中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器的制备及应用
【专利摘要】本发明公开了一种中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器的制备及应用，该纳米反应器是以正硅酸乙酯作为硅源，以P123为模板剂，以正癸烷和1,3,5?三甲基苯的复合物为添加剂，先利用水热合成法制备成中空球缺形介孔二氧化硅，然后以其为固定化载体固载氯过氧化物酶得到。本发明制备方法简单，反应条件温和，所得介孔二氧化硅为中空球缺形，比表面积较大，介孔孔径范围在14～18nm左右，能实现氯过氧化物酶的单分子固定，并且为氯过氧化物酶留有一定的翻转空间。本发明中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器对茜素红表现出很好的降解能力，使用8次后降解率仍然可达到100％，且其耐高温性提高至50℃左右，酸碱耐受性也有所改善。
【专利说明】
中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器的制备 及应用
技术领域
[0001 ]本发明属于酶的固定化技术领域，具体涉及一种中空球缺形介孔二氧化硅载体材 料单分子固定氯过氧化物酶的方法，以及该方法制备的纳米反应器在降解茜素红中的应 用。
【背景技术】
[0002] 氯过氧化物酶(CP0)是从海洋真菌Caldariomyces fumago中分离出来的一种血红 素过氧化物酶(42kDa)<XP0具有极为广泛的氧化活性，兼具血红素过氧化物酶(单电子及两 电子过氧化、有机卤化）、过氧化氢酶(过氧化氢歧化、一元醇氧化）以及细胞色素 P-450(脱 烷基化、烯键环氧化、磺化氧化等)等多种酶的催化特征，目前被认为是过氧化物酶家族中 应用最广泛的酶。但游离的CP0对强酸强碱、高温、有机溶剂等耐受性极差，所以通常需要实 现酶固定化。酶在固相载体上的固定化可以有效改善酶对强酸强碱、高温、有机溶剂等的耐 受性，提高其在反应环境中的稳定性，并通过实现重复使用来降低使用成本，从而提升酶试 剂的产业化应用潜能。固相载体对固定化酶的性能有重要影响。介孔材料因其具有较大的 比表面积、高的孔隙率等优势，被广泛用于酶的固定化，但其在酶的固定化方面存在介孔材 料与酶分子尺寸不匹配等问题。酶的固定化要求介孔材料的孔径既要大于一定范围使酶分 子能够进去，并提供一定的空间满足酶分子在催化过程中翻转的需要，同时介孔材料的孔 径又不能太大，以免使进去的酶分子较多而产生聚集从而造成底物在其中的传质阻力增 大。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种比表面积大、空隙率高、孔径与氯过氧 化物酶分子尺寸匹配的中空球缺形介孔二氧化硅实现单分子固定氯过氧化物酶的方法，并 为该方法制备的纳米反应器提供一种新的应用。
[0004] 解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
[0005] 1、制备中空球缺形介孔二氧化硅
[0006] 将P123加入浓盐酸与去离子水的体积比为1:8~10的混合液中，然后加入1，3,5_ 三甲基苯和正癸烷，搅拌至P123完全溶解，再加入正硅酸乙酯，在40~50 °C下搅拌反应16~ 20小时后转移至水热反应釜中，在80~120°C下水热反应24~36小时，冷却至室温，抽滤、洗 涤、真空干燥，所得产物在500~600°C下煅烧3~5小时，得到中空球缺形介孔二氧化硅，其 中1，3，5_三甲基苯与正癸烷、P123的质量比为1:(1.5~4) :(0.3~1)，正硅酸乙酯与P123的 质量比为1.5~3:1。
[0007] 2、固定化氯过氧化物酶
[0008] 将中空球缺形介孔二氧化硅加入pH值为2.75~5.0的磷酸缓冲液中，超声分散均 匀，再加入氯过氧化物酶水溶液，室温震荡温育2~4小时，离心分离，真空干燥，得到中空球 缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器。
[0009] 上述步骤1中，优选1，3,5-三甲基苯与正癸烷、P123的质量比为1:2:0.4,优选正硅 酸乙酯与P123的质量比为2:1。
[0010] 上述步骤1中，进一步优选在1〇〇 °C下水热反应30小时，所得产物进一步优选在550 °C下煅烧4小时。
[0011] 上述步骤2中，所述的中空球缺形介孔二氧化娃与氯过氧化物酶的质量比为1: 0.01~0.05，进一步优选中空球缺形介孔二氧化娃与氯过氧化物酶的质量比为1:0.02~ 0.03，所述磷酸缓冲液的pH值优选为3~3.5。
[0012] 上述的P123为聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物，其数均分子量 为5800,由Sigma-Aldrich公司提供。
[0013] 上述方法制备的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器在催化降解 茜素红中的应用，具体方法为：向pH值为2~4的磷酸缓冲液中加入中空球缺形介孔二氧化 硅/氯过氧化物酶纳米反应器、待降解的茜素红样品和H 202水溶液，混合均匀，其中空球缺形 介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器中固载的氯过氧化物酶与H 2〇2、茜素红的摩尔比为 1: (60~70): (100~300)，在20°C下恒温震荡反应10~20分钟。
