一株抗呋喃它酮代谢物amoz的单克隆抗体杂交瘤细胞株yh4及其应用
【专利摘要】一株抗呋喃它酮代谢物AMOZ的单克隆抗体杂交瘤细胞株YH4及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明杂交瘤细胞株YH4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12017。抗呋喃它酮代谢物AMOZ单克隆抗体，它由所述杂交瘤细胞株YH4分泌产生。此细胞株YH4分泌的单克隆抗体，对呋喃它酮代谢物AMOZ具有较好的特异性（IC50值为0.2μg/L），有较好的检测灵敏度和亲和力，可用于食品安全中抗呋喃它酮代谢物AMOZ的特异性检测。还提供了一种新的合成呋喃它酮代谢物AMOZ免疫原的方法，半抗原的合成步骤更加简化，有效，为今后人们的研究提供了合成免疫原的思路与方法。CGMCC No.1201720160120
【专利说明】
一株抗呋喃它酮代谢物AMOZ的单克隆抗体杂交瘤细胞株YH4及其应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及一株抗呋喃它酮代谢物(AMOZ)的单克隆抗体杂交瘤细胞株YH4及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。
【背景技术】
[0002]呋喃它酮药物抗菌谱较广，对大多数革兰氏阳性菌、阴性菌均有抗菌作用，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、化脓性链球菌等。本品内服后在肠道不易吸收，故主要用于肠道感染，也可用于球虫病、火鸡黑头病的治疗。硝基呋喃类光谱抗生素(呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林)主要出现在动物性食品中。他们对人类健康有恶性影响，有致癌性，包括美国、加拿大和欧盟在内的很多国家都有对食物中应用的禁令。这些国家对所有含有硝基呋喃残留的进口食物都有禁令。AMOZ是呋喃它酮的代谢物，在一般的烹调中不易分解，在温和的酸性条件下可以从组织中释放出来，因此可以用来做检测使用。为了人和动物的安全很有必要对水源和食品(如:肉)进行该类抗生素残留检测。
[0003]目前AMOZ的检测方法主要是高效液相色谱法(HPLC)，液质联用法(LC-MS-MS)等紫外仪器方法，但是这些方法存在操作繁琐，耗时，费用比较贵等缺点，不能实现大量样品的快速检测。因此建立一种快速简便的AMOZ检测方法具有重要意义。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。然而得到高特异性和高灵敏度的单克隆单体是免疫学检测的前提，其中人工抗原的合成是重要的一步。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一株抗AMOZ单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对AMOZ具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立AMOZ的免疫学检测方法。
[0005]本发明的技术方案，一株抗呋喃它酮代谢物AMOZ的单克隆抗体杂交瘤细胞株YH4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCN0.12017。
[0006]抗呋喃它酮代谢物AMOZ单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCCN0.12017的抗呋喃它酮代谢物AMOZ单克隆抗体杂交瘤细胞株YH4分泌产生。
[0007]所述抗呋喃它酮代谢物AMOZ单克隆抗体的应用，其在食品安全中呋喃它酮代谢物AMOZ残留检测中的应用。
[0008]本发明提供的YH4细胞株的制备基本步骤为:
(I)半抗原的合成:称取邻醛基苯甲酸(2-CBA)ll.5mg于25mL圆底烧瓶中，加入纯水
1.3mL，IM HCl溶液60yL，磁力搅拌下滴加DMF直至邻醛基苯甲酸完全溶解，加入呋喃它酮代谢物AMOZ 30mg，溶解后，连接冷凝管并置于60 V水浴锅中回流过夜，得到白色沉淀，将反应液过滤，把滤纸上的白色固体放在37°C烘箱烘干，即得到半抗原2-CP ΑΜ0Ζ;用液质连用技术进行鉴定与分析；
(2)标准品的合成:利用硝基呋喃代谢物的氨基与邻硝基苯甲醛的醛基发生缩合反应而制成的，用邻硝基苯甲醛置换邻醛基苯甲酸即可得到标准品2-NPAM0Z，用液质连用技术进行鉴定与分析；
(3)免疫原2-CPAM0Z-KLH的制备:称取步骤(I)制备的2-CPAM0Z5.0mg，二环己基碳二亚胺(DCC)7.8mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 4.4mg，用0.6mL无水DMF溶解(称为A液)，室温搅拌反应4h。称取KLH 1mg溶于4mL pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲溶液中(称为B液)，在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得免疫原2-CPAMOZ-KLH混合液；
(4)包被原2-CPAMOZ-OVA的制备:称取步骤(I)制备的2-CPAMOZ5.0mg，碳二亚胺(EDC)
7.2mg，NHS 4.4mg，用0.6mL无水DMF溶解(称为C液)，室温搅拌反应4h。称取OVA 6mg溶于3mLpH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲溶液中(称为D液)，在室温条件下逐滴将C液加入到D液中，室温反应过夜，即得包被原2-CPAM0Z-0VA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；
