趋化因子2在促进肝再生中的用图
【专利摘要】本发明提供趋化因子2在促进肝再生中的用途，可以促进肝再生。肝再生速率高、肝功能稳定。
【专利说明】
趋化因子2在促进肝再生中的用途
技术领域
[0001] 本发明涉及再生生物学领域，尤其涉及趋化因子2促进肝再生中的用途。
【背景技术】
[0002] 再生生物学是现代生物学中发展最为迅速和最受关注的领域之一，肝再生也属于 这一范畴。肝脏在正常的生理状态下仅有约〇. 〇〇 12 % -0.01 %的细胞进行有丝分裂，但当肝 脏受到创伤或者手术切除后有很强的再生能。大鼠70 %部分肝切除（partical hepatect〇my，PH)模型是进行肝脏再生研究的主要模型，剩余肝脏经过约1周时间就基本再 生至原有的重量和体积，并保持最佳的重量/体积比，基本恢复原有的功能。对肝脏再生调 控机制的研究不仅丰富了对肝损伤和术后再生修复机制的认识和了解，同时也为器官移植 开辟了新的前景。因此，开发研究能够促进肝再生的分子意义重大。
[0003] 趋化因子(chemokine)是一类小分子分泌蛋白，分子量约8-10kDa，能激活并趋化 白细胞作定向迀移。趋化因子是当今国内外医学生物学研究的热点之一，部分趋化因子的 衍生物或抑制物具有潜在的临床应用前景。趋化因子2(C-C chemokine ligand 2，CCL2)由 脂肪细胞、纤维母细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞等多种细胞分泌，趋化各种炎症细胞如 中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞向病变部位聚积，在炎症反应、新生血管生成、损伤修复、 肿瘤发生中均有重要作用。CCL2已发现在肝炎、肝纤维化、肝癌等众多肝脏疾病的发生发展 中起着重要作用，但其在肝再生中的作用并不清楚。
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供趋化因子2在促进肝再生中的用途，可以促进肝再生，且肝再生 速率高、肝功能稳定。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供的趋化因子2在促进肝再生中的用途是这样 实现的：
[0006] 趋化因子2在促进肝再生中的用途。
[0007] 趋化因子2促进肝再生过程中脂肪形成的用途。
[0008] 趋化因子2在促进肝再生药物中的用途。
[0009] 趋化因子2在促进肝再生中脂肪形成的药物中的用途。
[0010]本发明通过大鼠 PH模型，往大鼠体内转入趋化因子2,记录大鼠生长数据，转入趋 化因子2的大鼠肝再生率及肝脏指数均显著大于未转入趋化因子2的大鼠；肝功能上，转入 趋化因子2大鼠的ALT、AST和TBIL降低，与未转入趋化因子2的大鼠有显著差异。
[0011] 大鼠肝再生168h使用苏丹IV对肝组织进行染色，脂肪数量明显较多。
[0012] 提取组织中的RNA，制备cDNA。然后在PRISM 7900Sequence Detector上扩增靶基 因和进行PCR检测，与脂肪相关基因酰基辅酶A合成酶长链4、载脂蛋白E、脂肪分化相关蛋白 和类固醇脱氢酶样蛋白在转入趋化因子2的大鼠中的数量明显大于未转入趋化因子2的大 鼠的量。
【附图说明】
[0013] 图1是本发明提供的再生肝脏转基因后绿色荧光蛋白的表达结果图；
[0014] 图2是本发明提供的再生肝脏再生率试验结果对比图；
[0015] 图3是本发明提供的再生肝脏指数试验结果对比图；
[0016] 图4是本发明提供的再生肝脏组织经苏丹IV染色的试验结果对比图；
[0017] 图5是Real-time PCR检测再生肝脏脂肪相关基因的表达的对比图。
【具体实施方式】
[0018]本发明采用大鼠 PH模型进行肝脏再生试验。本发明采用SPSS 13.0统计软件对实 验组和对照组资料进行t检验，P〈0.05为有显著性差异，P〈0.01为有极显著性差异。
