一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒的多重rt-pcr检测试剂盒的利记博彩app
【专利摘要】本发明提供一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒的多重RT?PCR检测试剂盒，包括用于扩增美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒目的基因的引物对一和用于扩增猪细小病毒目的基因的引物对二。并提供了检测试剂盒的使用方法。本发明提供的检测试剂盒较经典的病毒分离、单RT?PCR和血清型分型方法快捷，可以方便地一次性鉴定并区分出属于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒中的任意一种，以便于对疫病情况及区域、环境做出及时快捷的反应，以最短的时间做出正确的处理办法，这对及时扑灭或阻断传染病的传播具有积极的意义，同时，本发明特别适于小样品的提取，本发明具有广泛的市场应用前景。
【专利说明】
-种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒的多重 RT-PCR检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明设及畜类病毒检测试剂盒，具体设及一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒 和猪细小病毒的多重RT-PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syn化ome virus, PRRSV)引起的，W妊娠母猪发生早产、流产、死胎、弱仔和木乃伊胎，仔猪和育肥猪 发生呼吸道疾病，生产性能降低，饲料报酬率降低，死亡率升高等，目前，我国W美洲型PRSV 的威胁最为显著。
[0003] 猪细小病毒病（Porcine parvovirus disease)是由猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV)引起的一种猪繁殖障碍病，各种不同年龄、性别的家猪和野猪均易感。传 染源主要来自感染猪细小病毒的母猪和带毒的公猪，后备母猪比经产母猪易感染，病毒能 通过胎盘垂直传播，而带毒猪所产的活猪可能带毒排毒时间很长甚至终生。感染种公猪也 是该病最危险的传染源，种公猪通过配种传染给易感母猪，并使该病传播扩散。
[0004] 尽管目前国内外对PRRSV和PPV的病原学、血清分型、诊断做了大量的研究，但由于 其几乎遍及世界各地，对全世界猪及相关产品的威胁众所周知，造成的经济损失每年至少 为上百亿美元。尤其二者具有相似的临床表现，临床上很难区分，同时可能缺乏特征病症， 运给诊断和防治带来极大困难。因此，单靠临床诊断难W定性。
[0005] 为了确定W上两种疾病是否在某一地区存在，仅仅检测动物血清抗体的方法并非 完全可靠，还必须通过通过病原学检测W确诊病原的存在，一般检测方法为生物学实验、血 清型诊断技术和分子生物学技术等诊断技术，但是运些方法有的敏感性不高、有的特异性 不强、有的检出率较低，检测周期太长，并且运些技术普遍费用太高。建立一种快速诊断美 洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪细小病毒(PPV)的多重RT-PCR试剂盒，完成对 PRRSV和PPV的快速诊断W及对其进行严格监控具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供一种能够快速、简便、灵敏和 经济的区分动物所感染的美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒的多重RT-PCR 检测试剂盒。
[0007] 本发明提供一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒的多重RT-PCR检 测试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒目的基因的引物对一 和用于扩增猪细小病毒目的基因的引物对二； 所述引物对一为： 上游引物：5' -AACCACGCATTTGTCGTC-3' 下游引物：5' -TGGCACAGCTGATTGACTGG-3'; 所述引物对二为： 上游引物：5' -gCACACgCATCAAgACTCATACAA-3' 下游引物：5' -Tg巧ggTgAggTTgCTgATTCCC-3'。
[0008] 作为优选，在SOiil反应体系中，所述引物对一的使用量为0.祉1，引物对二的使用 量为化1。
[0009] 更优选地，所述试剂盒还包括混和酶En巧me Mix，2 XBuffer和无菌的双蒸水； 所述2 X Buffer是由 TriS-肥L、K化、MgS〇4、（畑4)2S〇4、Tween-20和dNTPS组成的。
[0010] 本发明还提供上述试剂盒在检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒 中的应用;所述检测不W专利法中规定的疾病的诊断和治疗为目的。