(5)小鼠的免疫:取AMOZ完全抗原2-CPAM0Z-KLH与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之间间隔21天。最后一次用AMOZ完全抗原(不含佐剂)注射入小鼠腹腔冲击免疫;通过间接ELISA检测血清效价和抑制；
(6)细胞融合与细胞株建立:通过聚乙二醇(PEG4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株YH4;
(7)杂交瘤细胞株性质的鉴定:通过ELISA法测定灵敏度和特异性。
[0009]本发明的有益效果:本发明提供了一种新的半抗原合成的思路，通过衍生得到半抗原，从而得到灵敏度很好的单克隆抗体细胞株。通过本发明获得的抗AMOZ单克隆抗体细胞株YH4分泌的单克隆抗体，对AMOZ有较好的检测灵敏度和特异性，其IC5q值为0.2yg/L。
[0010]生物材料样品保藏:单克隆细胞株YH4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.12017，保藏日期2016年I月20日。
【附图说明】
[0011]图1是YH4单克隆抗体的抑制标准曲线。
【具体实施方式】
[0012]本发明下面的实施例仅作为本
【发明内容】
的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
[0013]本发明通过将AMOZ完全抗原2-CPAM0Z-KLH免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELI SA和间接竞争ELI SA筛选细胞上清，最终得到了对AMOZ有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
[0014]实施例1杂交瘤细胞株YH4的制备 (I)完全抗原及标准品的合成:称取邻醛基苯甲酸(2-CBA) 11.5mg于25mL圆底烧瓶中，加入纯水1.3mL，lM HCl 60yL，磁力搅拌下滴加DMF直至邻醛基苯甲酸完全溶解，加入呋喃它酮代谢物AMOZ 30mg，溶解后，连接冷凝管并置于60 V水浴锅中回流过夜，得到白色沉淀，将反应液过滤，把滤纸上的白色固体放在37 °C烘箱烘干，即得到半抗原2-CP AMOZ。用液质连用技术进行鉴定与分析。
[0015]标准品的合成是利用硝基呋喃代谢物的氨基与邻硝基苯甲醛的醛基发生缩合反应而制成的，用邻硝基苯甲醛置换邻醛基苯甲酸即可，得到标准品2-NPAM0Z，用液质连用技术进行鉴定与分析。
[0016]免疫原2-CPAM0Z-KLH 的制备:称取 2-CPAMOZ 5.0mg, DCC 7.8mg，NHS 4.4mg，用
0.6mL无水DMF溶解(称为A液)，室温搅拌反应4h。称取KLH 1011^溶于41^ pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲溶液中(称为B液)，在室温条件下逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得免疫原2-CPAM0Z-KLH混合液；
包被原2-CPAM0Z-0VA的制备:称取2-CPAMOZ 5.0mg,EDC 7.2mg，NHS 4.411^，用0.611^无水DMF溶解(称为C液)，室温搅拌反应4h。称取OVA 6mg溶于3mL pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲溶液中(称为D液)，在室温条件下逐滴将C液加入到D液中，室温反应过夜，即得包被原2-CPAM0Z-0VA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定。
[0017](2)动物免疫:选择健康的6-8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取AMOZ完全抗原2-CPAM0Z-KLH与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之间间隔21天。三免后7天采血，使用间接竞争ELISA方法测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在四免后18天冲击免疫，不使用佐剂，腹腔注射。
[0018](3)细胞融合:在冲击免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下:
a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
b、收集SP2/0细胞，悬浮于RPM1-1640基础培养液中，进行细胞计数；
C、将脾细胞和SP2/0细胞按照计数比1:10的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间Imin，之后按照从慢到快，加入RPM1-1640基础培养液，离心后悬浮于含20%胎牛血清、2%的50 XHAT的RPM1-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37 °C、5%C02的培养箱中培养。
