基孔肯亚病毒特异性检测抗原及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种基孔肯亚病毒特异性检测抗原及其应用。本发明所提供的基孔肯亚病毒特异性检测抗原为如下任一所示多肽：(a1)序列1或序列1的第166?378位所示的多肽；(a2)序列2或序列2的第166?392位所示的多肽；(a3)将以上任一限定的多肽的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且功能相同的多肽。本发明所提供的基孔肯亚病毒特异性检测抗原在检测基孔肯亚病毒血清感染中具有较高的特异性和灵敏度。
【专利说明】
基孔肯亚病毒特异性检测抗原及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于病毒检测领域，涉及一种基孔肯亚病毒特异性检测抗原及其应用。
【背景技术】
[0002] 基孔肯亚病是由基孔肯亚病毒引起的人与动物共患病。患者表现为骤起高热关节 剧烈疼痛，导致身体弯曲呈蜷缩状，并伴皮疹，该病主要通过蚊虫叮咬而传播，2010年，该病 在我国广东引起过爆发流行。
[0003] 该病毒属于皮膜病毒科甲病毒属，病毒有两种结构蛋白，膜蛋白E和核心蛋白C，E 蛋白有E1、E2及E3，E3是膜外连接E1、E2共同构成病毒颗粒的外膜凸起。
[0004] 对于该病的临床诊断，流行病学调查可提供重要线索，根据患者的临床症状可确 定疑似病例。病毒感染的确诊可通过从患者血液和标本中分离到病毒、血清学方法检测到 特异性抗体，及分子生物学方法检测到特异核酸。目前血清学方法，主要是利用灭活的病毒 培养物作为检测抗原进行特异性抗体检测，体外表达抗原可简化抗原制备流程并提高检测 特异性，目前国内尚没有简便的商品化试剂盒可用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种基孔肯亚病毒特异性检测抗原及其应用。
[0006] 本发明所提供的基孔肯亚病毒特异性检测抗原具体可为如下任一所示多肽：
[0007] (al)氨基酸序列如序列表中序列1的第166-378位所示的多肽；
[0008] (a2)氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽；
[0009] (a3)氨基酸序列如序列表中序列2的第166-392位所示的多肽；
[0010] (a4)氨基酸序列如序列表中序列2所示的多肽；
[0011] (a5)将(al)_(a4)中任一限定的多肽的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的 取代和/或缺失和/或添加，且功能相同的多肽。
[0012] 其中，（a2)、（a4)所示多肽为分别在(al)和(a3)所示多肽上连接了6个His标签后 形成的多肽。当然，为了便于上述(al)和(a3)所示多肽的纯化，也可在其N端或C端连接上如 下表所示的标签。
[0013] 表:标签的序列
[0014]
[0015]
[0016] 编码所述多肽的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0017] 所述核酸分子可以是DNA，如CDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。
[0018] 在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因，所述基 因是如下任一所述的DNA分子：
[0019] (bl)编码序列如序列表中序列3的第496-1134位所示的DNA分子；
[0020] (b2)编码序列如序列表中序列3所示的DNA分子；
[0021] (b3)编码序列如序列表中序列4的第496-1176位所示的DNA分子；
[0022] (b4)编码序列如序列表中序列4所示的DNA分子；
[0023] (b5)在严格条件下与(bl)-(b4)中任一限定的DNA分子杂交且编码所述多肽的DNA 分子；
[0024] (b6)与（bl)-(b5)中任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述多肽的 DNA分子。
[0025] 含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的 保护范围。
[0026] 所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0027] 在本发明中，所述重组载体中启动所述多肽的编码基因转录的启动子具体为T7启 动子。更加具体的，所述重组载体具体为将所述多肽的编码基因插入到pET32a( + )载体的酶 切位点BamHI和Hindll I之间后得到的重组载体。