[0011] 上述试剂盒的使用方法为:采集待检动物的血液或病死动物的组织，制成乳悬液， 提取其全基因组RNA，WRNA为模板，W试剂盒中的特异性美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒 和猪细小病毒的引物进行多重RT-PCR，对得到的产物进行电泳，根据电泳图谱分析被检动 物是否感染有美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒。
[0012] 所述多重RT-PCR反应程序为：50°C 30min，94°C 2 min,然后是循环程序为94°C 30s，58°C lmin，72°C 5〇3,35个循环。最后72°(：延伸1〇111111。
[0013] 本发明的有益效果为:本发明提供的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒 的多重RT-PCR检测试剂盒，较经典的病毒分离、单RT-PCR和血清型分型方法快捷，可W方便 地一次性鉴定并区分出属于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒中的任意一种， W便于对疫病情况及区域、环境做出及时快捷的反应，W最短的时间做出正确的处理办法， 运对及时扑灭或阻断传染病的传播具有积极的意义，同时，本发明特别适于小样品的提取， 具有广泛的市场应用前景。
【附图说明】
[0014] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为利用本发明提供的试剂盒检测标准样品的检测结果电泳图；其中，从左至右依次 为：M，DNA分子量标准化-2000(marker条带的大小依次为2000bp、1000 bp、750bp、500bp、 250bp、100bp);泳道I为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒的多重RT-PCR检测 结果;泳道2为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR检测结果;泳道3为猪细小病毒的 RT-PCR检测结果;泳道4为阴性对照。
[0015] 图2为本发明提供的试剂盒的特异性试验结果电泳图；其中，从左至右依次为:M， DNA 分子量标准化-2000 (marker 条带的大小依次为 2000bp、1000 bp、750bp、500bp、250bp、 lOObp);泳道I为应用本发明的方法检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒的 结果;泳道2为应用本发明的方法检测猪圆环病毒-2型病毒的结果;泳道3为应用本发明的 方法检测猪攝病毒结果;泳道4为应用本发明的方法检测猪伪狂犬病毒结果;泳道5为应用 本发明的方法检测结果0型口蹄疫病毒的结果，泳道6为阴性对照。
【具体实施方式】
[0016] W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市 售。
[0017]实施例1 本发明的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒的多重RT-PCR检测试剂盒的 组成如下： (1) 用于扩增美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒目的基因的引物对一； 上游引物：5' -AACCACGCATTTGTCGTC-3'和 下游引物：5' -TGGCACAGCTGATTGACTGG-3' ; (igSbp) (2) 用于扩增猪细小病毒目的基因的引物对二； 上游引物：5' -gCACACgCATCAAgACTCATACAA-3'和 下游引物：5' -Tg巧ggTgAggTTgCTgATTCCC-3'。（ 294bp) (3) 其他试剂:Enzyme Mix,2 XBuffer和无菌的双蒸水。
[0018] 使用时，各组分浓度及使用量如下： 待检测样品RNA 2山 引物对一（10皿ol/L) 0.祉1(上下游引物各为0.祉1) 引物对二（10曲lol/L) 化K上下游引物各为化1) Enzyme Mix 2山 2 XBuffer 25山 无菌的双蒸水 补至50山 其中上述所述的2 XBuffer是由化is-肥L、K化、MgS04、（NH4)2S04、Tween-20和dNTPS组 成的。
[0019] 实施例2 本发明的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒的多重RT-PCR检测试剂盒的 使用方法为:采集待检动物的血液或病死动物的组织，制成1:5的乳悬液，提取其全基因组 RNA，WRNA为模板，W试剂盒中的特异性美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒的 引物进行多重RT-PCR，对得到的产物进行电泳，根据电泳图谱分析被检动物是否感染有美 洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒。
[0020] 具体使用方法如下： 1、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒毒的核酸提取： 采集待检动物的血液或病死动物的组织，用生理盐水稀释或研磨成1:5的乳悬液，采用 TAKARA病毒RNA提取试剂盒提取其全基因组RNA。
[0021] 2、多重 RT-PCR 反应： 本试剂盒参照Genbank登录的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒的0RF-6 编码区基因的序列，设计并合成两对引物。本试剂盒设及多重RT-PCR扩增的引物序列及片 段的大小如表1所示：
