诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方法
【专利摘要】本发明公开了诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方法、外胚层祖细胞、外胚层祖细胞在制备药物中的用途、诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的培养基、试剂盒及试剂盒在诱导干细胞分化成外胚层祖细胞中的用途。所述诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方法包括：在抑制干细胞合成前列腺素E2的条件下，对所述干细胞进行诱导培养。由此，本发明的诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方法能够有效地诱导干细胞分化成外胚层祖细胞，且诱导效率高。
【专利说明】
诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医学领域。具体地，本发明涉及诱导干细胞分化成外胚层祖细胞 的方法。更具体地，本发明涉及诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方法、外胚层祖细胞、外 胚层祖细胞在制备药物中的用途、诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的培养基、试剂盒及试 剂盒在诱导干细胞分化成外胚层祖细胞中的用途。
【背景技术】
[0002] 干细胞(Stem Cell)是一类具有自我更新、高度增殖能力及多向分化潜能的细胞， 是机体内各种组织器官发育及功能维持的种子细胞来源。目前已知干细胞向神经细胞分化 过程基本模拟神经细胞在体内发育的各个时期，即外胚层祖细胞阶段、神经干细胞阶段，并 最终分化为神经元和胶质细胞等多种类型的成熟神经细胞。因此，诱导干细胞高效分化为 外胚层祖细胞是提高干细胞向成熟神经细胞分化效率的关键环节。
[0003] 然而，目前诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方法仍有待进一步研究。
【发明内容】
[0004] 本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0005] 目前由干细胞诱导分化为神经元的诱导方案存在诱导效率低、分化调控机制不 清、诱导细胞体内功能性不完善的缺陷，给该技术的临床应用前景蒙上了阴影。
[0006] 发明人惊奇地发现，在干细胞早期分化命运决定过程中，前列腺素 E2发挥关键的 调控作用。在诱导体系中，通过抑制干细胞合成前列腺素 E2，能够促进干细胞向外胚层祖细 胞分化，并促进外胚层祖细胞的形成。
[0007] 进而，在本发明的第一方面，本发明提出了一种诱导干细胞分化成外胚层祖细胞 的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括:在抑制干细胞合成前列腺素 E2的条件下，对 所述干细胞进行诱导培养。由此，能够有效地诱导干细胞分化成外胚层祖细胞，且诱导效率 尚。
[0008] 在本发明的第二方面，本发明提出了一种外胚层祖细胞。根据本发明的实施例，所 述外胚层祖细胞是由前面所描述的诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方法得到的。由此， 根据本发明实施例的外胚层祖细胞诱导分化效率高，并具有较强的分化为神经干细胞的潜 力。
[0009] 在本发明的第三方面，本发明提出一种前面所描述的外胚层祖细胞在制备药物中 的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗中枢神经系统退行性疾病。由此，根据本 发明实施例的外胚层祖细胞在制备药物中的用途具有极佳的应用前景。
[0010] 在本发明的第四方面，本发明提出了一种诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的培养 基。根据本发明的实施例，所述培养基包括:基础培养基，以及前列腺素 E2合成抑制剂。由 此，利用根据本发明实施例的培养基能够有效地诱导干细胞分化成外胚层祖细胞，且诱导 效率高。
[0011] 在本发明的第五方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂 盒包括前列腺素 E2合成抑制剂。由此，利用根据本发明实施例的试剂盒能够有效地诱导干 细胞分化成外胚层祖细胞，且诱导效率高。