[0028] 所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组 成。
[0029] 所述多肽或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如 下(a)或(b)中的应用也属于本发明的保护范围：
[0030] (a)制备用于检测或辅助检测抗基孔肯亚病毒抗体的试剂盒；
[0031] (b)检测或辅助检测抗基孔肯亚病毒抗体。
[0032] 所述多肽或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如 下(c)或(d)中的应用也属于本发明的保护范围：
[0033] (c)制备用于检测或辅助检测待测动物是否感染基孔肯亚病毒的试剂盒；
[0034] (d)检测或辅助检测待测动物是否感染基孔肯亚病毒。
[0035]含有所述多肽或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌， 且具有(1)和/或(2)的功能的试剂盒也属于本发明的保护范围：
[0036] (1)检测或辅助检测抗基孔肯亚病毒抗体；
[0037] (2)检测或辅助检测待测动物是否感染基孔肯亚病毒。
[0038] 在本发明中，所述抗基孔肯亚病毒抗体为能够抗所述多肽的抗体;所述抗基孔肯 亚病毒抗体可为来自于待测动物的能够抗基孔肯亚病毒的抗血清。
[0039] 在本发明的实施例中，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒，其中的包被原为所述多肽。 根据需要，所述试剂盒中还可含有酶标抗体、包被液、封闭液、洗涤液、显色液、和/或终止 液;所述酶标抗体为抗待测动物IgG的抗体;所述待测动物可为人或小鼠等哺乳动物。
[0040] 所述多肽或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在作 为免疫原制备抗基孔肯亚病毒的抗体中的应用，以及在制备用于治疗和/或预防基孔肯亚 病毒引起的疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0041]本发明通过对基孔肯亚病毒的E蛋白进行分析，将其分为3个不同的抗原片段进行 分段表达。然后利用ELISA方法评价了抗原的特异性和灵敏性，结果表明序列1和序列2所示 的E2-1和E1-1这2个重组抗原均可作为基孔肯亚病毒感染的诊断抗原，其中E2-1具有更高 的特异性。
【附图说明】
[0042] 图1为基孔肯亚病毒3个抗原基因的PCR扩增结果图谱。1-4:CHIKV El-UCHIKV E 1-2、CHIKV E2-1、DNA Marker。
[0043]图2为基孔肯亚病毒特异性检测抗原的表达结果(SDS-PAGEhl:蛋白marker;2:空 载体诱导表达上清液;3:空载体诱导表达包涵体;4: CHIKV E1-1诱导表达上清液;5: CHIKV E1-1诱导表达包涵体，大小约为44KD;6:CHIKV E2-1诱导表达上清液;7:CHIKV E2-1诱导表 达包涵体，大小约为42KD; 8: CHIKV E1-2诱导表达上清液;9: CHIKV E1-2诱导表达包涵体， 大小约为45KD。
[0044]图3为基孔肯亚病毒特异性检测抗原的纯化结果(SDS-PAGE)。1:蛋白marker; 2:纯 化后的CHIKV E1-1蛋白；3:纯化后的CHIKV E2-1蛋白；4:纯化后的CHIKV E1-2蛋白。
[0045]图4为基孔肯亚病毒特异性检测抗原的效果检测结果。其中，A为E1-1和E2-1对1: 200稀释的血清检测结果;B为E1-1和E2-1对1:1000稀释的血清检测结果。
【具体实施方式】
[0046] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0047] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0048] pET32a( + )载体：为 Promega 公司产品。
[0049] 大肠杆菌BL21(DE3):为康为世纪生物科技有限公司产品。
[0050]基孔肯亚病毒S27株（简称CHIKV-S27):记载于"Yi-Jung Ho，Yu_Ming Wang，Jeng-wei Lu,Tzong-Yuan ffu,Liang-In Lin，Szu-Cheng Kuo，Chang-Chi Lin , Suramin Inhibits Chikungunya Virus Entry and Transmission，PLOS 0NE，2015,JULY，24"一文， 公众在符合生物安全相关规定的情况下，可从
【申请人】处获得，仅用于重复本发明实验使用。 [0051] BHK21 细胞:ATCC产品，编号为ATCC CCL-10。
