一种抗o型和a型口蹄疫病毒卵黄抗体的制备方法、产品及其用图
【专利摘要】本发明公开了一种抗O型和A型口蹄疫病毒卵黄抗体的制备方法、产品及其用途。本发明的抗体制备方法是：用含有口蹄疫病毒O型VP1蛋白和灭活后的A型口蹄疫全病毒抗原的疫苗免疫非免疫产蛋母鸡；收集免疫后的产蛋母鸡所产的鸡蛋，通过粗提及亲和纯化柱纯化后获得抗O型和A型口蹄疫病毒卵黄抗体。实验证明，由本发明方法制备得到的卵黄抗体能够与口蹄疫O型以及A型病毒抗原结合，此外，由本发明方法制备得到的卵黄抗体在室温下较稳定，可存放较长时间，对温度和pH的稳定性较好，而且制备方法简单，成本低，效价高。因此，本发明所建立的方法及其产品在FMDV的诊断及预防方面具有良好的应用前景。
【专利说明】
一种抗0型和A型口蹄疫病毒卵黄抗体的制备方法、产品及其 用途
技术领域
[0001] 本发明公开了一种抗0型和A型口蹄疫病毒卵黄抗体的制备方法，还公开了由该方 法获得的产品及其在检测〇型和A型口蹄疫病毒中的用途，本发明属于兽医学领域。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄类动 物共患的急性、热性、接触性传染病。世界动物卫生组织（Office International des EpiZ〇〇tieS，0IE)将其列为A类传染病之首。口蹄疫病毒为小核糖核酸病毒，血清型多变，迄 今为止，世界上已有0^、(：、341'1、34了2、34了3及48丨 &1共7个血清型和70多个血清亚型，口蹄 疫参考实验室（0IE/FA0 World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease， WRL for FMD)对疫情通报表明，近年来，0型口蹄疫的流行最为广泛(世界范围内），其次为A 型。目前口蹄疫的诊断检测技术主要有病毒分离技术、血清学检测技术和分子生物学技术 等。快速、准确的病原学诊断是控制口蹄疫疫情蔓延和追踪疫源的重要环节。它可使一线防 疫人员在疫情暴发时对现场做出正确的诊断，及时确定病原体、切断传播途径、采取有效防 范措施。因此随着口蹄疫检测技术的不断发展，抗口蹄疫病毒抗体的研究及挖掘将是FMD诊 断中必不可少的步骤。
[0003] 目前抗口蹄疫病毒抗体都是来自免疫哺乳动物途径制备的多抗和细胞工程途径 即用杂交瘤技术制备的单抗，而多抗则是抗体市场的主导，但制备的多抗其特异性、稳定性 不够理想。卵黄抗体(yolk antibody, IgY)是产蛋母鸡免疫细胞受到特异性抗原激活后，由 分化成熟的终末B细胞-浆细胞所合成与分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫 功能的球蛋白，是卵黄中唯一的免疫球蛋白，在检测和制作方面具有其独特的优势:第一， 生物学优势：IgY不激活补体，不与Fc受体和人类风湿因子(Rheumatoid Factor，RF)结合， 可与哺乳动物抗原上的更多表位发生反应，因此提高了检测的特异性和灵敏度;第二，制备 优势：IgY制备成本低、产率高、提纯简便快捷，并具有耐热、耐酸、稳定性好等优点；第三，由 于种系差别，哺乳动物中有些高度保守的蛋白质，在异种哺乳动物体内很难引起免疫应 答，而在禽类的鸡体内则易引起免疫应答，从而产生抗体;第四，经济价值:通常lml卵黄含 有3~25mgIgG。每个蛋可提供40~500mgIgG，可提取30~100份治疗用卵黄抗体，1只母鸡在 1月中生产蛋制备的卵黄抗体相当于500ml血清抗体，而且取材方便、成本低廉。因此作为一 种简便而又经济的制备抗体技术，卵黄抗体技术有望成为制备动物多克隆抗体的一种常规 的优良的替代技术，正深受越来越多研究者的重视，有进一步研究和推广的价值。因此本发 明进行口蹄疫卵黄抗体进行研制，主要目的是研究一种高特异性、高敏感性和高稳定性鸡 卵黄抗体作为诊断试剂，为提升我国口蹄疫防治水平提供新的技术手段。
【发明内容】
[0004] 针对当前养殖业特别是猪、牛等家畜口蹄疫病的不断暴发和流行，严重威胁畜牧 业的健康可持续发展和动物食品安全等问题，本发明提出了一种制备抗0型和A型口蹄疫病 毒卵黄抗体的方法，由该方法制备得到的卵黄抗体在口蹄疫病毒的检测和制作方面具有其 独特的优势，本发明的提出为提升我国口蹄疫防控水平提供新的技术手段。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用以下技术手段：