[0012] 在本发明的第六方面，本发明提出了一种试剂盒在诱导干细胞分化成外胚层祖细 胞中的用途。由此，能够有效地诱导干细胞分化成外胚层祖细胞，且诱导效率高。
[0013] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0014] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得 明显和容易理解，其中：
[0015]图1显示了根据本发明一个实施例的基因表达分析图；以及
[0016] 图2显示了根据本发明一个实施例的细胞表面标志蛋白表达分析统计图。
【具体实施方式】
[0017] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发 明，而不能理解为对本发明的限制。
[0018] 需要说明的是，术语"第一"、"第二"仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相 对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有"第一"、"第二"的特征可以 明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
[0019] 本发明提出了诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方法、外胚层祖细胞、外胚层祖 细胞在制备药物中的用途、诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的培养基、试剂盒及试剂盒在 诱导干细胞分化成外胚层祖细胞中的用途，下面将分别对其进行详细描述。
[0020] 诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方法
[0021] 在本发明的第一方面，本发明提出了一种诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方 法。根据本发明的实施例，所述方法包括:在抑制干细胞合成前列腺素 E2的条件下，对干细 胞进行诱导培养。在干细胞的正常分化过程中，可以分化成外胚层祖细胞、内胚层祖细胞及 中胚层祖细胞。发明人惊奇地发现，通过抑制前列腺素 E2的合成，能够有效地诱导干细胞定 向分化成外胚层祖细胞，进而向成熟的神经细胞分化，且诱导效率高。
[0022] 根据本发明的实施例，上述诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方法还可以具有下 列附加技术特征：
[0023] 根据本发明的实施例，诱导培养采用诱导培养基，并且诱导培养基包括:基础培养 基，以及前列腺素 E2合成抑制剂。发明人发现，在诱导培养过程中，基础培养基能够使干细 胞进行生长及分化，前列腺素 E2合成抑制剂将抑制前列腺素 E2的合成，从而促进干细胞诱 导分化成外胚层祖细胞，且诱导效率高。
[0024] 本发明所使用的术语"前列腺素 E2"为本领域技术人员所公知，是人体内广泛存在 的一种重要生长和调节因子。它是一类含有20个碳原子的不饱和脂肪酸，其基本骨架为一 个五碳环和两条侧链，在体内由花生四稀酸(arachidonic acid，AA)经过氧化途径而生成。 当机体细胞受到某些机械、物理或者化学刺激时，细胞的磷脂酶A2 (phospholipase，PLA2) 被激活，使与膜结合的AA游离，然后通过环氧合酶（C0X-1或C0X-2)作用转换为PGH2 (prostaglandin H2)，PGH2经细胞特异性酶作用迅速生成具有生物活性的前列腺素类介 质。
[0025]根据本发明的实施例，前列腺素 E2合成抑制剂为吲哚美辛。前列腺素 E2的合成依 赖于其关键性的合成限速酶一环氧合酶。发明人发现，通过抑制环氧合酶的酶活性，能够抑 制细胞内前列腺素 E2的合成。进而，发明人经过深入研究发现，吲哚美辛抑制环氧合酶的酶 活性效果最佳，进而能够导致前列腺素 E2合成受阻，使得干细胞诱导分化为外胚层祖细胞 的分化效率显著提高。由此，根据本发明实施例的诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方法 能够有效地诱导干细胞分化成外胚层祖细胞，且诱导效率高。
[0026]根据本发明的实施例，前列腺素 E2合成抑制剂的浓度为1~ΙΟμΜ。发明人经过深入 研究发现，在此最优浓度下，能够有效地诱导干细胞分化成外胚层祖细胞，且诱导效率进一 步提高。浓度过大或者过小都将影响干细胞的生长或分化。
