一种产高粘性多糖的细菌的筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种产高粘性多糖的细菌的筛选方法，首先采用含刚果红的显色培养基进行初筛，获取产多糖细菌；进而采用菌落拉丝，通过拉丝效果进一步复筛，获取产高粘性多糖的细菌，最后，选用低氮源浓度的发酵培养基对通过前两轮筛选的细菌进行发酵培养，通过发酵液粘度变化测定，从而实现高粘性多糖胶细菌的判定，达到筛获目标细菌的目的。本发明提供的筛选方法工作量较少，具有更好的筛选方向性和覆盖全面性，以及更高的筛选效率。
【专利说明】
一种产高粘性多糖的细菌的筛选方法
技术领域
[0001]本发明涉及细菌筛选技术领域，特别涉及一种产高粘性多糖的细菌的筛选方法。
【背景技术】
[0002]微生物多糖种类众多，包括胞内多糖、胞壁多糖、胞外多糖等，其中，微生物胞外多糖因独特的理化特性、产量高、易与菌体分离而被广泛研究。近年来微生物胞外多糖已应用在食品、制药、日化等行业。而高粘性的微生物胞外多糖(透明质酸，还有假单胞菌属所产生的结冷胶、黄原胶、威伦胶等)在各行业各业的应用更为广泛。
[0003]目前，微生物胞外多糖是由细菌和真菌发酵分泌提取，其中细菌多糖占有很大的份额，良好的生产菌种是微生物发酵产品企业的核心竞争力，因此，筛选出优良的高性能多糖生产菌株具有重大的现实意义和经济价值。
[0004]现有技术中对产高粘性多糖胶细菌的筛选，通常是在菌种分离纯化后直接进行多糖发酵，由发酵液粘度来筛选目标菌株。该方法需要将所有待查菌株逐一进行液体发酵，工作量极大、筛选效率低。因此，有必要提供一种工作量小且能高效率地筛选出产高粘性多糖胶的目标细菌的方法。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明提供了一种产高粘性多糖的细菌的筛选方法，先通过刚果红显色培养基上接种的菌落的颜色变化来快速甄别产多糖细菌，然后将产多糖细菌接种固体培养基，进而通过菌落拉丝评价筛获产粘性多糖细菌，最后将菌落粘性较好的菌株接种低氮发酵培养基进行培养，通过发酵液粘度变化筛获产高粘性多糖的目标菌株。本发明提供的筛选方法的筛选效率高、工作量小，还可以具有良好的筛选方向性，真正获得目标细菌。
[0006]本发明提供了一种产高粘性多糖的细菌的筛选方法，包括以下步骤:
[0007](I)平板显色法筛获产多糖的细菌:
[0008]将细菌培养基与刚果红溶液混合后形成刚果红显示培养基，将所述刚果红显示培养基铺板，制成刚果红显色平板；
[0009]取分离纯化后的待筛细菌，将所述待筛细菌分别在无菌环境下接种至所述刚果红显色平板上，20?37°C下静置培养24?48小时，观察菌落的颜色有无变深，若观察到菌落颜色变深，即为产多糖的细菌；
[0010](2)菌落拉丝法筛获产粘性多糖的细菌:
[0011]将步骤(I)筛获的细菌接种于固体培养基上，在20?37°C下培养24?48h，待形成一定大小的菌落后，用无菌牙签接触菌落并轻轻向外拉丝，观察能否形成连续拉丝，若能形成连续拉丝，则为产粘性多糖的细菌；
[0012](3)低氮发酵筛获产高粘性多糖的细菌:
[0013]将步骤(2)筛获的细菌接种至低氮发酵培养基中，在温度为20?37°C、振摇速度为150?300r/min下进行振荡培养120-168h，持续监测发酵液的粘度变化趋势，若发酵液的粘度持续升高，则判定产高粘性多糖的细菌，即获得目标细菌。
[0014]本发明中，所述待筛细菌可以是来自不同环境的细菌经过营养富集、菌株纯化获得。可以来自于餐厨下水口、废弃水渠壁的细菌菌株等。
[0015]所述纯化为本领域内的常规操作。可以是将保存于4°C条件下的待筛细菌样品，取1.0g与100ml LB液体培养基混合，20?37°C震荡4?8h，之后取1.0mL的震荡混合液与无菌生理盐水进行梯度稀释，将稀释液涂布在固体LB培养基上，20?37°C静置培养12?48h。挑取单菌落，进行划线纯化，获取并保存待筛菌株。
[0016]本发明中采用刚果红作为显色剂制作显色平板，通过观察刚果红显色平板中接种的菌落颜色变化情况，初步筛选产多糖细菌。主要利用刚果红与细菌所产多糖类物质结合后呈现红褐色阳性反应，具备产多糖能力的细菌菌落颜色变深，呈红褐色，而不产多糖的菌株则呈阴性，菌落颜色无明显变化。