[0006] 为了制备出高含量、高纯度的抗0型和A型口蹄疫病毒卵黄抗体，本发明发明人首 先通过正交试验分析，确定了最佳的免疫策略，实验证明采用VP1蛋白+A型FMDV抗原作为免 疫原，2. Oml为免疫剂量，通过肌肉+皮下注射途径，每间隔20天加强免疫一次，共免疫三次， 可获得较高的IgY含量（12.45mg/ml)。然后，本发明发明人以（0.01M，pH = 7.4)PBS稀释倍 数、PEG-6000浓度、离心转速和离心时间作为考察因素，以卵黄中IgY含量作为评价指标，采 用L9(3 4)正交实验设计确定了最优的卵黄抗体的纯化方法，实验证明，采用6倍体积PBS缓 冲液稀释卵黄、8%PEG-6000沉淀和离心转速10000r/min离心20min，能获得较高含量的IgY (17.82mg/ml)。实验证明，由本发明方法制备得到的卵黄抗体能够与口蹄疫0型以及A型病 毒抗原特异性结合，此外，由本发明方法制备得到的卵黄抗体在室温下较稳定，可存放较长 时间，且对温度和pH的稳定性较好。
[0007] 在上述研究的基础上，本发明提出了一种抗口蹄疫病毒0型和A型卵黄抗体的制备 方法，其包括以下步骤：
[0008] (1)用含有口蹄疫病毒〇型VP1蛋白和灭活后的A型口蹄疫全病毒抗原的疫苗免疫 非免疫产蛋母鸡；
[0009] (2)收集免疫后的产蛋母鸡所产的鸡蛋；
[0010] (3)卵黄抗体的粗提
[0011] ①用75% (v/v)酒精浸泡鸡蛋5~lOmin，用清水冲洗，再用无菌纱布将鸡蛋擦干；
[0012] ②小心打破鸡蛋，分离蛋黄，然后将蛋黄置于灭菌的粗滤纸上，轻轻滚动，直至蛋 清被吸干；
[0013] ③用小针刺破蛋黄膜，放入离心管中，记录蛋黄重量；
[0014] ④采用6倍蛋黄体积的pH= 7.40，0.01M的PBS缓冲液稀释卵黄，加入PEG-6000使其 终浓度达到8% (w/w)进行沉淀，10000r/min离心20min，收集上清液，即卵黄水溶液，备用；
[0015] (4)卵黄抗体的纯化
[0016] ①琼脂糖活化：
[0017] ②蛋白偶联：将需偶联的FMDV 0型抗原和A型抗原混合物置于O.lmol/L pH值 7.8NaHC03液中透析2小时；将活化的琼脂糖迅速倒入FMDV抗原液中，4°C缓慢搅拌过夜，使 蛋白与活化的琼脂结合，得到偶联FMDV 0型抗原和A型抗原的琼脂糖；
[0018] ③装柱洗柱
[0019] 装柱:将已与FMDV抗原偶联的琼脂糖装入层析柱内，拧紧下口夹，让其下沉，5-8分 钟后松开下口夹，使溶液以lml/min的速度流出；
[0020] 洗柱：以pH为9.0,含O.lmol/L NaCl的0.2mol/L NaHC〇3溶液洗涤至洗出液的OD280 <0.02为止，得到亲和纯化柱，备用；
[0021] ④抗体的纯化
[0022] 平衡：用超纯水和pH 7.4,含1M NaCl的0.02M PBS缓冲液冲洗亲和纯化柱至紫外 检测器显示示数稳定；
[0023] 上样：向待纯化的卵黄水溶液中加入pH 7.4,含1M NaCl的0.02M PBS缓冲液，将稀 释后的卵黄水溶液加入亲和纯化柱中，流速为l〇〇ml/h;
[0024] 冲洗:上样结束后，用pH 7.4,含1M NaCl的0.02M PBS缓冲液冲洗亲和纯化柱至流 出液在紫外检测器显示示数稳定；
[0025]洗脱:使用pH3.5的0.1M梓檬酸缓冲液以1.0ml/min冲洗亲和纯化柱，收集第55~ 60min的洗脱液，即得抗口蹄疫病毒0型和A型卵黄抗体。
[0026]在本发明中，优选的，所述的口蹄疫病毒0型VP1蛋白是通过原核表达的方式获得 的，所述的A型口蹄疫全病毒抗原是通过悬浮培养的方式获得的。
[0027]在本发明中，优选的，所述的含有口蹄疫病毒0型VP1蛋白和灭活后的A型口蹄疫全 病毒抗原的疫苗是通过将〇型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原与灭活后的A型口蹄疫全病毒抗原混 合后加入佐剂乳化而成。
[0028]在本发明中，优选的，所述的0型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原的抗原含量为2ug/ml，所 述的A型口蹄疫全病毒抗原中有效抗原146S的含量为2ug/ml，0型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原 与A型口蹄疫病毒全抗原按照体积比1:1混合。