[0027]根据本发明的实施例，基础培养基包括:95体积％的混合培养基，该混合培养基是 将頂DM培养基与F12培养基按照3:1的体积比混合得到的；1体积的％谷氨酰胺；1体积％的 胰岛素-转铁蛋白-硒复合物；1体积％的非必需氨基酸；〇. 〇5g/L的牛血清白蛋白；ΙΟμΜ的 SB431542; 12ng/ml的bFGF; 1体积％的青霉素；以及1体积％的链霉素。发明人发现，在此最 优基础培养基中，干细胞生长良好，并能够有效地分化成为外胚层祖细胞，且诱导效率高。 [0028]需要说明的是，本发明所使用的术语"IMDM培养基"、"F12培养基"、"非必需氨基 酸"、"SB431542"及"bFGF"为本领域技术人员所公知，对获得来源不做严格限定，既可通过 市售获得，也可自行制备。根据本发明的具体实施例，IMDM培养基可以购自ThermoFisher公 司，货号为12440053 ;F12培养基可以购自ThermoFisher公司，货号为11765054;非必需氨基 酸可以购自ThermoFisher公司，货号为11140050; SB431542可以购自Stemgent，货号为04-0010;bFGF可以购自P印rotech公司，货号为100-18b。
[0029] 根据本发明的实施例，方法包括：（1)将干细胞在MEF饲养层共培养体系中进行第 一培养；（2)将步骤（1)所得到的细胞在无饲养层培养体系中进行传代培养；（3)将步骤(2) 所得到的细胞进行消化，并将得到的消化产物进行离心，收集离心产物；（4)将离心产物进 行重悬，并将得到的重悬细胞接种至基质胶培养基中进行第二培养；以及(5)将步骤(4)所 得到的细胞转至诱导培养基中进行诱导培养，从而得到外胚层祖细胞。发明人发现，将第一 培养所得到的细胞在无饲养层培养体系中进行传代培养，细胞生长迅速，状态均一，且无异 源细胞引入，对诱导造成干扰。由此，根据本发明实施例的诱导干细胞分化成外胚层祖细胞 的方法能够有效地诱导干细胞分化成外胚层祖细胞，且诱导效率较高。
[0030] 需要说明的是，"MEF饲养层共培养体系"及"无饲养层培养体系"为本领域技术人 员所公知。"MEF饲养层共培养体系"主要是指以胎鼠成纤维细胞为饲养层的干细胞培养体 系，"无饲养层培养体系"主要是指以基质胶为培养基质的干细胞培养体系。
[0031] 根据本发明的实施例，传代培养进行至少5代。发明人发现，随着培养时间延长，细 胞分裂增殖进入活跃期并成克隆化生长，细胞数量显著增多，并逐渐在培养基底壁形成汇 合的细胞层，细胞之间因接触性抑制作用而增殖减缓，故需要进行传代培养。传代至少5代， 得到的细胞纯度较好，生长状态较为稳定。由此，根据本发明实施例的诱导干细胞分化成外 胚层祖细胞的方法能够有效地诱导干细胞分化成外胚层祖细胞，且诱导效率较高。
[0032]本发明所使用的术语"传代培养"为本领域技术人员所公知的，是指通过模拟体内 生理环境等特定的体外培养条件下，对细胞进行孵育培养，使之生存并增殖。根据本发明的 具体实施例，将第一培养所得到的细胞进行消化，得到第1代细胞，该过程称为传代培养1 代。然后，取第1代细胞转接至基质胶上进行培养，得到第2代细胞，该过程称为传代培养2 代，依次类推，当传代培养至少5代时，所得到的细胞生长活性较好，适用于诱导培养，且诱 导效率较高。
[0033]根据本发明的实施例，消化是将步骤(2)所得到的细胞置于消化酶中，37摄氏度下 孵育5~7分钟。发明人经过深入研究发现，在此消化条件下能够使细胞脱离培养基质，得到 细胞团块。根据本发明的具体实施例，待克隆边缘卷起时，加入mTeSR培养基终止消化反应。 由此，根据本发明实施例的诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方法能够有效地诱导干细胞 分化成外胚层祖细胞，且诱导效率较高。
[0034]根据本发明的实施例，第二培养至克隆贴附并开始进入扩增期时，进行诱导培养。 [0035]根据本发明的实施例，离心是在900~1200rpm的转速下进行3~5分钟，优选是在 900rpm的转速下进行5分钟。由此，根据本发明实施例的诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的 方法能够有效地诱导干细胞分化成外胚层祖细胞，且诱导效率较高。
[0036]根据本发明的实施例，诱导培养是在37摄氏度下进行36~120小时，优选48小时。 发明人经过深入研究发现，在此条件下进行诱导培养，能够使干细胞有效地分化得到外胚 层祖细胞。
[0037] 外胚层祖细胞