[0019] 选用Sprague Dawley(SD)大鼠，重200±20g，购买于军事医学科学院实验动物中 心，合格证号SCXK(军）2002-0001。本发明将趋化因子2(chemokine(C-C motif)ligand 2， CCL2)通过PEGFP-N1转入切除了部分肝的大鼠肝脏中，以促进大鼠肝脏的再生。PEGFP-N1是 PE绿色焚光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP)_Nl。趋化因子（chemokine)是一类小 分子分泌蛋白，分子量约8-10kDa，能激活并趋化白细胞作定向迀移。趋化因子2(C-C chemokine ligand 2，CCL2)由脂肪细胞、纤维母细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞等多种细 胞分泌，趋化各种炎症细胞如中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞向病变部位聚积，在炎症反 应、新生血管生成、损伤修复、肿瘤发生中均有重要作用。具体试验如下：
[0020] 大鼠随机分为三组:部分肝切除组、部分肝切除后转PEGFP-N1(空质粒)组、部分肝 切除转pEGFP-Nl -cc 12 (cc 12表达质粒)组，每组10只。
[0021] 大鼠部分肝切除模型的建立：用0.9%氯化钠溶液配制1 %的戊巴比妥钠溶液。各 组大鼠经戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后，剪去腹部和胸部的毛，75%乙醇消毒，取仰卧位固 定于手术台，从胸骨剑突下方3cm处沿腹中线切开皮肤至胸骨剑突，暴露腹腔，将肝的左叶 和中叶（约占总肝质量的70%)挤出，以0号丝线结扎肝叶根部后，切除肝叶，5号缝合线缝合 伤口，撒少许四环素粉沫以预防感染。在切除部分肝脏后，分别三组大鼠切除两叶之肝重A， 并对应记录。
[0022] 部分肝切除组，大鼠于恒温(21-22Γ)动物房中饲养，实验期间大鼠自由饮食及饮 水。
[0023] 转pEGFP-Nl组和转pEGFP-Nl-ccl2组在部分肝切除后立即通过尾静脉液压转基因 方法转入pEGFP-Nl质粒或pEGFP-Nl-ccl2质粒。注射浓度为30mg/L质粒，注射速度为2ml/s， 注射质粒溶液的体积为大鼠体重X9% X 1/3 X 1.35。大鼠于21-22°C恒温动物房中饲养，实 验期间大鼠自由饮食及饮水。
[0024] 注射后6h荧光显微镜下分别观察转pEGFP-Nl组和转pEGFP-Nl-ccl2组大鼠肝右叶 绿色荧光蛋白的表达，如图1所示，A为转pEGFP-Nl组，B为转pEGFP-Nl-ccl2组，转pEGFP-Nl 组和转pEGFP-Nl-ccl2组均观察到绿色荧光蛋白的表达，并且表达量大于30%，说明转 pEGFP-Nl组和转pEGFP-Nl-cc 12组大鼠肝脏中已经分别成功注入了 pEGFP-Nl和pEGFP-Nl-ccl2。部分肝切除组与部分肝切除后转pEGFP-Nl组绿色荧光蛋白的表达结果近似，因此图1 中省略了部分肝切除组的绿色荧光蛋白表达的图片。
[0025]如下，本发明分别在三组大鼠饲养24、72、120、1681!时，对大鼠进行一系列检测，具 体如下：
[0026] 一、称重计算肝再生率和肝脏指数
[0027]三组大鼠分别在饲养24、72、120、168h各时间点称量大鼠体重和再生肝重，按以下 公式计算肝再生率及肝脏指数。
[0028] 肝再生率=[Β-(Α/0·684-Α)]/ΑΧ100%
[0029] 肝脏指数= B/GX100%
[0030] 其中，A为切除两叶之肝重，B为再生肝重，G为体重，0.684相当于切除两叶肝重与 原肝重之比。
[0031] 如图2所示，转入pEGFP-Ni-ccU质粒的大鼠 PH后72和168h肝脏指数都显著大于转 pEGFP-Ni组，120h也达到 了显著水平。其中，*P〈0 · 05，#Ρ〈0 · 01。
[0032] 如图3所示，转入PEGFP-NHC12质粒的大鼠 PH后120h肝脏指数极显著大于转 pEGFP-他组，168h也达到了显著水平，而转pEGFP-他组与部分肝切除组相比无显著差异。其 中，*Ρ〈0·05，**Ρ〈0·01。
[0033] 二、肝功能检测