[0029] 在本发明中，优选的，所述的佐剂为MONTANIDE ISA MONTANIDE ISA 206佐剂，抗 原混合后和MONTANIDE ISA 206佐剂按照重量比为1:1进行混合，乳化成均质疫苗。
[0030] 在本发明中，优选的，采用口蹄疫病毒0型和A型疫苗免疫非免疫产蛋母鸡，免疫剂 量为2.0ml，通过肌肉+皮下注射途径，每间隔20天加强免疫一次，共免疫三次，可获得较高 含量的卵黄抗体。
[0031 ]在本发明中，优选的，所述的琼脂糖活化包括以下步骤：
[0032] 1)取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加0 · lmol/L pH 9 · ONaHC〇3液洗 涤，立即转入l〇〇ml烧杯中，冰浴并置于磁力搅拌器上；
[0033] 2)在通风橱内称取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入琼脂糖中，小心滴加2mol/L NaOH溶液，使pH值保持在10.5-11.5，反应10min，在1~2min迅速调整pH值为8.0~11.0维持 10min；
[0034] 3)将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的 0 · lmol/L pH值9 · 0的NaHC03溶液抽洗。
[0035] 进一步的，本发明还提出了由以上任一项所述的方法制备得到的抗口蹄疫病毒0 型和A型卵黄抗体。及所述的卵黄抗体在制备检测口蹄疫病毒0型和A型抗原中的用途。 [0036] 一种用于检测口蹄疫病毒0型和A型病毒感染的ELISA试剂盒，含有本发明所述的 卵黄抗体。
【附图说明】
[0037] 图1为0型FMDV VP1基因扩增结果；
[0038] M:核酸标准分子量;1 :PCR扩增的VP1基因；
[0039]图2为重组质粒VP1PCR鉴定结果；
[0040] M:核酸标准分子量;1 :PCR扩增的VP1基因；
[00411图3为重组质粒VP1酶切鉴定结果；
[0042] M:核酸标准分子量;l:BamH I和Sal I双酶切;2:BamH I单酶切；
[0043] 图4为原核表达质粒PET-30a( + )_VPlPCR鉴定结果；
[0044] M:核酸标准分子量;1 :PCR扩增的VP1基因；
[0045] 图5为原核表达质粒VP1酶切鉴定结果；
[0046] M:核酸标准分子量;l:BamH I单酶切；
[0047] 图6为原核表达质粒PET-30a( + )_VPl表达产物的Western blot分析；
[0048] Μ:蛋白质标准分子量;1:处理的上清液;2:处理的沉淀；
[0049]图7为卵黄抗体的洗脱曲线；
[0050]图8为卵黄抗体SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化结果；
[0051 ] 1:蛋白质标准分子量;2:卵黄抗体标准品；3:卵黄抗体样品；
[0052]图9为免疫过程中卵黄和血清中FMDV抗体效价变化趋势图。
[0053]图10为卵黄抗体(IgY)的室温保存试验图；
[0054]图11为卵黄抗体(IgY)的稳定性试验图；
[0055]图12为卵黄抗体(IgY)的pH试验图；
[0056]图13为卵黄抗体(IgY)的反复冻融试验图；
[0057]图14为利用本发明纯化的卵黄抗体建立的ELISA试剂盒(A)以及常规双抗夹心法 (B)检测抗原含量的结果。
【具体实施方式】
[0058]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0059] 实施例1 0型FMDV衣壳蛋白（VP1)的制备 [0060] 1、VP1基因扩增
[0061 ] 根据GenBank数据库中公布的0型FMDV基因序列，设计引物扩增VP1基因，由生工生 物工程(上海)有限公司合成，引物序列见表1。
[0062] 表1扩增VP1基因引物序列表
[0063]
[0064]以0型FMDV为模板，经PCR扩增及测序，获得与预期大小相符的目的片段，大小为 639bp，PCR结果见图1，经测序其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0065] 2、重组质粒的构建与鉴定
[0066] 2.1重组质粒的构建