按照化KaRa-步法RT-PC时式剂盒提供的5化I反应体系加入相应的检测试剂进行RT-PCR反应。RT-PCR反应程序如下：50°C 30min，94°C 2 min,然后是循环程序为94°C 30s，58 °C lmin，72°C 50s，35个循环。最后72°C延伸IOmiruRT-PCR反应在BIOMRTRA扩增仪中进行。
[0022] 3、对RT-PCR产物进行电泳，根据电泳图谱分析被检动物是否感染有美洲型猪繁殖 与呼吸综合征病毒和猪细小病毒:产生200bp左右条带的为感染美洲型猪繁殖与呼吸综合 征病毒，产生3(K)bp左右条带的为感染猪细小病毒。
[0023] 实施例3 本发明的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒的多重RT-PCR检测试剂盒的 特异性和敏感性试验 1、PRRSV多重RT-PCR的敏感性试验： 1.1美洲型PRRSV和PPV的定量： 将美洲型PRRSV和PPV提取的病毒RNA按照2.0 X IO5拷贝的RNA、2.0 X IO4拷贝的RNA、 2.0 X IO3拷贝的RNA、2.0 X IO2拷贝的RNA和2.0 X 1〇1拷贝的RNA分别进行稀释，进行PT-PCR 扩增，结果显示，本发明的试剂盒可W特异的检出美洲型PRRSV和PPV的目的片段，且至少可 检出20拷贝的RNA。
[0024] 2、建立的PRRSV多重RT-PCR的特异性试验： 2.1猪圆环病毒-2型病毒、猪攝病毒、猪伪狂犬病毒结果和0型口蹄疫病毒的提取和多 重RT-PCRT反应： 分别用美洲型PRRSV、PPV、猪圆环病毒-2型病毒、猪攝病毒、猪伪狂犬病毒结果和0型口 蹄疫病毒中提取的RNA作为PRRSV的多重PT-PCR的反应模板，W健康猪的血液提取的RNA作 为阴性对照模板。然后程序按照实施例1中的多重PT-PCR体系和条件进行反应，反应产物用 琼脂凝胶电泳检测。
[00巧]2.2特异性结果分析： PRRSV、PPV与猪圆环病毒-2型病毒、猪攝病毒、猪伪狂犬病毒结果和0型口蹄疫病毒的 RT-PCR方法交叉反应结果如图2所示。图2中2-6道分别是猪圆环病毒-2型病毒、猪攝病毒、 猪伪狂犬病毒结果、0型口蹄疫病毒的核酸和健康猪血清的RNA。从图中可W看见上述四种 病毒与本发明的多重PT-PCR方法无交叉反应。健康猪血液中提取的RNA的反应结果也为阴 性。上述结果表明本实验所建立的美洲型PRRSV和PPV的多重RT-PCR方法与上述四种在临床 症状表现相似的病毒无交叉反应。
[0026] 3、应用美洲型PRRSV和PPV的多重PT-PCR试剂盒进行临床样品检测： 本实验室保存的美洲型PRRSV和PPV阳性的临床样品用本发明的多重RT-PCR试剂盒进 行检测，多重RT-PCR检测方法的敏感性比较检测结果如表2所示，从表中可W看出，多重RT-RCR方法对40个美洲型PRRSV和PPV为阳性的临床样品的检出率为100%，比ELISA检出率要高 约4个百分点。
[0027] 表 2
4、结论： 上述试验证明本发明的试剂盒和所建立的美洲型PRRSV和PPV的多重PT-PCR方法具有 敏感性高、特异性强、快速、实验设备简单和操作容易等特点，适合于实验室和临床对美洲 型PRRSV和PPV的快速诊断。
[0028] 最后应说明的是：W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 W对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特 征在于:所述试剂盒包括用于扩增美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒目的基因的引物对一和 用于扩增猪细小病毒目的基因的引物对二； 所述引物对一为： 上游引物：5' -AACCACGCATTTGTCGTC-3' 下游引物:5' -TGGCACAGCTGATTGACTGG-3'; 所述引物对二为： 上游引物:5' -gCACACgCATCAAgACTCATACAA-3' 下游引物：5' -TggTggTgAggTTgCTgATTCCC-3'。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:在50μ1反应体系中，所述引物对一的使 用量为0.8μ1，引物对二的使用量为ΙμL。3. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括混和酶E n z y m e Mix，2 XBuffer和无菌的双蒸水；所述2 XBuffer是由Tris-HCL、KCL、MgS〇4、（NH4)2S〇4、 Tween-20 和 dNTPS 组成的。4. 权利要求1-3任一所述的试剂盒在检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病 毒中的应用;所述检测不以专利法中规定的疾病的诊断和治疗为目的。
【文档编号】C12N15/11GK105861754SQ201610369343
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】丁耀忠, 张中旺, 周建华, 吕建亮, 周鹏, 张 杰, 张永光
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所