[0038]在本发明的第二方面，本发明提出了一种外胚层祖细胞。根据本发明的实施例，外 胚层祖细胞是由前面所描述的诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方法得到的。由此，根据 本发明实施例的外胚层祖细胞诱导分化效率高，并具有较强的分化为神经干细胞的潜力。
[0039] 本领域技术人员能够理解的是，前面针对诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方法 所描述的特征和优点，同样适用于该外胚层祖细胞，在此不再赘述。
[0040] 外胚层祖细胞在制备药物中的用途
[0041] 在本发明的第三方面，本发明提出一种前面所描述的外胚层祖细胞在制备药物中 的用途。根据本发明的实施例，药物用于治疗中枢神经系统退行性疾病。由此，根据本发明 实施例的外胚层祖细胞在制备药物中的用途具有极佳的应用前景。
[0042] 根据本发明的实施例，药物用于治疗阿尔茨海默症。由此，根据本发明实施例的外 胚层祖细胞在制备药物中的用途具有极佳的应用前景。
[0043]术语"治疗"用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分 预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不 良作用而言可以是治疗性的。本文使用的"治疗"涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：（a) 在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防中枢神经系统退行性疾病)或 病症发生；（b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展;或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。 [0044]本领域技术人员能够理解的是，前面针对外胚层祖细胞所描述的特征和优点，同 样适用于该外胚层祖细胞在制备药物中的用途。
[0045] 诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的培养基
[0046] 在本发明的第四方面，本发明提出了一种诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的培养 基。根据本发明的实施例，培养基包括:基础培养基，以及前列腺素 E2合成抑制剂。由此，利 用根据本发明实施例的培养基能够有效地使干细胞分化成外胚层祖细胞，且诱导效率高。 [0047]根据本发明的实施例，前列腺素 E2合成抑制剂的浓度为1~ΙΟμΜ。发明人经过深入 研究发现，在此最优浓度下，能够有效地诱导干细胞分化成外胚层祖细胞，且诱导效率进一 步提高。浓度过大或者过小都将影响干细胞的生长或分化。
[0048]根据本发明的实施例，前列腺素 Ε2合成抑制剂为吲哚美辛。前列腺素 Ε2的合成依 赖于其关键性的合成限速酶一环氧合酶。发明人发现，通过抑制环氧合酶的酶活性，能够抑 制细胞内前列腺素 Ε2的合成。进而，发明人经过深入研究发现，吲哚美辛抑制环氧合酶的酶 活性效果最佳，从而导致前列腺素 Ε2合成受阻，使得干细胞诱导分化为外胚层祖细胞的分 化效率显著提高。由此，根据本发明实施例的诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的培养基能 够有效地诱导干细胞分化成外胚层祖细胞，且诱导效率高。
[0049] 根据本发明的实施例，基础培养基包括:95体积％的混合培养基，该混合培养基是 将頂DM培养基与F12培养基按照3:1的体积比混合得到的；1体积的％谷氨酰胺；1体积％的 胰岛素-转铁蛋白-硒复合物；1体积％的非必需氨基酸；〇. 〇5g/L的牛血清白蛋白；ΙΟμΜ的 SB431542; 12ng/ml的bFGF; 1体积％的青霉素；以及1体积％的链霉素。发明人发现，在此最 优基础培养基中，干细胞生长良好，并能够有效地分化成为外胚层祖细胞，且诱导效率高。
[0050] 需要说明的是，本发明所使用的术语"IMDM培养基"、"F12培养基"、"非必需氨基 酸"、"SB431542"及"bFGF"为本领域技术人员所公知，对获得来源不做严格限定，既可通过 市售获得，也可自行制备。根据本发明的具体实施例，IMDM培养基可以购自ThermoFisher公 司，货号为12440053 ;F12培养基可以购自ThermoFisher公司，货号为11765054;非必需氨基 酸可以购自ThermoFisher公司，货号为11140050; SB431542可以购自Stemgent，货号为04-0010;bFGF可以购自P印rotech公司，货号为100-18b。
