一种金黄色葡萄球菌的特异基因及环介导等温扩增试剂盒的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种金黄色葡萄球菌的特异基因及环介导等温扩增试剂盒，该基因为conserved low?complexity protein，Genbank登陆号为NC_017341.1(2835567..2836040)，其在金黄色葡萄球菌中广泛存在，且与其他物种无明显相似性。根据该基因设计一种应用环介导等温扩增检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征在于由四条引物、BstDNA聚合酶、反应液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成，分别置于容器中。该试剂盒可在1.5小时内完成检测，检测结果可用肉眼观察，检验结果灵敏特异。同时该检验仅需65℃恒温即可完成检测，无需其他特殊试剂与设备，检测快捷廉价。
【专利说明】
-种金黄色葡萄球菌的特异基因及环介导等溫扩増试剂盒
技术领域：
[0001] 本发明设及金黄色葡萄球菌研究领域，特别设及一种金黄色葡萄球菌的特异基因 及环介导等溫扩增试剂盒。
【背景技术】：
[0002] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)，广泛分布于自然界，革兰氏染色阳 性，是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一。其是人类化脈感染中最常见的病原菌，可引 起局部化脈感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、甚至败血症、脈毒症等全身感染。金黄色葡萄 球菌产生的溶血毒素可引起机体局部缺血和害死;杀白细胞素可破坏人的白细胞和巨隧细 胞;而肠毒素可引起毒素休克综合征、食物中毒和几种过敏性疾病、自身免疫性疾病。肠毒 素之所W能导致食物中毒，其原因主要是肠毒素随食物进入胃肠道，毒素与肠道神经细胞 受体作用，并被吸收入血，到达中枢神经系统刺激呕吐中枢，导致W呕吐为主的食物中毒。 由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的中毒暴发事件，近年来首推2000年日本"雪印奶粉"事件， 14000多人受感染。在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中 毒的33%;加拿大则更多，占到45%;我国每年发生的此类中毒事件也非常多。因此目前世 界各国都把金黄色葡萄球菌列为食品卫生的法定检测项目。
[0003] 目前金黄色葡萄球菌的检测方法包括：细菌分离鉴定、免疫学方法、核酸探针技 术、PCR技术等。细菌分离鉴定具有操作简便，所需设备简单，成本相对较低的优点，但其操 作繁琐，检测时间较长灵敏度较低，且无法检测受损菌及死菌;免疫学方法易污染，且交叉 反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低;核酸探针检测技术的最大优点是特异性强，但探针 检测技术中也存在一定的问题，如灵敏度不够高;检测一种菌就需制备一种探针。PCR方法 可W快速、灵敏的从食品中检测金黄色葡萄球菌，但PCR反应进行需要昂贵的热循环仪，检 测成本较高，达不到低成本检测的目的而很难在基层得到推广。
[0004] 随着分子生物学的发展和人们不断对传统核酸扩增技术的改进，2000年Notomi等 报道了一种新颖、便捷、灵敏度高的核酸扩增方法，即环介导等溫扩增化OOP-mediated iSOthermal amp 1 if ication，LAMP)。其特点是针对祀基因的6个特定区域设计4种特异性引 物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA POIymerase)在恒溫条件（65°C左右）下保溫几十 分钟，即可实现核酸的扩增。反应结果可通过反应副产物焦憐酸儀白色沉淀的形成进行肉 眼观察，或者通过浊度仪检测焦憐酸儀白色沉淀的混浊度来判定，也可在反应管中加入巧 光染色试剂，在紫外灯下观察，对反应产物进行实时监测。
[0005] 本发明利用生物信息学寻找出金黄色葡萄球菌特异基因，并建立了金黄色葡萄球 菌的环介导等溫扩增快速检测方法，实现了简便、快速、准确的检测出金黄色葡萄球菌的目 的。