[0034]饲养两组大鼠168h后，经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧位固定，打开腹腔，下腔 静脉采血lmL，室温静置30min，4000r/min离心5min，取血清300μ1，全自动生化仪检测血清 中谷丙转氨酶（alanine amiotransferase, ALT)、谷草转氨酶（aspartate aminotransf erase，AST)与总胆红素 （total bi 1 irubin，TBIL)的含量。如表一所不，转 pEGFP-Nl-ccl2组具用一定的降低ALT、AST和TBIL的作用，与转pEGFP-Ni组比较均有极显著 性差异，
[0035]
[0036] a转pEGFP-Nl组与部分肝切除组比较，b转pEGFP-Nl-ccl2组与转pEGFP-Nl组比 较，*P〈〇 · 05，**Ρ〈0 · 01
[0037] 表一
[0038] 三、苏丹IV染色
[0039] 三组大鼠在饲养168h，分别取三组大鼠的肝组织。10%甲醛固定肝组织4h，双蒸水 洗涤三次，用冰冻切片机制备ΙΟμπι的冰冻切片，冰冻切片用双蒸水洗三次，切片放入苏丹 IV染液中，置于56 °C温箱中30min或延长至lh。新配制的70 %乙醇分化，直至洗去切片上的 浮色为止(约5-10s)，双蒸水洗三次。用滤纸将切片周围的水分吸干。用甘油明胶封固。37°C 烤一天后尽快照相。脂肪呈猩红色。如图4所示，A为转pEGFP-沁组，B为转pEGFP-NrccU组； PEGFP-R-CC12转基因后有脂肪聚积，猩红色明显较多，图4中脂肪滴的数量呈增多的趋势。 苏丹IV由上海恒远生化试剂有限公司提供。部分肝切除组与部分肝切除后转pEGFP-ΝΙ组苏 丹IV染色结果近似，因此省略部分肝切除组的染色结果图片。
[0040] 三、Real-time PCR检测脂肪相关基因的表达
[0041 ] 三组大鼠在饲养168h后，分别提取组织中的lyg RNA，按Invitrogen公司逆转录试 剂盒说明制备cDNA。然后按照QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit(Qiagen)的操作指南在 PRISM7900Sequence Detector上扩增革巴基因和进行PCR检测，并根据标准曲线计算样本中 靶基因的拷贝数/ml，根据β-actin的拷贝数计算靶基因的相对含量。Real-time PCR各基因 特异性引物序列见表二。
[0042]
[0043] 表二
[0044] 如图5所示，部分肝切除后24、72、120和168h，脂肪相关基因酰基辅酶A合成酶长链 4(acly-coA synthetase long chainfamily 4，ACSL4)、载月旨蛋白E(apolipoprotein E， ApoE)、脂肪分化相关蛋白（adipose differentiation-related protein,ADRP)和类固醇 脱氢酶样蛋白（NAD(P)dependent steroid dehydrogenase like,NSDHL)在转pEGFP-Ni-ccl2组的总体来说大于仅部分肝切除组和转pEGFP-见组，后两组的差别不大。
[0045] 综上所述，本发明将趋化因子2转入切除部分肝脏的大鼠肝脏中，第一、二项检测 分别说明肝再生率、肝脏指数和肝脏功能也比切除部分肝脏组和pEGFP-沁组有显著恢复， 转pEGFP-Nl-ccl2组具用降低ALT、AST和TBIL的作用，与部分肝切除组和转pEGFP-Ni组比较 均有极显著性差异，说明趋化因子2有促进肝再生的用途;经苏丹IV染色，Real-time PCR检 测脂肪相关基因的表达，进一步说明趋化因子2通过增加脂肪产生，促进肝脏再生。
[0046] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 趋化因子2在促进肝再生中的用途。2. 权利要求1中所述趋化因子2促进肝再生过程中脂肪形成的用途。3. 趋化因子2在促进肝再生药物中的用途。4. 权利要求3中所述趋化因子2在促进肝再生中脂肪形成的药物中的用途。5. -种促进肝再生的趋化因子2。6. 权利要求5中促进肝再生中脂肪形成的趋化因子2。
【文档编号】C07K14/52GK105886455SQ201610267737
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】邢雪琨, 张艳芬, 王树芳, 陈红丽, 李永海, 南文滨, 徐志浩, 林俊堂, 丰慧根, 袁志庆
【申请人】新乡医学院