[0051 ]试剂盒
[0052]在本发明的第五方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，试剂盒包 括前列腺素 E2合成抑制剂。由此，利用根据本发明实施例的试剂盒能够有效地使干细胞分 化成外胚层祖细胞，且诱导效率高。
[0053]根据本发明的实施例，前列腺素 E2合成抑制剂为吲哚美辛。前列腺素 E2的合成依 赖于其关键性的合成限速酶一环氧合酶。发明人发现，通过抑制环氧合酶的酶活性，能够抑 制前列腺素 E2的合成。进而，发明人经过深入研究发现，吲哚美辛抑制环氧合酶的酶活性效 果最佳，从而导致前列腺素 E2合成受阻，使得干细胞诱导分化为外胚层祖细胞的分化效率 显著提高。由此，根据本发明实施例的试剂盒能够有效地诱导干细胞分化成外胚层祖细胞， 且诱导效率高。
[0054]根据本发明的实施例，包括基础培养基，基础培养基包括:95体积％的混合培养 基，该混合培养基是将MDM培养基与F12培养基按照3:1的体积比混合得到的；1体积的％谷 氨酰胺；1体积％的胰岛素-转铁蛋白-硒复合物；1体积％的非必需氨基酸;〇. 〇5g/L的牛血 清白蛋白；1 〇μΜ的SB431542; 12ng/ml的bFGF; 1体积％的青霉素；以及1体积％的链霉素。发 明人发现，在此最优基础培养基中，干细胞生长良好，并能够有效地分化成为外胚层祖细 胞，且诱导效率高。
[0055]根据本发明的实施例，前列腺素 E2合成抑制剂的浓度为1~10uM。发明人经过深入 研究发现，在此最优浓度下，能够有效地诱导干细胞分化成外胚层祖细胞，且诱导效率进一 步提高。浓度过大或者过小都将影响干细胞的生长或分化。
[0056] 试剂盒在诱导干细胞分化成外胚层祖细胞中的用途
[0057] 在本发明的第六方面，本发明提出了一种试剂盒在诱导干细胞分化成外胚层祖细 胞中的用途。由此，能够有效地使干细胞分化成外胚层祖细胞，且诱导效率高。
[0058]本领域技术人员能够理解的是，前面针对试剂盒所描述的特征和优点，同样适用 于该试剂盒在诱导干细胞分化成外胚层祖细胞中的用途，在此不再赘述。
[0059] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的 实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条 件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪 器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0060] 干细胞:来源于美国Wicell研究中心建立国际公认的人胚胎干细胞系H1和H9。
[0061] 共培养培养体系：由E13.5天ICR品系小鼠胚胎分离获取的成纤维细胞作为饲养 层。
[0062] 无饲养层培养体系:Matrigel基质胶和mTeSR培养基。
[0063] mTeSR培养基：购自Stemcell公司。
[0064]基质胶:购自BD公司。
[0065] IMDM 培养基：购自 ThermoFisher公司。
[0066] F12培养基：购自 ThermoF i sher 公司。
[0067] 非必需氨基酸:购自ThermoFisher公司。
[0068] SB431542:购自 Stemgent 公司。
[0069] bFGF:购自Peprotech公司。
[0070] 实施例1
[0071 ]诱导干细胞分化成外胚层祖细胞
[0072]按照下列方法诱导干细胞分化成外胚层祖细胞：
[0073] 1、诱导培养基：
[0074] 95体积％的混合培养基，混合培养基是将頂DM培养基与F12培养基按照3:1的体积 比混合得到的；1体积的％谷氨酰胺；1体积％的胰岛素-转铁蛋白-硒复合物；1体积％的非 必需氨基酸；0. 〇5g/L的牛血清白蛋白；ΙΟμΜ的SB431542; 12ng/ml的bFGF; 1体积％的青霉 素；以及1体积％的链霉素。
[0075] 2、步骤：
[0076] (1)在传代前一天复苏MEF细胞，并将其接种到0.1 %明胶溶液预包被的孔板中。24 小时后，吸弃干细胞培养基，并用DF12培养基润洗细胞1次，加入lmg/ml四型胶原酶溶液对 细胞进行消化。约10-20分钟后，细胞克隆边缘开始卷曲，吸弃四型胶原酶，并加入培养基进 行中和润洗，将细胞轻柔吹下来，900rpm离心4分钟，并将细胞沉淀用新鲜的干细胞培养基 进行重悬，并接种到含有MEF饲养层细胞的培养孔中继续培养5~7天。