[0017]本发明中采用刚果红作为显色剂，相比于现有技术中采用含荧光染料(如革兰氏)或含苯胺蓝的培养基来显色而言，所述操作更简单快捷，无需提供荧光光源进行观察，也无需在培养完成后另加显色剂进行菌落染色。
[0018]优选地，所述刚果红显色培养基包括:葡萄糖、酵母粉，蛋白胨，KH2P04，MgS04.7H20，NH4NO3，琼脂，刚果红和水。
[0019]进一步优选地，每IL所述刚果红显色培养基包括如下含量的各组分:葡萄糖2?20g，酵母粉0.5?5.0g，蛋白胨 I.0?1g，KH2PO4 0.I ?2.0g，MgSO4.7H200.I ?0.5g，NH4NO3
0.1?2.0g，琼脂15?20g，刚果红:0.05?0.5g，其余为蒸馏水;所述刚果红显色培养基的pH为7.0?7.2。调节pH值是采用HCl和NaOH溶液。
[0020]所述刚果红显色培养基的制备方法如下:取葡萄糖2?20g、酵母粉0.5?5.0g，蛋白胨 1.0?10g，KH2P04 0.1?2.0g，MgS04.7H20 0.I?0.5g,NH4NO3 0.1?2.0g，琼脂 15?2(^，刚果红0.05?0.58，加水至11^，调节口!1至7.0?7.2，121<€下高压灭菌20111；[11后，铺板，制成刚果红显色培养平板。
[0021 ]优选地，步骤(I)中，所述铺板是将所述刚果红显示培养基铺在培养皿上。
[0022]能够产生多糖的细菌种类较多，仅靠平板显色难以将筛选范围迅速缩小，对筛选效率的提高不明显，因此，需要进一步快速缩小筛选范围。
[0023]微生物胞外多糖作为生物高分子，能使菌落具有较大的粘度，其在固体培养基上，产粘性多糖的细菌能形成表面粘稠或四周有扩散现象的菌落，在外力作用下呈现出拉丝状。根据拉丝长度即可初步判定菌落粘稠度，从而筛获可能具有产高粘性多糖能力的细菌。所述拉丝长度为Icm以上时，优选为3cm以上时，该菌落为粘丝菌落。
[0024]优选地，在所述拉丝时，朝垂直于培养基的表面的方向向外拉丝。
[0025]优选地，在每种细菌的4-6个菌落进行拉丝，每个菌落平行做2-3次。
[0026]优选地，每IL所述固体培养基包括如下含量的各组分:葡萄糖2?20g，酵母粉0.5?5.0g，蛋白胨 1.0?10g，KH2P04 0.1?2.0g，MgS04.7H20 0.1?0.5g，NH4N030.1?2.0g，琼脂15?20g，其余为蒸馏水;所述固体培养基的pH为7.0?7.2。
[0027]细菌所产的高分子聚合物中，除了多糖之外，糖蛋白、蛋白聚糖复合物也都有一定的粘度，通过菌落拉丝测试而筛选的细菌可能本身并不是产多糖的，因此，在筛选产高粘性多糖胶细菌的过程中，，仅靠菌落拉丝法难以实现良好的筛选方向性，需要进一步的筛选。本发明中，是对通过刚果红平板显色、菌落拉丝测试的细菌进行多糖发酵，以筛选出目标细菌。
[0028]优选地，每IL所述低氮发酵培养基包括如下含量的各组分:蔗糖20?100g，牛肉膏0.1?2.(^，硝酸钠0?0.58，]\%304.7H20 0.I?0.5g，KH2P〇4 0.1?1.0g，含微量元素的溶液1.0?5.0mL，其余为蒸馏水，所述低氮发酵培养基的pH为7.0?7.2;其中，所述微量元素包括铜、锌和钴。
[0029 ] 优选地，所述微量元素还包括锰、铁、钼和硼中的一种或多种。
[0030]进一步优选地，所述含微量元素的溶液包括以下浓度的各组分= MnCl2.4H200?2.0g/L，FeS04.7H20 O?5.0g/L，H3B03 O?0.5g/L，CuCl2 10?50mg/L，ZnCl210?50mg/L，CoCl2.6H2O I?10mg/L，NaMo04.2H20 O?50mg/L。微量元素溶液提前配制好，在使用时，每IL的培养基，加入1.0?5.0mL的含微量元素的溶液。
[0031]更优选地，所述含微量元素的溶液包括以下浓度的各成分=MnCl2.4H201.0?2.0g/L，FeS04.7H20 I?4.0g/L，H3B03 0.1?0.4g/L，CuCl2 10?50mg/L，ZnCl210?50mg/UC0CI2.6H2O I?10mg/L，NaMo04.2H20 10?40mg/L。