[0067]回收DNA片段，按照pMDIS-T载体说明书，对VP1基因片段进行克隆，得到重组质粒 pMD18-T-VPl〇
[0068] 2.2重组质粒的鉴定
[0069] 以2.1节构建的重组质粒pMD18-T-VPl为模板，进行PCR扩增，获得的目的条带与预 期大小相符，结果见图2。分别用BamH I和Sal I双酶切和BamH I单酶切对重组质粒pMD18-T-VP1进行鉴定，获得与预期大小相符的结果。结果见图3 ^Pl基因测序结果与原始序列进 行比较，同源性为99.8%。
[0070] 3、原核表达载体的构建与鉴定
[0071] 3.1原核表达载体的构建
[0072] 用BamH I和Sal I限制性内切酶分别对2.1节构建的重组质粒pMD18-T-VPl和PET-30a( + )质粒进行双酶切。将凝胶回收后的VP1双酶切产物与PET-30a( + )载体片段连接。将16 °(：过夜连接的产物转化到E.coli DH5a，得到原核表达载体pET-30a( + )_VPl。
[0073] 3.2原核表达载体的鉴定
[0074]以提取的原核表达质粒pET-30a( + )_VPl为模板进行PCR扩增鉴定，获得的目的条 带与预期大小相符，结果见图4。
[0075]以BamH I对原核表达质粒pET-30a( + )_VPl进行单酶切，获得与预期结果相符的片 段，以BamH I和Sal I对原核表达质粒pET-30a( + )-VPl进行双酶切，获得约5.4kb和639bp大 小的片段，与预期结果相符。结果见图5。
[0076] 4、原核表达质粒的诱导表达
[0077]将含有阳性重组质粒PET-30a( + )_VPl的E.coli DH5a诱导培养后，采用超声波破 碎，离心收集沉淀和上清液，通过SDS-PAGE对表达的VP1蛋白进行Western blot分析，结果 见图6。通过比较超声处理的上清液和沉淀，沉淀中有目的蛋白明显表达的条带，分子量约 为23kDa，与预期大小相符，表明目的蛋白在包涵体中得到了有效表达。
[0078] 5、VP1蛋白的制备
[0079]将含有pET_30a(+ ) -VP1的E. co 1 i DH5a在LB液体培养基中扩大培养，按照质粒提 取试剂盒说明书提取质粒，超声破碎后提取备用。
[0080] 6、VP1蛋白的定量
[0081]用紫外分光光度计检测A28q和A26q波长下VP1蛋白、利用公式计算蛋白质浓度，蛋白 质浓度(mg/ml)=稀释倍数X (1.5 X A28Q - 0.75 X A26Q)，根据检测的蛋白质浓度进行定量。 [0082] 实施例2 A型FMDV的全抗原的制备
[0083] 1、细胞、培养基及毒种
[0084] BHK-21细胞批号为BHK-21/W/S-201201;培养基为低血清培养基MD611，购自清大 天一;MEM1611-030,委托宜兴赛尔公司加工;MEM，购自Hyclone公司。新生牛血清购自合格 供应商，按照中农威特生物科技股份有限公司新生牛血清内控质量标准检验合格后使用。 FMDV毒种Re-A/WH/09/BFl 3SF2悬浮细胞毒种由中农威特生物科技股份有限公司提供。
[0085] 2、BHK_21 细胞准备：
[0086] 复苏细胞1支，静置培养于T100细胞方瓶，传2~3代，待细胞生长到致密单层，用胰 蛋白酶消化，补加适量细胞培养液移至l〇〇〇ml三角瓶，37 °C恒温箱悬浮培养2~3代，细胞密 度达2.5 X 106个/ml以上，活率达92.0 %以上，转移至5L生物反应器培养，设定培养参数:温 度:36.5°C，pH值:7.15，搅拌转速:85r/min，D0:55.0 %，以上参数自动控制，每24小时取样 观察一次。当细胞密度大于2.5 X 106个/ml，活率大于92.0 %时停止培养，降温至4~8°C保 存备用。
[0087] 3、FMDV 的准备：
[0088] 排出5L生物反应器上清液，加入病毒维持液，按5.0 %病毒含量分别接种Re-A/WH/ 09/BF13SF2悬浮细胞毒，培养参数：温度：37.0°C，pH值：7.4，搅拌转速：65r/min，DO值： 65.0 %，进行自动控制，待溶氧变化率为零，细胞病变率大于90.0 %时，收获病毒液。
[0089] 4、FMDV抗原的准备：
[0090]分别向收获的病毒液加入灭活剂BEI，使其终浓度为0.002mol/L，30°C连续灭活 28h，灭活期间，每4h搅拌1次，每次30min，灭活结束后，迅速加入过滤除菌的50 %硫代硫酸 钠溶液，使其终浓度为2 %，充分混合，迅速降温置4~8 °C保存。