[0019](4)细胞筛选与细胞株建立:在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPM1-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清、1%的100XHT的RPM1-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步:第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用2-NPAM0Z为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对2-NPAM0Z均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株YH4。
[0020](5)单克隆抗体的制备与鉴定:取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油ImL; 7天后每只小鼠腹腔注射I X 16杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20°C保存。
[0021]使用间接竞争ELISA，测定抗AMOZ单克隆抗体的IC5q为:0.2yg/L，说明对AMOZ有很好的灵敏度，可用于AMOZ免疫分析检测。
[0022](6)抗体应用
将杂交瘤细胞株YH4通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于AMOZ的ELISA添加回收试验，具体步骤如下:
a、包被:将包被原2-CPAM0Z-0VA用0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液从Syg/mL开始倍比稀释，10yL /孔，37°C反应2h;
b、洗涤:将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
c、封闭:拍干后，加入200yL/孔封闭液，37°C反应2h，洗涤后烘干备用；
d、加样:将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，10yL/孔，37°C反应Ih ；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，10yL /孔，37°C反应Ih ；
e、显色:将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入10yL的TMB显色液，37°C避光反应15min；
f、终止和测定:每孔加入50yL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值；
g、结果判读:以OD45q值大于或等于阴性对照孔的2.1倍(S卩P/N彡2.1)所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价；
h、添加回收及样品前处理:取鱼的可食肌肉部分，用均质机均质;称取2g均质后样本于50mL离心管中，并加入4mL去离子水，0.5mL lmol/L盐酸溶液，0.1mL衍生化试剂邻硝基苯甲醛，充分混合3min; 60°C水浴条件下孵育Ih;取出后加入5mL 0.1mo 1/L磷酸氢二钾溶液，
0.4mL mol/L氢氧化钠溶液，6mL乙酸乙酯，充分混合lmin，4000r/min离心5min;移取上层溶液3mL于5mL离心管中，在60°C的水浴或空气吹干仪中，用氮气或空气吹干；向吹干的试管中加入ImL正己烷，加盖振荡Imin，然后加入0.5mL PBST缓冲液，充分混匀，4000r/min离心Imin(或静置至明显分层)；吸取0.4 mL下层溶液，待检。采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为102%，104%，105%。
[0023]溶液的配置:
碳酸盐缓冲液(CBS):称取Na2CO3 1.59g,NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至I OOOmL，4 °C贮存备用；
磷酸盐缓冲液(PBS):8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4,2.9g Na2HPO4.12 H20，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2?7.4，定容至100mL;
PBST:含0.05% 吐温 20的PBS;
TMB显色液:A液:Na2HPO4.12H20 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至 1000mL;B液:60mgTMB溶于10mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB显色液，现用现混。
[0024]综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。
【主权项】
1.一株抗呋喃它酮代谢物AMOZ的单克隆抗体杂交瘤细胞株YH4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC N0.12017。2.抗呋喃它酮代谢物AM O Z单克隆抗体，其特征在于:它由所述保藏编号为C G M C CN0.12017的抗呋喃它酮代谢物AMOZ单克隆抗体杂交瘤细胞株YH4分泌产生。3.权利要求2所述抗呋喃它酮代谢物AMOZ单克隆抗体的应用，其特征在于:其在食品安全中呋喃它酮代谢物AMOZ残留检测中的应用。
【文档编号】G01N33/577GK105907723SQ201610372606
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】匡华, 丁西, 胥传来, 徐丽广, 马伟, 吴晓玲, 刘丽强, 宋珊珊, 胡拥明
【申请人】江南大学