[0052]实施例1、基孔肯亚病毒特异性检测抗原的制备 [0053] 一、基孔肯亚病毒重组蛋白序列信息
[0054]根据基孔肯亚病毒E蛋白的结构特点，将E1和E2分为不同的抗原片段进行分段表 达，并设计了特异的扩增引物。片段长度、引物序列及酶切位点信息如表1所示。
[0055]表1 3个不同的抗原片段的片段长度、引物序列及酶切位点信息
[0056]
[0057] 注:表中上游引物中下划线部分为酶切位点BamHI的识别序列；下游引物中下划线 部分为酶切位点Hindll I的识别序列。
[0058] 二、重组表达载体的构建
[0059] 使用Invitrogen公司的RNA提取试剂盒提取基孔肯亚病毒S27株的RNA，使用 TaKaRa公司的一步法试剂盒(产品目录号为DRR057A)对目的基因（即表1中的各抗原片段） 进行PCR扩增;使用DNA凝胶回收试剂盒对扩增产物进行回收。其中，扩增各抗原基因片段的 引物序列如表1所示。
[0060] 3个抗原基因的PCR扩增结果图谱如图1所示。由图可见，扩增得到了3个与预期大 小一致的目的条带(抗原基因片段E2-1为639bp;抗原基因片段E1-1为681bp;抗原基因片段 E1-2为717bp)。
[0061 ] 分别利用限制性内切酶BamHI和Hindll I双酶切如上PCR扩增得到的4个DNA片段， 回收酶切产物，分别与经过同样双酶切的pET32a( + )载体骨架大片段相连，得到重组质粒。 [0062] 将经测序表明将pET3 2a ( + )载体的酶切位点BamHI和Hind III之间的小片段替换为 序列表中序列3的第496-1134位所示DNA片段的重组质粒命名为pET32a-E2-l。
[0063] 将经测序表明将pET3 2a ( + )载体的酶切位点BamHI和Hind III之间的小片段替换为 序列表中序列4的第496-1176位所示DNA片段的重组质粒命名为pET32a-El-l。
[0064] 将经测序表明将pET3 2a ( + )载体的酶切位点BamHI和Hind III之间的小片段替换为 序列表中序列6的第496-1212位所示DNA片段的重组质粒命名为pET32a-El-2。
[0065]重组表达载体pET32a-E2_l可表达序列表中序列1所示的蛋白质，其中序列1的第 166-378位为来自于基孔肯亚病毒S27株的E2-1抗原片段，含有6His标签的序列来自于 pET32a( + )载体，是为了便于抗原片段的纯化。
[0066]重组表达载体pET32a-El-l可表达序列表中序列2所示的蛋白质，其中序列2的第 166-392位为来自于基孔肯亚病毒S27株的E1-1抗原片段，含有6His标签的序列来自于 pET32a( + )载体，是为了便于抗原片段的纯化。
[0067] 重组表达载体pET32a-El_2可表达序列表中序列5所示的蛋白质，其中序列5的第 166-404位为来自于基孔肯亚病毒S27株的E1-2抗原片段，含有6His标签的序列来自于 pET32a( + )载体，是为了便于抗原片段的纯化。
[0068] 三、重组蛋白的表达
[0069]将步骤二构建的3个重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，取阳性菌种在Amp抗 性的平板上划线，37°C过夜培养，挑取单克隆在37°C下过夜摇菌，取50μ1过夜摇的菌液加入 至Ij5ml新鲜Amp抗性LB培养基中，37 °C下摇4h左右至对数生长前期(0D6QQ = 0.6-0.8)，加入终 浓度为lmmol的IPTG，在30°C下诱导12h。取出lml菌液加入到EP管中，12000rpm离心lmin，弃 掉上清。用600μ1的PBS重悬沉淀，超声裂菌（Time: 24s Paulse:起3s停3s)，12000rpm离心 lmin。取100μΙ上清(可溶性蛋白）加入到另一个干净的EP管中，弃掉剩余500μ1上清，用100μ 1的PBS重悬沉淀(包涵体蛋白），进行SDS-PAGE电泳鉴定。
[0070] 实验同时设置以pET32a( + )载体替代重组质粒的空载对照。
[0071] 结果如图2所示，分别以空载体诱导表达的上清和包涵体作为对照，比较分析3个 重组蛋白的表达情况，在3个基孔肯亚病毒的重组表达产物中，上清中均未看到明显的表达 蛋白条带，而在包涵体中，在40KD附近，均可看到明显条带，说明重组蛋白为包涵体表达。基 孔肯亚病毒的3个蛋白均为包涵体表达。
[0072]四、重组蛋白的纯化