[0077] (2)将细胞转移至无饲养层培养体系中，每天更换mTeSR培养基，待细胞克隆达到 90%以上的汇合度后，吸弃培养基后加入分散酶，37°C孵育消化7分钟，用mTeSR培养基终止 消化反应，将克隆吹打成小细胞团块后离心，900rpm离心5分钟，吸弃上清后用mTeSR培养基 重悬细胞，将得到的细胞转移至新的无饲养层培养体系中，进行培养，如此传代培养5代。 [0078] (3)吸弃培养基后加入分散酶，37°C孵育消化7分钟，用mTeSR培养基终止消化反 应，将克隆吹打成小细胞团块后离心，900rpm离心5分钟，吸弃上清后用mTeSR培养基重悬细 胞，将细胞接种到基质胶预包被的孔板中过夜培养，克隆贴附并开始进入扩增期时换入诱 导培养基，诱导48小时后收集细胞。
[0079] 实施例2
[0080]外胚层祖细胞的鉴定
[00811 将实施例1所得到的细胞用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTANaW^消化液处理1~ 3分钟，使细胞脱离培养基质并成为单细胞，加入含10 %胎牛血清的培养基进行中和消化， 1200rpm离心5分钟，用冷roS缓冲液润洗细胞，将细胞沉淀收集于1.5ml EP管中，使用细胞 总RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit，QIAGEN 74104)，按其使用说明裂解细胞并提取细胞 内总RNA，利用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度后，使用反转录试剂盒(ReverTra Ace qPCR RT Master Mix，T0Y0B0 FSQ-201)将lyg总RNA反转录为cDNA。将cDNA、引物同qPCR反 应预混试剂（THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix,T0Y0B0QPS-201)混合，通过Bio-Rad公司的 opticon 2荧光实时定量PCR仪对目的基因进行扩增，以人GATOH基因表达量为参照。PCR反 应体系为：
[0083]每个样本反应独立重复三次以消除系统误差。
[0084] 用上述方法对诱导细胞基因 mRNA表达水平进行鉴定，鉴定基因包括外胚层祖细胞 分化基因 GBX2、HoxAl、S0Xl及ZIC1，以及神经干细胞标志基因 PAX6,检测基因的引物序列如 下表所示，结果如图1所示。
[0085] 表1引物序列
[0086]
[0087] 结果表明，在诱导培养基中添加关键的诱导组分一吲哚美辛后，细胞向外胚层祖 细胞的分化效率显著提高，其表现在添加吲哚美辛后，外胚层祖细胞分化基因及神经干细 胞标志基因的表达水平较未添加组显著提高。
[0088] 实施例3
[0089] 流式细胞术对细胞表面标志蛋白检测鉴定
[0090] 利用流式细胞术对细胞表面标志蛋白检测鉴定，具体操作如下：
[0091] 样品组：
[0092] 将1 X 106个实施例1所得到的细胞用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTANa^消化液 处理1-3分钟，使细胞脱离培养基质并成为单细胞，加入含10%胎牛血清的培养基进行中和 消化作用，1200rpm离心5分钟，用冷roS缓冲液润洗细胞，再次离心后将细胞重悬于100μΙ PBS缓冲液中，加入携带荧光标记的NCAM抗体并混匀，4°C避光孵育45分钟。抗体孵育后将细 胞用冷PBS缓冲液润洗两遍以除去未结合抗体，而后将细胞重悬入400μ1 PBS缓冲液中，利 用流式细胞分析仪对细胞表面NCAM蛋白的表达率进行检测。
[0093] 对照组：
[0094] 同样品组的操作基本相同，区别在于，在实施例1中的诱导培养基中不含吲哚美 辛。
[0095] 结果如图2所示，在诱导培养基中添加关键的诱导组分一吲哚美辛后，细胞向外胚 层祖细胞的分化效率显著提高，其表现在添加吲哚美辛后，外胚层祖细胞表面标志蛋白 NCAM-1的表达水平较未添加组显著提高。
[0096] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任 一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技 术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结 合和组合。