[0014]本发明以正硅酸乙酯作为硅源，以P123为模板剂，以正癸烷和1，3,5_三甲基苯的 复合物为添加剂，利用水热合成法制备成球缺形介孔二氧化硅，然后以其为固定化载体用 于氯过氧化物酶的固定化。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0015] 1、本发明采用水热法制备球缺形介孔二氧化硅，制备方法简单，反应条件温和，所 得介孔二氧化硅为空心球缺形，比表面积较大，介孔孔径范围在14~18nm左右，而氯过氧化 物酶分子的直径为7nm左右，该介孔材料的尺寸恰好能实现氯过氧化物酶的单分子固定，并 且为氯过氧化物酶留有一定的翻转空间。
[0016] 2、本发明采用空心球缺形介孔二氧化硅固定氯过氧化物酶后，氯过氧化物酶对茜 素红表现出很好的降解能力，使用8次后降解率仍然可达到100%，且耐高温性提高至50°C 左右，酸碱耐受性也有所改善。
【附图说明】
[0017]图1是实施例1制备的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶的扫描电镜图。
[0018] 图2是实施例1制备的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶的透射电镜图。
[0019] 图3是实施例1制备的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶的氮气吸附-脱附 等温线图。
[0020] 图4是实施例1制备的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶的孔径分布图。
[0021 ]图5是实施例2制备的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶的扫描电镜图。
[0022] 图6是实施例2制备的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶的透射电镜图。
[0023] 图7是实施例2制备的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶的氮气吸附-脱附 等温线图。
[0024] 图8是实施例2制备的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶的孔径分布图。
[0025] 图9是实施例1~4制备的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶的热稳定性柱 状图。
[0026] 图10是实施例1~4制备的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶的pH耐受性柱 状图。
[0027] 图11是实施例1制备的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶降解茜素红的循 环使用效果图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于 这些实施例。
[0029] 实施例1
[0030] 1、制备中空球缺形介孔二氧化硅
[0031] 向100mL烧杯中加入lg数均分子量为5800的P123、3.7mL浓HC1 (质量分数为37%)、 30mL去离子水，再加入2.5g 1，3，5-三甲基苯和5.0g正癸烷，搅拌使P123完全溶解，再加入 2g正硅酸乙酯，在40°C下磁力搅拌反应20小时后转移至水热反应釜中，在100°C下水热反应 30小时，冷却至室温，抽滤，分别用去离子水和无水乙醇充分过滤洗涤，然后在80°C下真空 干燥10小时，所得产物置于马弗炉中在550°C下煅烧4小时，除去模板剂P123,冷却到室温， 得到中空球缺形介孔二氧化硅。
[0032] 2、固定化氯过氧化物酶
[0033] 将5mg中空球缺形介孔二氧化硅加入到2mL的离心管中，向其中加入1480μ L0 · lmol/L pH值为3的磷酸缓冲液，超声分散均匀，再加入20yL 0· 15mmol/L的氯过氧化物 酶水溶液，将离心管放置在冷冻恒温水浴振荡器中，室温震荡温育3小时，震荡完后，将离心 管放在冷冻离心机中12000转/分子离心4分钟，得到中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物 酶纳米反应器。
[0034] 采用Quanta200型环境扫描电子显微镜(FEI公司）、JEM-2100型透射电子显微镜 (日本电子有限公司）、ASAP2020HD88型物理吸附仪(麦克默瑞提克(上海)仪器有限公司）分 别对所得纳米反应器进行形貌和氮气吸附-脱附和孔径分布测试，结果见图1~3。由图1可 见，所得产品呈规则的中空球缺形，即每个球体上面都具有一个开口，表面粗糙。由图2可 见，所得产品为介孔材料，且孔道结构有序，其表面积为731.8059m 2 · g<、孔容约为 1.758597cm3 · g-\孔径为2.9523nm(见图3和4)，酶的固载量在 13.0mg · g-、