[0032]更优选地，每IL所述低氮发酵培养基包括如下含量的各组分:蔗糖50g，牛肉膏
1.6g，硝酸钠0.4g，MgS04.7H20 0.2g,KH2PO4 0.5g，含微量元素的溶液2mL，其余为蒸馏水，所述低氮发酵培养基的PH为7.0;其中，每IL所述含微量元素的溶液包括以下浓度的各成分:MnCl2.4Η20 1.8g/L，FeS04.7H20 2.5g/L，H3B03 0.285g/L，CuCl2 27mg/L,ZnCl2 21mg/UC0CI2.6H2O 7.4mg/L,NaMoO4.2H20 23mg/L，其余为蒸馏水。
[0033]优选地，步骤(3)中，所述振摇速度为200-250r/min。所述振荡培养的时间为144h。
[0034]如本发明所述的，步骤(3)中，接种后12?24h开始测定发酵液的粘度，若发酵液的粘度持续显著升高，且发酵过程中，发酵液的粘度在转速为30r/min剪切速率下能达到100m Pa.s以上，则判定筛获产高粘性多糖的细菌。在筛获目标细菌之后，可以对其进行16SrRNA序列测定，以确定所述目标细菌的种属。
[0035]本发明的
【申请人】，经过反复摸索发现，能够产高粘性多糖的目标细菌在氮源饥饿的情况下更易产生多糖，本申请中选用低氮源浓度的发酵培养基对通过前两轮筛选(刚果红显示平板-菌落拉丝)的细菌进行发酵培养，当细菌培养进入稳定期，所述低氮培养基中的氮源消耗殆尽后，会迫使目标细菌迅速产生多糖，发酵液的粘度显著上升，发酵液的流动特性也发生明显变化，从而实现高粘性多糖胶细菌的判定，达到筛获目标细菌的目的。这一方法将有效保障筛选方向性和覆盖面，可以有效避免阳性细菌的漏选。
[0036]本发明中首次将刚果红显色平板、菌落拉丝和菌种低氮发酵进行联合，形成独特的筛选方法，逐级缩小筛选范围，其中大规模的定性筛选由刚果红显色平板和菌落拉丝来实现，操作简单、历时较短、筛选效率高，最后针对通过前两轮筛选的少数细菌进行低氮发酵培养，监测发酵液的粘度变化，以进一步确定目标菌株，本发明提供的筛选方法工作量较少，具有更好的筛选方向性和更高的筛选效率。
[0037]本发明的有益效果包括以下几个方面:
[0038]1、本发明的筛选方法中，首次将刚果红显色平板、菌落拉丝和低氮发酵相联合，层层递进，逐级缩小筛选范围，具有较好的筛选方向性和较高的筛选效率；
[0039]2、本发明中的低氮发酵培养基配方，有利于迫使细菌产生高粘性多糖，可以有效保障筛选方向性和覆盖全面性，可以有效避免阳性产高粘性多糖的目标细菌的漏选；
[0040]3、本发明中首次采用刚果红作为显色剂制作显色平板来筛选产多糖细菌，操作简单，无需提供荧光光源进行观察，也无需在培养完成后在另加显色剂进行菌落染色。
【附图说明】
[0041]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0042]图1是本发明中产高粘性多糖的细菌的筛选方法的流程示意图。
[0043]图2为本发明实施例1中通过刚果红显色培养基筛选的结果；
[0044]图3为本发明实施例1中通过菌落拉丝的筛选效果；
[0045]图4为本发明实施例1中不同菌株在低氮发酵过程中的粘度变化结果；
【具体实施方式】
[0046]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0047]实施例1
[0048]参见附图1，本实施提供了一种产高粘性多糖的细菌的筛选方法，包括以下步骤:
[0049]SlOl:刚果红显色培养基筛选产多糖的细菌
[0050]将细菌培养基与刚果红溶液混合后形成刚果红显示培养基，将所述刚果红显示培养基铺板，制成刚果红显色平板；
[0051]取分离纯化后的待筛细菌，将所述待筛细菌的菌落分别接种至所述刚果红显色平板上，观察菌落的颜色有无变深，若观察到菌落颜色变深，则初步筛获产多糖的细菌。