[0091] 5、FMDV抗原146S含量的检测：
[0092] 采用蔗糖密度梯度离心结合连续紫外检测来测定抗原中146S含量。
[0093]实施例3最佳免疫策略的建立
[0094] 1、免疫鸡群的选择
[0095] 对购自兰州正大有限公司7周龄非免疫产蛋母鸡100只，采用FMDV间接ELISA检测 试剂盒进行血清抗体检测，选择抗体滴度小于1:8的鸡共80只，进行后续试验。
[0096] 2、不同FMDV抗原的乳化
[0097]分别向含2ug/ml 0型口蹄疫病毒主要衣壳蛋白基因 VP1抗原（实施例1制备）、含 2ug/ml A型FMDV全抗原的抗原溶液(实施例2制备）以及二者按照体积比=1:1进行混合得 到的混合抗原溶液中，加入等重量的MONTANIDE ISA 206疫苗佐剂，10000r/min，在剪切机 中剪切3-5min，乳化成均质疫苗，用于免疫动物。
[0098] 3、免疫程序的确定
[0099] 将试验动物共分为9组，编号为1~9,每组6只，共54只。对照组6只，注射等量的roS 溶液。以不同FMDV抗原免疫7周龄非免疫产蛋母鸡，采用L9(34)正交实验设计，以免疫原、免 疫剂量、免疫途径和免疫间隔期作为考察因素，以卵黄中IgY含量作为评价指标，因子水平 表见表2。免疫三次后，提取和纯化卵黄抗体，用鸡(Chicken)卵黄抗体(IgY)ELISA检测试剂 盒，根据OD450?计算IgY含量，正交试验分析结果见表3。
[0100]表2影响免疫程序的因子水平表
[0101]
[0102] 表3免疫程序优化正交试验设计与结果分析表L9(34) 1
[0104]
[0105] 注:ΤΙ、T2和T3表示不同因素同一水平的均值
[0106] 通过正交试验分析，A3B1C3D2为最佳组合，即采用VP1蛋白+Α型FMDV抗原作为免疫 原，2.0ml为免疫剂量，通过肌肉+皮下注射途径，每间隔20天加强免疫一次，可获得较高的 IgY含量，可见通过对影响FMDV卵黄抗体的主要条件进行优化，可大幅度提高其含量。
[0107] 实施例4卵黄抗体的分离提纯方法的建立
[0108] 1、卵黄抗体纯化工艺的优化
[0109]收集第三轮免疫后鸡蛋，采用L9(34)正交实验设计确定最优纯化工艺，以PBS (0.01M，pH=7.40)稀释倍数、PEG-6000浓度、离心转速和离心时间作为考察因素，以卵黄中 IgY含量作为评价指标，因子水平表见表4。纯化工艺优化分析结果见表5。
[0110] 表4影响纯化工艺因子水平表
[0111]
[0113]表5纯化工艺优化正交试验设计与结果分析表L9(34)
[0114]
[0115] ΤΙ、T2和T3表示不同因素同一水平的均值。
[0116] 通过正交试验分析，A1B2C2D2为最佳组合，即采用6倍体积PBS缓冲液(0.01Μ，ρΗ = 7.40)稀释卵黄、8%PEG-6000沉淀和离心转速10000r/min离心20min，能获得较高的IgY，由 R值可知，在本研究中离心时间和纯化剂的浓度对该工艺的影响最大，为制备抗FMDV卵黄抗 体的最佳工艺的确定提供数据支持。
[0117] 2、纯化工艺确定
[0118] 2.1卵黄抗体的制备
[0119] (1)用75% (v/v)酒精浸泡鸡蛋5~lOmin，用清水冲洗，再用无菌纱布将鸡蛋擦干。
[0120] (2)小心打破鸡蛋，尽量分离蛋黄，然后将蛋黄置于灭菌的粗滤纸上，轻轻滚动，直 至蛋清被吸干。
[0121 ] (3)用小针刺破蛋黄膜，放入50ml离心管中，记录蛋黄量。
[0122] (4)采用6倍体积I?S(0·01M，pH = 7·40)缓冲液稀释卵黄，加入PEG-6000使其终浓 度达到8 % (w/w)进行沉淀，10000r/min离心20min，收集上清液，即卵黄水溶液，备用。
[0123] 2.2亲和层析柱纯化
[0124] 2.2.1亲和层析柱的制备
[0125] (1)琼脂糖活化
[0126] 1)取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的O.lmol/L pH 9.0NaHC03 液洗涤，立即转入l〇〇ml烧杯中，冰浴并置于磁力搅拌器上。
[0127] 2)在通风橱内称取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入琼脂糖中，小心滴加2mol/L NaOH，使pH值保持在11左右，反应lOmin。在1~2min迅速调整pH值为8.0~11.0维持1〇11^11。