[0073]将步骤二构建的3个重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，取阳性菌种在氨苄青 霉素(Amp)抗性的平板上划线，37°C过夜培养，挑取单克隆在37°C下过夜摇菌，取10ml过夜 摇的菌，分别加入4瓶各含250ml新鲜Kana抗性LB培养基中，37°C下摇4h左右至对数生长前 期(0D_ = 0.6-0.8)，加入终浓度为lmmol的IPTG，在30°C下诱导12h，经过离心、重悬、超声 等步骤后，加入包涵体溶解液(康为试剂，CW0893)，再次离心取包涵体溶解的上清液，采用 康为世纪公司的Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒，用Binding Buffer将菌体上清液等 倍稀释后负载上柱，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液。使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白。使用Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。对洗脱峰进行蛋白 浓度的测定，然后将蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋置于PBS中，4°C过夜，期间换34次PBS 溶液，最后取出部分蛋白进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后将胶块用考马斯R-25溶液室温染 色3~4h后，用脱色液脱色2~3次，拍照分析。
[0074] 结果如图3所示，可见蛋白E1-1(泳道2)和蛋白E2-l(泳道3)在目的位置(43KD左 右)的条带为清晰的单一条带，尽管在其他位置有微弱杂带，但与目的条带相比，量很小。说 明通过蛋白纯化，获得了纯度较高的E1-1和E2-1的纯化蛋白。但蛋白El-2(泳道4)的条带不 明显，说明未从表达产物中纯化出蛋白E1-2。纯化后获得的2种重组蛋白E1-1和E2-1即为候 选的基孔肯亚病毒特异性检测抗原。
[0075]实施例2、基孔肯亚病毒特异性检测抗原的效果检测
[0076]分别以实施例1制备的2个不同的基孔肯亚病毒E蛋白片段(E2-1和E1-1)作为检测 抗原，收集2份临床乙型脑炎病人(JEV)感染血清、2份森林脑炎(TBEV)病人感染血清样本、2 份登革(DV)病人感染血清、5份正常人血清样本，12份基孔肯亚病毒(CHIK)感染血清（以上 血清均为临床确诊的病人血清，正常人血清来自解放军307医院，乙型脑炎病人血清和森林 脑炎人血清来自新疆军区CDC，基孔肯亚病人血清和登革病人血清来自广州第八人民医 院），进行ELISA检测，用于评价各重组抗原的检测特异性与敏感性。操作步骤如下：
[0077] (1)将实施例1制备的2个基孔肯亚病毒抗原E2-1和E1-1分别稀释为5μg/ml，100y 1/孔包被ELISA微孔板，4°C过夜。其中，包被液为0.1M的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液，pH9.6。 [0078] (2)用洗涤液(配方:含体积百分含量为0.5%。的Tween-20的磷酸盐缓冲液，简称 PBST洗液)洗涤一遍，然后用封闭液(配方:含3 % (3g/100ml)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲 液)封闭，37°C封闭lh。
[0079] (3)血清样本进行系列稀释（1: 200和1:1000)后，100μΙ/孔，加入检测孔中，进行 ELISA检测（加样顺序如表2所示）。37°C震荡孵育lh，使抗体与抗原充分结合后，PBST洗涤3 次。
[0080] (4)加入HRP标记的羊抗人IgG(效价1:2000，康为世纪公司产品），10(^1/孔，37 1€ 震荡孵育30min，然后用PBST洗液洗涤3次，洗去未结合的抗体。
[0081 ] (5)加入TMB底物显色液(天根公司产品，其产品目录号为ΡΑ107-01)，100μ1/孔，室 温下避光放置5-20min，然后加入终止液(2Μ H2S〇4)，利用酶联检测仪测450nm处的吸光值， 根据0D450值进行结果判断。实验设置3次重复，结果取均值。
[0082]以正常人血清的平均值加上3倍的标准差作为cutoff值，高于cutoff值的样本视 为感染基孔肯亚病毒的阳性样本，低于等于cutoff值的样本视为感染基孔肯亚病毒的阴性 样本。
[0083]结果如表2和图4所示，2个重组抗原与健康人血清、乙型脑炎、蜱传脑炎及登革病 毒阳性血清均未出现明显的交叉反应。以5份健康人血清作为阴性对照，计算E1-1抗原检测 的Cutoff值为0.36，E2-1抗原的Cutoff值为0.39，高于Cutoff值的样本视为阳性样本。对12 份基孔肯亚病毒阳性血清1:200进行稀释，E1-1和E2-1的阳性检出率分别为11/12和12/12。 对12份基孔肯亚病毒阳性血清进行1:1000稀释，E1-1和E2-1的阳性检出率分别为10/12和 11/12。表明E1-1和E2-1可以用于检测基孔肯亚病毒感染血清，且两种抗原相比，E2-1具有 更高的检测灵敏性，可作为基孔肯亚病毒感染的候选抗原。