[0035] 实施例2
[0036] 在实施例1的步骤1中，向100mL烧杯中加入lg数均分子量为5800的P123、3.7mL浓 HC1 (质量分数为37 % )、30mL去离子水，再加入1.5g 1，3，5-三甲基苯和6g正癸烷，搅拌使 P123完全溶解，再加入2g正硅酸乙酯，在40°C下磁力搅拌反应20小时后转移至水热反应釜 中，在100°C下水热反应30小时，冷却至室温，抽滤，分别用去离子水和无水乙醇充分过滤洗 涤，然后在80°C下真空干燥10小时，所得产物置于马弗炉中在550°C下煅烧4小时，除去模板 剂P123,冷却到室温，得到中空球缺形介孔二氧化硅。其他步骤与实施例1相同，得到中空球 缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器。由图5可见，所得产品呈规则的中空球缺形， 即每个球体上面都具有一个开口，表面光滑。由图6可见，所得产品为介孔材料，且孔道结构 有序，其表面积为535.8029m 2 · g-1、孔容约为1.325893cm3 · g-1、孔径为14.7676nm(见图7和 8)，酶的固载量在12.3mg · g一、
[0037] 实施例3
[0038] 在实施例1的步骤1中，向100mL烧杯中加入1.5g数均分子量为5800的P123、3.7mL 浓HC1 (质量分数为37 % )、30mL去离子水，再加入3g 1，3，5-三甲基苯和4.5g正癸烷，搅拌使 P123完全溶解，再加入2.5g正硅酸乙酯，在40°C下磁力搅拌反应20小时后转移至水热反应 釜中，在100°C下水热反应30小时，冷却至室温，抽滤，分别用去离子水和无水乙醇充分过滤 洗涤，然后在80°C下真空干燥10小时，所得产物置于马弗炉中在550°C下煅烧4小时，除去模 板剂P123,冷却到室温，得到中空球缺形介孔二氧化硅。其他步骤与实施例1相同，得到中空 球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器，其表面积为731.8059m 2 · g<、孔容约为 1.758597cm3 · g-1、孔径为22.9523nm，酶的固载量在12.6mg · g-1。
[0039] 实施例4
[0040] 在实施例1的步骤1中，向100mL烧杯中加入lg数均分子量为5800的P123、3.7mL浓 HC1 (质量分数为37 % )、30mL去离子水，再加入2g 1，3，5-三甲基苯和5.5g正癸烷，搅拌使 P123完全溶解，再加入2g正硅酸乙酯，在40°C下磁力搅拌反应20小时后转移至水热反应釜 中，在100°C下水热反应30小时，冷却至室温，抽滤，分别用去离子水和无水乙醇充分过滤洗 涤，然后在80°C下真空干燥10小时，所得产物置于马弗炉中在550°C下煅烧4小时，除去模板 剂P123,冷却到室温，得到中空球缺形介孔二氧化硅。其他步骤与实施例1相同，得到中空球 缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器。
[0041 ] 实施例5
[0042]实施例1~4制备的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器在降解茜 素红中的应用，具体方法和试验结果如下：
[0043]向2mL离心管中加入30yL 10mmol/L的茜素红染料、5mg中空球缺形介孔二氧化硅/ 氯过氧化物酶纳米反应器，并加入1370yL 0.1mol/L pH值为3的磷酸缓冲液、lOOyL lmmol/ L H2〇2水溶液，混合均匀，然后将离心管置于冷冻恒温水浴振荡器中，在20°C下恒温震荡反 应15分钟，其降解率达到100%。
[0044] 为了确定本发明中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器（以下简称 固定化酶)的各项性能，发明人进行了如下实验：
[0045] 1、热稳定性实验
[0046]向2mL离心管中加入30yL 10mm〇l/L的茜素红染料，然后加入5mg固定化酶或等酶 量的游离CP0,并加入1370yL 0.1mol/L pH值为3的磷酸缓冲液、100yLlmmol/L H2〇2水溶液， 然后将离心管置于冷冻恒温水浴振荡器中，分别在20、30、40、50、60、70°(：下恒温震荡反应 15分钟。利用降解率的大小可以表现出酶活性的相对大小，在同等条件下，降解率越大，酶 所具有的活性越大，催化性能越好。染料降解率即脱色率根据下式计算：
[0047]
[0048] 其中：Ao为染科降觯前在421nm处的吸光度值;At为染料降解后在421nm处的吸光度 值。测试结果见图9。
[0049]由图9可见，在50°C时，游离CP0对茜素红的脱色率不到40%，酶活性明显降低，而 本发明实施例1~4制备的固定化酶在50°C时仍表现出较好的酶活性，茜素红的脱色率近 100%，说明其耐尚温性明显提尚。
[0050] 2、pH耐受性实验
[00511向2mL离心管中加入30yL 10mm0l/L的茜素红染料，然后加入5mg固定化酶或等酶 量的游离CP0,并加入1370yL 0.1mol/L pH值为2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5的磷酸缓冲液， 再加入100此lmmol/L H202水溶液，然后将离心管置于冷冻恒温水浴振荡器中，在20°C下恒 温震荡反应15分钟。测试茜素红的脱色率，结果见图10。