[0128] 3)将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的 0 · lmol/L pH值9 · 0NaHC03抽洗。
[0129] (2)蛋白偶联
[0130] 1)事先将需偶联的FMDV 0型抗原和A型抗原混合物置于0.1mol/L pH值7.8NaHC03 液中透析2小时。
[0131 ] 2)将活化的琼脂糖迅速倒入FMDV抗原液中，4 °C缓慢搅拌过夜，使蛋白与活化的琼 脂结合。
[0132] (3)装柱洗柱
[0133] 1)装柱:将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内，拧紧下口夹，让其下沉，5-8分钟 后松开下口夹，使溶液约以lml/min的速度流出。
[0134] 2)洗柱：以0.2mol/L pH值9.0NaHC03(含0.1mol/L NaCl)洗涤至洗出液的OD280< 0.02为止，得到亲和纯化柱，备用。
[0135] 2.2.2抗体的纯化
[0136] 1)平衡：用超纯水和roS(0.02M，pH 7.4,含1M NaCl)缓冲液冲洗亲和纯化柱至紫 外检测器显示示数稳定(A280nm) 〇
[0137] 2)上样：向平衡好的柱子中加入经过2.1预处理后的待纯化的卵黄水溶液，流速为 100ml/h〇
[0138] 3)冲洗:上样结束后，用ros(0.02M，pH 7.4，含lMNaCl)缓冲液冲洗亲和纯化柱至 流出液在紫外检测器显示示数稳定(A280nm)。
[0139] 4)洗脱:使用梓檬酸(0.1Μ，ρΗ3.5)缓冲液以1.0ml/min冲洗亲和纯化柱使特异性 IgY洗脱，收集洗脱液并进行相关特性鉴定。
[0140] 3、纯化后抗体纯度鉴定
[0141] 将上述制备得到的卵黄抗体，收集第55~60min的洗脱液，如图7，结果表明，经亲 和纯化柱纯化后IgY的纯度接近标品，经凝胶扫描分析纯度>95%。进行SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳检测，由图8可知，IgY被SDS还原为两条重链和两条轻链，在电泳图中分别集中在60 ~66KDa条带和25~30KDa条带，其余杂带较少，可见采用该方法制备的卵黄抗体其纯化效 果良好。
[0142 ]实施例5卵黄抗体及血清抗体的检测(ELI SA法检测抗体）
[0143] 1、待检样品
[0144] 免疫后第0天、第20天、第40天、第60天以及第90天提取的卵黄抗体(实施例4方法 制备）、血清。
[0145] 2、方法
[0146] 采用口蹄疫0型液相阻断ELISA试剂盒和A型液相阻断ELISA试剂盒进行测定：
[0147] (1)样品稀释
[0148] 以50ul/孔的IX TOST在U型反应板上分别倍比稀释待检卵黄抗体、同期所采集的 血清以及阴阳性对照血清，然后按预先排好的加样次序，每孔加入l〇〇uL稀释后的卵黄抗 体，与卵黄抗体平行试验的另外板上加入l〇〇uL稀释后的同期所采集的血清。
[0149] (2)将口蹄疫0或A型病毒的抗原用1 X PBST稀释至工作浓度，以50ul每孔的量加入 到卵黄抗体、阴阳性对照血清的每一稀释孔内，4孔病毒抗原对照孔仅加入lOOul/控稀释至 工作浓度的病毒抗原。加入等量的病毒抗原后，待检抗稀释度加倍，被检抗体从1:16-1: 2048开始，由于预先做了 4倍稀释，则变为1:64-1:8192，封板震荡，37 °C温育90分钟。
[0150] (3)将抗原抗体的混合物从U型反应板上按次序移至已包被口蹄疫0或A型的兔抗 ELISA板上，50ul/孔，封板，37°C温育，60分钟。
[0151] (4)洗板3-5次，甩干，按50ul/孔加兔抗豚鼠 IgG-HRP工作液，封板，37 °C温育30分 钟。
[0152] (5)同上洗板3-5次，每孔加入50μ1底物溶液，37 °C温育15分钟，每孔加入50μ1终 止液终止反应，用酶标仪测定〇D49Qr?的值，进行数据处理。
[0153] 3、FMDV卵黄抗体及血清抗体效价比较
[0154] 图9为免疫过程中卵黄和血清中FMDV抗体效价变化趋势图。