[0052]其中，刚果红显示培养基通过以下方法配置:按照配方称取各组分，将葡萄糖10g、酵母粉2.5g，蛋白胨5g，KH2P04 0.5g,MgSO4.7H20 0.2g，NH4N030.6g，琼脂 15g，刚果红0.2g放入容器中，加蒸馏水至1L，调pH至7.0，得到刚果红显示培养基。之后于121 °C下灭菌20min，将灭菌后的培养基铺在培养皿上，形成刚果红显色平板。
[0053]具体来说，本实施例中，所述待筛细菌是来自于餐厨下水口、废弃水渠壁等营养相对贫瘠的积水处，用无菌钥匙刮取样品后保存于4°C条件下，取1.0g的样品与100ml LB液体培养基混合，20?37°C震荡4?8h，之后取1.0mL的震荡混合液与无菌生理盐水进行梯度稀释，将稀释液涂布在固体LB培养基上，20?37 0C静置培养12?48h。挑取单菌落，进行划线纯化，获取并保存待筛菌株。
[0054]SlOl的部分筛选结果如图2所示。刚果红与产多糖细菌分泌的多糖结合呈红褐色阳性反应，使菌落的颜色变深，而不产多糖菌株则呈阴性，菌落颜色无明显变化。通过刚果红显色培养基中菌落颜色变化情况，即可初步筛获产多糖细菌，其中将菌落颜色变深的细菌进行下一步骤的筛选。图2中标号为Y4-4、Y2-8M、Y3-10M(标号为
【申请人】自己编排)的细菌菌落为可能产多糖的细菌，标号为的Y5-1M、Y5-8M的细菌菌落则为不产多糖的细菌。
[0055]S102:菌落拉丝法筛获产粘性多糖的细菌
[0056]将SlOl筛获的符合条件的细菌接种于固体培养基上，在20?35°C下培养24?48h，当菌落直径达到5.0mm后，用无菌牙签接触菌落并轻轻向外拉丝，然后在2s内垂直离开以观察在培养基表面能否形成连续拉丝，每种细菌重复操作4-6个菌落进行拉丝，每个菌落平行做2-3次，并测量菌落拉丝的最大长度;若能形成连续拉丝，则为产粘性多糖的细菌，即筛获了产粘性多糖的细菌。
[0057]本实施例中，每IL所述固体培养基包括如下含量的各组分::葡萄糖10g/L，酵母粉2.5g/L，蛋白胨5g/L，KH2P04 0.5g/L,MgS04.7H20 0.2g/L,NH4NO3 0.6g/L，琼脂 15g/L，其余为蒸馏水;固体培养基的pH为7.0。
[0058]S102的部分筛选结果如图3所示。产粘性多糖细菌菌落较为粘稠，用无菌牙签挑起时，能在固体培养基表面形成细长的拉丝，根据能否形成连续拉丝及拉丝长度即可初步判断菌落粘稠度，从而筛获产粘性多糖的细菌。图3中，B中标号为Y2-2的细菌，C中标号为Y3-1OM的细菌，以及D中标号为Y4-4的细菌均能形成连续长度超过Icm的拉丝，A不能形成超过
Icm的连续拉丝，其中，B的菌落拉丝的最大长度超过2cm，C的菌落拉丝的最大长度超过3cm，D的菌落拉丝的最大长度超过5cmcm。这说明B、C、D中的细菌为可能产粘性多糖的细菌，可以进入下一步的筛选测试。
[0059]S103:低氮发酵法筛获产高粘性多糖的细菌
[0060](I)配制含微量元素的溶液:所述含微量元素的溶液包括以下浓度的各成分:MnCl2.4H20 1.8g/L，FeS04.7H20 2.5g/L，H3B03 0.285g/L,CuCl2 27mg/L,ZnCl2 21mg/L，CoCl2.6H2O 7.4mg/L,NaMoO4.2H20 23mg/L(溶剂为水)。
[0061](2)制备低氮发酵培养基:按照配方称取各组分，蔗糖50g，牛肉膏1.6g，硝酸钠0.4g,MgSO4.7H20 0.2g，KH2P04 0.5g放入容器中，加入2mL的上述含微量元素的溶液，并加蒸馏水至IL，调pH至7.0，得到所述低氮发酵培养基。
[0062](3)将S102筛获的符合条件的细菌接种至上述低氮发酵培养基中，在温度为30°C、振摇速度为200r/min下进行振荡培养144h，持续观察并用Brookfield粘度计监测发酵液的粘度变化趋势，若发酵液的粘度显著上升，则为产高粘性多糖的细菌，即获得目标细菌。
[0063]本发明的低氮发酵培养基有利于迫使细菌产生高粘性多糖，可以有效保障筛选方向性和覆盖全面性，可以有效避免阳性产高粘性多糖的目标细菌的漏选。S103的筛选结果如图4所示。其中A组为编号Y4-4的细菌;B组为编号Y3-1OM的细菌，C为编号Y2-2的细菌；。由图4可知，Y4-4、Y3-10M的细菌在低氮发酵培养基的发酵过程中，发酵液的粘度持续显著上升，而C组细菌的发酵液粘度基本保持不变，从而判断Υ4-4、Υ3-10Μ的细菌为产高粘性多糖的目标细菌，即目标细菌，而Υ2-2的细菌不是期望的目标细菌。