[0097] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例 性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述 实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1. 一种诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方法，其特征在于，包括： 在抑制干细胞合成前列腺素 E2的条件下，对所述干细胞进行诱导培养。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养采用诱导培养基，并且所述 诱导培养基包括： 基础培养基，以及 前列腺素 E2合成抑制剂， 任选地，所述前列腺素 E2合成抑制剂为吲哚美辛， 任选地，所述前列腺素 E2合成抑制剂的浓度为1~ΙΟμΜ， 任选地，所述基础培养基包括： 95体积％的混合培养基，所述混合培养基是将IMDM培养基与Fl 2培养基按照3:1的体积 比混合得到的； 1体积的％谷氨酰胺； 1体积％的胰岛素-转铁蛋白-硒复合物； 1体积％的非必需氨基酸； 〇.〇5g/L的牛血清白蛋白； 10y]\^9SB431542; 12ng/ml的bFGF; 1体积％的青霉素；以及 1体积％的链霉素。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括： (1) 将干细胞在MEF饲养层共培养体系中进行第一培养； (2) 将步骤(1)所得到的细胞在无饲养层培养体系中进行传代培养； (3) 将步骤(2)所得到的细胞进行消化，并将得到的消化产物进行离心，收集离心产物； (4) 将所述离心产物进行重悬，并将得到的重悬细胞接种至基质胶培养基中进行第二 培养；以及 (5) 将步骤(4)所得到的细胞转至诱导培养基中进行诱导培养，从而得到所述外胚层祖 细胞， 任选地， 所述传代培养进行至少5代， 所述消化是将步骤(2)所得到的细胞置于消化酶中，37摄氏度下孵育5~7分钟， 所述离心是在900~1200rpm的转速下进行3~5分钟，优选是在900rpm的转速下进行5 分钟， 所述诱导培养是在37摄氏度下进行36~120小时，优选48小时。4. 一种外胚层祖细胞，其特征在于，所述外胚层祖细胞是由权利要求1~3任一项所述 诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方法得到的。5. 权利要求4所述的外胚层祖细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗中枢神经 系统退行性疾病， 优选地，所述药物用于治疗阿尔茨海默症。6. -种诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的培养基，其特征在于，包括： 基础培养基，以及 前列腺素 E2合成抑制剂， 优选地，所述前列腺素 E2合成抑制剂的浓度为1~1 ΟμΜ。7. 根据权利要求6所述的培养基，其特征在于，所述前列腺素 Ε2合成抑制剂为吲哚美 辛。8. 根据权利要求6所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基包括： 95体积％的混合培养基，所述混合培养基是将IMDM培养基与Fl 2培养基按照3:1的体积 比混合得到的； 1体积的％谷氨酰胺； 1体积％的胰岛素-转铁蛋白-硒复合物； 1体积％的非必需氨基酸； 〇.〇5g/L的牛血清白蛋白； 10y]\^9SB431542; 12ng/ml的bFGF; 1体积％的青霉素；以及 1体积％的链霉素。9. 一种试剂盒，其特征在于，包括前列腺素 E2合成抑制剂， 任选地，所述前列腺素 E2合成抑制剂为吲哚美辛， 任选地，所述试剂盒包括基础培养基， 所述基础培养基包括： 95体积％的混合培养基，所述混合培养基是将IMDM培养基与Fl 2培养基按照3:1的体积 比混合得到的； 1体积的％谷氨酰胺； 1体积％的胰岛素-转铁蛋白-硒复合物； 1体积％的非必需氨基酸； 〇.〇5g/L的牛血清白蛋白； 10y]\^9SB431542; 12ng/ml的bFGF; 1体积％的青霉素；以及 1体积％的链霉素， 优选地，所述前列腺素 E2合成抑制剂的浓度为1~1 ΟμΜ。10. -种权利要求9所述的试剂盒在诱导干细胞分化成外胚层祖细胞中的用途。
【文档编号】A61P25/28GK105886457SQ201610322185
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】裴雪涛, 李艳华, 张博文, 何丽娟, 刘鸣, 刘一鸣, 岳 文
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所