[0155] 从图9可知，采用本发明方法获取的卵黄抗体，是FMDV的0型和A型抗体的混合物， 其二者的产生趋势基本一致，即免疫后20天即可在卵黄和血清中检测到FMDV抗体，随着加 强免疫次数增加，血清和卵黄样品中抗体效价明显升高，三免后20天后血清抗体和卵黄抗 体达到高峰，之后两者的效价基本保持平稳，并可以稳定一个月不下降，不仅说明抗体效价 高，而且说明所获得的抗体稳定，适合于快速诊断试剂盒的研制。
[0156] 实施例6卵黄抗体(实施例4方法制备)的理化特性验证
[0157] 1、室温保存试验
[0158]不同稀释倍数的卵黄抗体(IgY)存放于25°C下0.5~3个月，其吸光度0D45Qr?值变化 如图10所示，随着时间的延长和稀释倍数的增加，0D值略有下降，但波动不大，仍可保持较 高活性。表明卵黄抗体IgY在室温下较稳定，可存放较长时间。
[0159] 2、热稳定性试验
[0160]卵黄抗体（IgY)在不同温度下作用30min后，恢复至常温采用间接ELISA法测其吸 光度0D45Qnm值。如图11所示，IgY抗体在70 °C作用下30min活性大大下降，表明IgY对温度的稳 定性较好。
[0161] 该结果与文献中报道的一致。也意味着本发明制备得到的卵黄抗体可耐受食品工 业中常用的巴氏消毒法(62°C_65°C，30min)。用巴氏消毒法处理能在不影响抗体活性的情 况下消灭病原菌，为卵黄抗体IgY的深加工奠定了基础。
[0162] 3、pH 试验
[0163] 不同pH值对卵黄抗体(I gY)活性的影响如图12所示。当pH值在2~10时，I gY活性无 明显变化，当pH值10~12时呈下降趋势，当pH值< 2或pH值多12时，其活性明显下降。
[0164] 4、反复冻融试验
[0165] 将卵黄抗体（IgY)在_20°C与4°C之间反复冻融共五次，其吸光度值变化如图13所 示。随着冻融次数的增加，活性逐渐下降，但变化不大，说明若需长期保存，可少量分装放置 于-20°C中，避免反复冻融对IgY活性的影响。
[0166] 实施例7卵黄抗体试剂盒的应用试验
[0167] (1)包被:用包被缓冲液稀释制备的FMDV卵黄抗体I gY (实施例4方法制备)和0型和 A型兔抗血清至工作浓度(1:1000)，50μ1/孔，4°C过夜，包被酶标板；
[0168] (2)洗涤:甩干包被板，PBST洗涤液洗涤三次，5min/次。每次甩干后均在面巾纸上 拍干板孔中残留的液体；
[0169] (3)封闭：加封闭液封闭，100μΙ/孔，37°C湿盒温育lh。再甩干，洗涤同（2);
[0170] (4)加样:在ELISA板上按50ul/孔量用TOST将标准抗原和检测样品从1:2-1:256进 行稀释，封板，37°C温育lh，洗涤同（2);
[0171] (5)用豚鼠抗血清稀释液将豚鼠抗0型口蹄疫病毒血清稀释至工作浓度（1:1000)， 50μ1/孔，封板，37°C温育30min，洗涤同（2);
[0172] (6)用TOST将兔抗豚鼠酶结合物稀释至工作浓度（1:500)，5(^1/孔，封板，37°(：湿 盒温育lh，洗涤同（2);
[0173] (7)加底物:50μ1/孔，37°C 避光反应 lOmin;
[0174] (8)终止:加 2M硫酸终止反应，100μΙ/孔；
[0175] (9)检测:酶标仪测定波长490nm处的吸光度值即OD49〇_
[0176] 由图14可见，利用本发明纯化的卵黄抗体建立的ELISA试剂盒(A)，其检测含量和 国内双抗夹心法(B)差异不明显，可见该抗体具有一定的应用前景。
【主权项】
1. 一种抗口蹄疫病毒O型和A型卵黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 用含有口蹄疫病毒〇型VPl蛋白和灭活后的A型口蹄疫全病毒抗原的疫苗免疫非免 疫产蛋母鸡； (2) 收集免疫后的产蛋母鸡所产的鸡蛋； (3) 卵黄抗体的粗提 ① 用75 % (v/v)酒精浸泡鸡蛋5~IOmin，用清水冲洗，再用无菌纱布将鸡蛋擦干； ② 小心打破鸡蛋，分离蛋黄，然后将蛋黄置于灭菌的粗滤纸上，轻轻滚动，直至蛋清被 吸干； ③ 用小针刺破蛋黄膜，放入离心管中，记录蛋黄重量； ④ 采用6倍蛋黄体积的pH= 7.40，0.0IM的PBS缓冲液稀释卵黄，加入PEG-6000使其终浓 度达到8 % (w/w)进行沉淀，10000r/min离心20min，收集上清液，即卵黄水溶液，备用； (4) 卵黄抗体的纯化 ① 琼脂糖活化： ② 蛋白偶联:将需偶联的FMDV 0型抗原和A型抗原混合物置于0. lmol/L pH值7.8NaHC03 