[0064]实施例2
[0065]—种产高粘性多糖的细菌的筛选方法，操作步骤基本同实施例1，只是具体参数略有不同，其中:
[0066]实施例2的刚果红显示培养基是采用如下方法制备:
[0067]将葡萄糖5g、酵母粉1.5，蛋白胨38，10^04 0.3g,MgSO4.7H20 0.1g^NH4NO3 0.4g，琼脂18g，刚果红0.1g放入容器中，加入IL的水，调pH至7.1，得到刚果红显示培养基。
[0068]实施例2的固体培养基包括以下各组分:相对于水用量为1.0L，还含有葡萄糖15g，酵母粉l.0g，蛋白胨3g，KH2P04 0.3g,MgSO4.7H20 0.1g,NH4NO30.4g，琼脂 18g;所述固体培养基的pH为7.0。
[0069]实施例2的低氮培养基包括以下各组分:相对于水用量为1.0L，还含有蔗糖40g，牛肉膏l.0g，硝酸钠0.3g，MgS04.7H20 0.1 g, KH2PO4 0.2g，微量元素溶液2mL，所述低氮发酵培养基的PH为7.2，其中所述微量元素溶液包括以下浓度的各成分:MnCl2.4H20 1.2g/L，FeSO4.7H20 2.0g/L，H3B03 0.20g/L,CuCl2 20mg/L,ZnCl2 15mg/L，CoCl2.6H2O 5.0mg/L，NaMoCU.2H2O 10mg/L。
[0070]实施例3
[0071 ] 一种产高粘性多糖的细菌的筛选方法，操作步骤基本同实施例1，只是具体参数略有不同，其中:
[0072]实施例3的刚果红显示培养基是采用如下方法制备:
[0073]将葡萄糖20g、酵母粉2.0，蛋白胨2g，KH2P040.6g,MgSO4.7H20 0.3g,NH4NO3
0.8g，琼脂20g，刚果红0.3g放入容器中，加入IL的水，调pH至7.2，得到刚果红显示培养基。
[0074]实施例3的固体培养基包括以下各组分:相对于水用量为1.0L，还含有葡萄糖20g，酵母粉2.0g，蛋白胨4g，KH2P04 0.6g,MgSO4.7H20 0.3g，NH4N030.5g，琼脂20g;所述固体培养基的pH为7.2。
[0075]实施例3的低氮培养基包括以下各组分:相对于水用量为1.0L，还含有蔗糖60g，牛肉膏2.0g，硝酸钠0.2g，MgS04.7H20 0.3g，KH2P04 0.7g，微量元素溶液3mL，所述低氮发酵培养基的PH为7.1，其中所述微量元素溶液包括以下浓度的各成分:MnCl2.4H20 1.5g/L，FeSO4.7H20 1.5g/L，H3B03 0.25g/L,CuCl2 40mg/L,ZnCl2 30mg/L,CoCl2.6H2O 8.0mg/L，NaMoCU.2H2O 30mg/L。
[0076]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1.一种产高粘性多糖的细菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)平板显色法筛获产多糖的细菌: 将细菌培养基与刚果红溶液混合后形成刚果红显示培养基，将所述刚果红显示培养基铺板，制成刚果红显色平板； 取分离纯化后的待筛细菌，将所述待筛细菌分别接种至所述刚果红显色平板上，20?37°C下静置培养24?48小时，观察菌落的颜色有无变深，若观察到菌落颜色变深，即为产多糖的细菌； (2)菌落拉丝法筛获产粘性多糖的细菌: 将步骤(I)筛获的细菌接种于固体培养基上，在20?37°C下培养24?48h，待形成一定大小的菌落后，用无菌牙签接触菌落并轻轻向外拉丝，观察能否形成连续拉丝，若能形成连续拉丝，则为产粘性多糖的细菌； (3)低氮发酵法筛获产高粘性多糖的细菌: 将步骤(2)筛获的细菌接种至低氮发酵培养基中，在温度为20?37°C、振摇速度为150?300r/min下进行振荡培养120-168h，持续监测发酵液的粘度变化趋势，若发酵液的粘度持续升高，则为产高粘性多糖的细菌，即获得目标细菌。