因突变、缺失、插入和重组片段的获 取方法，其特征在于获取基因片段重组过程中，在引物设计时保证所要重组片段位点两侧 引物的5'端各自含有步骤一所述的15bp的重叠区段。6. 基于重叠延伸PCR法的基因突变、缺失、插入和重组片段的获取方法，其特征在于它 是按照以下步骤进行的： 一、 根据所需融合的DNA片段序列设计两对或三对引物，在对应突变、缺失、插入和重组 位点设计的两个相邻引物Y末端设计一个长度为15bp的重叠区段，3'末端为引物与模板特 异性结合序列，然后利用设计的引物，以所需融合的基因片段或者质粒DNA为模板，分别进 行平行的PCR反应，获得融合位点处含有15个碱基重叠的两组或三组PCR产物； 二、 若步骤一中所得的PCR产物为除了目的条带还含有非目的条带，则通过电泳胶回收 目的基因片段，取回收产物30~50ng进行混合，以混合的PCR产物为模板，同时加入各内侧 引物UU和目的基因的一对外侧引物各?μL，在含有Pfu高保真DNA聚合酶反应体系5〇μ1中进 行PCR反应，获得融合的全长基因，即完成所述的获取方法。7. 根据权利要求6所述的基于重叠延伸PCR法的基因突变、缺失、插入和重组片段的获 取方法，其特征在于获取基因突变过程中，在引物设计时将所要突变的碱基位点包含在步 骤一所述的15bp的重叠区段内。8. 根据权利要求6所述的基于重叠延伸PCR法的基因突变、缺失、插入和重组片段的获 取方法，其特征在于获取基因缺失过程中，在引物设计时将所要缺失的片段删掉，融合位点 两侧引物的5'端要有步骤一所述的15bp片段的重叠区。9. 根据权利要求6所述的基于重叠延伸PCR法的基因突变、缺失、插入和重组片段的获 取方法，其特征在于获取基因插入过程中，若重组片段序列在50bp以内，在引物设计时将插 入序列直接合成在引物5'端并保证步骤一所述的15bp片段的重叠区；若序列片段大于 50bp，需要先合成该片段模板，并在该片段第三对引物设计时保证与插入点前后两个融合 片段在引物5'端的15bp片段的重叠区上。10. 根据权利要求6所述的基于重叠延伸PCR法的基因突变、缺失、插入和重组片段的获 取方法，其特征在于获取基因片段重组过程中，在引物设计时保证所要重组片段位点两侧 引物的5'端各自含有步骤一所述的15bp的重叠区段。
【文档编号】C12N15/10GK105907749SQ201610348835
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】周波
【申请人】东北林业大学