液中透析2小时;将活化的琼脂糖迅速倒入FMDV抗原液中，4°C缓慢搅拌过夜，使蛋白与活化 的琼脂结合，得到偶联FMDV 0型抗原和A型抗原的琼脂糖； ③ 装柱洗柱 装柱:将已与FMDV抗原偶联的琼脂糖装入层析柱内，拧紧下口夹，让其下沉，5-8分钟后 松开下口夹，使溶液以lml/min的速度流出； 洗柱：以pH为9.0,含0· lmol/L NaCl的0.2mol/L NaHCO3溶液洗涤至洗出液的OD280< 0.02为止，得到亲和纯化柱，备用； ④ 抗体的纯化 平衡：用超纯水和pH 7.4,含IM NaCl的0.02M PBS缓冲液冲洗亲和纯化柱至紫外检测 器显示示数稳定； 上样：向待纯化的卵黄水溶液中加入pH 7.4,含IM NaCl的0.02M PBS缓冲液，将稀释后 的卵黄水溶液加入亲和纯化柱中，流速为l〇〇ml/h; 冲洗:上样结束后，用pH 7.4,含IM NaCl的0.02M PBS缓冲液冲洗亲和纯化柱至流出液 在紫外检测器显示示数稳定； 洗脱:使用PH3.5的0.1 M梓檬酸缓冲液以1.0 ml/min冲洗亲和纯化柱，收集第55~60min 的洗脱液，即得抗口蹄疫病毒0型和A型卵黄抗体。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的口蹄疫病毒0型VPl蛋白是通过原核表 达的方式获得的，所述的A型口蹄疫全病毒抗原是通过悬浮培养的方式获得的。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的含有口蹄疫病毒0型VPl蛋白和灭活后 的A型口蹄疫全病毒抗原的疫苗是通过将0型口蹄疫病毒VPl蛋白抗原与灭活后的A型口蹄 疫全病毒抗原混合后加入佐剂乳化而成。4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的0型口蹄疫病毒VPl蛋白抗原的抗原含 量为2ug/ml，所述的A型口蹄疫全病毒抗原中有效抗原146S的含量为2ug/ml，0型口蹄疫病 毒VPl蛋白抗原与A型口蹄疫病毒全抗原按照体积比1:1混合。5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的佐剂为M0NTANIDE ISA M0NTANIDE ISA 206佐剂，抗原混合后和MONTANIDE ISA 206佐剂按照重量比为1:1进行混合，乳化成均质疫 苗。6. 如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于采用口蹄疫病毒0型和A型疫苗免疫 非免疫产蛋母鸡，免疫剂量为2. Oml，通过肌肉+皮下注射途径，每间隔20天加强免疫一次， 共免疫三次，可获得较高含量的卵黄抗体。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的琼脂糖活化包括以下步骤： 1) 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加0.1mol/L pH 9.0NaHC〇3液洗涤，立即 转入100mL烧杯中，冰浴并置于磁力搅拌器上； 2) 在通风橱内称取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入琼脂糖中，小心滴加2mol/L NaOH溶液，使pH值保持在10.5-11.5，反应10min，在1~2min迅速调整pH值为8.0~11.0维持 IOmin； 3) 将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的 0 · lmol/L pH值9 · 0的NaHCO3溶液抽洗。8. 由权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的抗口蹄疫病毒0型和A型卵黄抗体。9. 权利要求8所述的卵黄抗体在制备检测口蹄疫病毒0型和A型抗原试剂中的用途。10. -种用于检测口蹄疫病毒〇型和A型病毒感染的ELISA试剂盒，其特征在于所述的试 剂盒中含有权利要求8所述的卵黄抗体。
【文档编号】C07K16/10GK105906711SQ201610284581
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月3日
【发明人】安芳兰, 刘学荣, 武发菊, 董文教, 武永淑, 杨惠清
【申请人】中农威特生物科技股份有限公司