2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，每IL所述低氮发酵培养基包括如下含量的各组分:蔗糖20?100g，牛肉膏0.1?2.(^，硝酸钠0?0.58，1^304.7H20 0.1?0.5g，KH2PO4 0.1?1.0g，含微量元素的溶液1.0?5.0mL，其余为蒸馏水，所述低氮发酵培养基的pH为7.0?7.2;其中，所述微量元素包括铜、锌和钴。3.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述微量元素还包括锰、铁、钼和硼中的一种或多种。4.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述含微量元素的溶液包括以下浓度的各成分:MnCl2.4H20 O ?2.0g/L，FeS04.7H20 O ?5.0g/L，H3B030?0.5g/L，CuCl2 10 ?50mg/L,ZnCl2 10?50mg/L，CoCl2.6H2O I?10mg/L，NaMo04.2H20 0?50mg/L。5.如权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述含微量元素的溶液包括以下浓度的各成分:MnCl2.4H20 1.0?2.0g/L，FeS04*7H20 I?4.0gA^H3BO30.I?0.4g/L，CuCl2 10?50mg/L，ZnCl2 10?50mg/L，CoCl2.6H2O I?10mg/L，NaMo04.2H2O 10?40mg/L。6.如权利要求2-4所述的筛选方法，其特征在于，每IL所述低氮发酵培养基包括如下含量的各组分:蔗糖50g，牛肉膏1.6g，硝酸钠0.4g,MgSO4.7H200.2g，KH2P04 0.5g，含微量元素的溶液2mL，其余为蒸馏水，所述低氮发酵培养基的pH为7.0;其中每IL所述含微量元素的溶液包括以下浓度的各成分= MnCl2.4H20 1.8g/L，FeS04.7H20 2.5g/L，H3B03 0.285g/L，CuCl2 27mg/L,ZnCl2 21mg/L，CoCl2.6H2O 7.4mg/L,NaMoO4.2H20 23mg/L，其余为蒸馏水。7.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(I)中，每IL所述刚果红显色培养基包括如下含量的各组分:葡萄糖2?20g，酵母粉0.5?5.(^，蛋白胨1.0?1(^，1?2?04 0.1?2.0g,MgSO4.7H20 0.1?0.5g，NH4N03 0.1?2.0g，琼脂 15?20g，刚果红:0.05?0.58，其余为蒸馏水;所述刚果红显色培养基的PH为7.0?7.2。8.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，每IL所述固体培养基包括如下含量的各组分:葡萄糖2?2(^，酵母粉0.5?5.(^，蛋白胨1.0?1(^，1(!12?04 0.1?2.0g，MgSO4.7H20 0.I?0.5g，NH4NO3 0.1?2.0g，琼脂15?20g，其余为蒸馏水;所述固体培养基的pH为7.0?7.2。9.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中还包括，测量连续拉丝的细菌菌落的拉丝长度，若拉丝长度在Icm以上时，则判断为产粘性多糖的细菌。10.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，当发酵液的粘度在发酵周期内持续升高，且发酵液的粘度在转速为30r/min剪切速率下能达到100m Pa.s以上，则判定筛获产高粘性多糖的细菌。
【文档编号】C12N1/20GK105907682SQ201610378514
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】刘陈立, 张炳照, 邵翅, 邓誉峰, 程传号
【申请人】深圳先进技术研究院