[0084]表2基孔肯亚病毒特异性检测抗原的效果检测
[0085]
【主权项】
1. 多肽，为如下任一： (al)氨基酸序列如序列表中序列1的第166-378位所示的多肽； (a2)氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽； (a3)氨基酸序列如序列表中序列2的第166-392位所示的多肽； (a4)氨基酸序列如序列表中序列2所示的多肽； (a5)将(al)_(a4)中任一限定的多肽的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代 和/或缺失和/或添加，且功能相同的多肽。2. 编码权利要求1所述多肽的核酸分子。3. 根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于:所述核酸分子是编码权利要求1所述 多肽的基因；所述基因是如下任一所述的DNA分子： (bl)编码序列如序列表中序列3的第496-1134位所示的DNA分子； (b2)编码序列如序列表中序列3所示的DNA分子； (b3)编码序列如序列表中序列4的第496-1176位所示的DNA分子； (b4)编码序列如序列表中序列4所示的DNA分子； (b5)在严格条件下与(bl)-(b4)中任一限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述多肽 的DNA分子； (b6)与(bl)-(b5)中任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码权利要求1所述多 肽的DNA分子。4. 含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5. 权利要求1所述的多肽或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的重组载 体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下(a)或(b)中的应用： (a) 制备用于检测或辅助检测抗基孔肯亚病毒抗体的试剂盒； (b) 检测或辅助检测抗基孔肯亚病毒抗体。6. 权利要求1所述的多肽或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的重组载 体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下(c)或(d)中的应用： (c) 制备用于检测或辅助检测待测动物是否感染基孔肯亚病毒的试剂盒； (d) 检测或辅助检测待测动物是否感染基孔肯亚病毒。7. 试剂盒，含有权利要求1所述的多肽或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所 述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌； 所述试剂盒具有（1)和/或(2)的功能： (1) 检测或辅助检测抗基孔肯亚病毒抗体； (2) 检测或辅助检测待测动物是否感染基孔肯亚病毒。8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒为酶联免疫试剂盒，其中的 包被原为权利要求1所述的多肽。9. 权利要求1所述的多肽或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的重组载 体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在作为免疫原制备抗基孔肯亚病毒的抗体中的应用。10. 权利要求1所述的多肽或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的重组载 体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备用于治疗和/或预防基孔肯亚病毒引起的疾病的 产品中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK105906694SQ201610294462
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月5日
【发明人】康晓平, 杨银辉, 吴晓燕, 李裕昌, 姜涛, 李靖, 户义, 冉鑫, 贾佳
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所