[0052]由图10可见，在pH值为3.0时，固定化酶的降解率几乎都达到了 100 %，而游离CP0 只达到40% ;继续增大pH，在pH值为4.0时，游离CP0几乎不再具有催化效果，但是本发明实 施例1~4制备的固定化酶对茜素红的降解率仍可达到40%以上，其中实施例1制备的固定 化酶对茜素红的降解率可达到80 %以上，说明其更耐酸性。
[0053] 3、重复使用实验
[0054]向2mL离心管中加入30yL 10mm〇l/L的茜素红染料，然后加入5mg固定化酶或等酶 量的游离CP0,并加入1370yL 0.1mol/L pH值为3的磷酸缓冲液，再加入100yL 0.1mmol/L H2〇2水溶液，然后将离心管置于冷冻恒温水浴振荡器中，在20°C下恒温震荡反应15分钟，然 后离心分离重复使用。测试重复使用次数对茜素红脱色率的影响，结果见11。
[0055]由图11可见，实施例1制备的固定化酶循环使用8次，其对茜素红的降解率仍接近 100 %，说明其催化活性高、稳定性好。
【主权项】
1. 一种中空球缺形介孔二氧化娃/氯过氧化物酶纳米反应器的制备方法，其特征在于 它由下述步骤组成： (1) 制备中空球缺形介孔二氧化硅 将数均分子量为5800的P123加入浓盐酸与去离子水的体积比为1:8~10的混合液中， 然后加入1，3,5-三甲基苯和正癸烷，搅拌至P123完全溶解，再加入正硅酸乙酯，在40~50°C 下搅拌反应16~20小时后转移至水热反应釜中，在80~120°C下水热反应24~36小时，冷却 至室温，抽滤、洗涤、真空干燥，所得产物在500~600°C下煅烧3~5小时，得到中空球缺形介 孔二氧化硅，其中1，3，5_三甲基苯与正癸烷、P123的质量比为1:(1.5~4) :(0.3~1)，正硅 酸乙酯与P123的质量比为1.5~3:1; (2) 固定化氯过氧化物酶 将中空球缺形介孔二氧化硅加入pH值为2.75~5.0的磷酸缓冲液中，超声分散均匀，再 加入氯过氧化物酶水溶液，室温震荡温育2~4小时，离心分离，真空干燥，得到中空球缺形 介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器。2. 根据权利要求1所述的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器的制备 方法，其特征在于:在步骤(1)中，所述1，3，5-三甲基苯与正癸烷、P123的质量比为1:2:0.4。3. 根据权利要求1所述的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器的制备 方法，其特征在于:在步骤(1)中，所述正硅酸乙酯与P123的质量比为2:1。4. 根据权利要求1~3任意一项所述的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反 应器的制备方法，其特征在于:所述步骤(1)中，在100 °C下水热反应30小时。5. 根据权利要求1~3任意一项所述的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反 应器的制备方法，其特征在于:在步骤(1)中，所得产物在550°C下煅烧4小时。6. 根据权利要求1所述的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器的制备 方法，其特征在于:在步骤(2)中，所述磷酸缓冲液的pH值为3~3.5。7. 根据权利要求1或6所述的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器的制 备方法，其特征在于:在步骤(2)中，所述的中空球缺形介孔二氧化娃与氯过氧化物酶的质 量比为1:0.01~0.05。8. 根据权利要求1或6所述的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器的制 备方法，其特征在于:在步骤(2)中，所述的中空球缺形介孔二氧化娃与氯过氧化物酶的质 量比为1:0.02~0.03。9. 权利要求1的方法制备的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器在催 化降解茜素红中的应用。10. 根据权利要求9所述的中空球缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器在催化 降解茜素红中的应用，其特征在于：向PH值为2~4的磷酸缓冲液中加入中空球缺形介孔二 氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器、待降解的茜素红样品和H 2O2水溶液，混合均匀，其中空球 缺形介孔二氧化硅/氯过氧化物酶纳米反应器中固载的氯过氧化物酶与H 2〇2、茜素红的摩尔 比为1: (60~70): (100~300)，在20°C下恒温震荡反应10~20分钟。
【文档编号】C02F3/34GK105907743SQ201610466484
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】蒋育澄, 程涵萍, 胡满成, 李淑妮, 翟全国
【申请人】陕西师范大学