【发明内容】
：
[0006] 为解决上述现有技术存在的问题，本发明的第一目的在于通过生物信息学手段获 取可用于鉴定金黄色葡萄球菌的基因，该基因为conserved low-complexity protein [Genbank登陆号为NC_017341.1(2835567. .2836040)]，该基因为金黄色葡萄球菌特有。属 已知基因新功能范畴。
[0007]本发明的第二个目的是提供一种应用环介导等溫扩增检测金黄色葡萄球菌的试 剂盒及其检测方法。
[000引为达到上述目的，本发明的技术方案为：
[0009] 一种金黄色葡萄球菌的特异基因，其序列如SEQ ID N0:5所示。
[0010] 该金黄色葡萄球菌特异基因，经由基于基因组的本地化AST及筛选，并进行在线 BLAST分析重确认而获得，为conserved low-complexity p;rotein[Genbank登陆号为NC_ 017:341.1(2835567. .2836040)]区段。
[0011] 一种环介导等溫扩增检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，由四条引物、BstDNA聚合酶、 反应液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成，分别置于容器中。其中：
[001^ 上述四条引物为：
[0013] 外引物F3:GGTTCAACAGCACCAGCGA，如沈Q ID N0:1 所示；
[0014] 外引物83:6〔6617616416616416(：，如沈9 10備:2所示；
[0015] 内引物FIP:TGCTACCGCCCTGATTTGAATTTTTACACAACCATCTAATCCGA，如沈Q ID N0:3 所示；
[0016] 外引物BIP: TAAACAACAGAATACACCGGCCCTTTTCTGCTTAGAAGACTCGTTTG，如SEQ ID NO: 4所示。
[0017] 上述反应溶液为 2.5mmol/L dNTPS、25mmol/L Tris-HCUpH 8.0)，lOmmol/L MgC12，内引物F3和B3均为0.5mmol/L，外引物FIP和BIP均为2mmol/L。分装于无菌离屯、管。
[0018] 上述样本预处理液为20mmol/LS径甲基氨基甲烧缓冲液[Tris-HCl(pH 8.0)]、 1.2%曲拉通(Triton X-100)和50U/ml溶葡球菌素，分装于无菌离屯、管。
[0019] 上述显色液为SYBR Green I。
[0020] -种检测金黄色葡萄球菌的方法，针对所述目的基因及所述试剂盒，按下列步骤 进行：
[0021] (1)若原始材料为液体培养基样本，取ImL进行离屯、，1000 Orpm 2min，去除上清;若 为固体培养基培养，直接挑取单菌落，生理盐水漂洗;将上述菌体样本中加入50uL样本预处 理液，37°C解育IOmin后，煮沸5min，冷却后10000巧m离屯、2min;
[0022] (2)在20化L反应管中配制反应体系，包括：反应溶液20化、Bst DNA polymerase, 0.5化，4U，模板DNA2.化L，显色液于62-68 °C反应60min;反应于PCR仪进行，或水浴锅， 或恒溫金属浴上完成。
[0023] (3)于紫外线观察，阳性反应显示为明显的黄色巧光。
[0024] 所述步骤(3)中，反应管无需打开进行电泳即肉眼观察结果，阳性反应显示为黄绿 色，阴性显示为澄色。
[0025] 检测灵敏度为2拷贝/反应。
[00%] 上述SEQ ID NO:5所示基因在金黄色葡萄球菌检测方面的应用。
[0027] 相对于现有技术，本发明的有益效果为：
[0028] 本发明通过本地Blast比对和分析，获得金黄色葡萄球菌的特异基因。根据该基因 设计一种应用环介导等溫扩增检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，其由四条引物、BstDNA聚合 酶、反应液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成，分别置于容器中。该试剂盒可在1.5 小时内完成检测，检测结果可用肉眼观察，检验结果灵敏特异。该检验仅需65°C恒溫即可完 成检测，无需其他特殊试剂与设备，检测快捷廉价。同时，该反应体系加入样本后，无需再次 打开反应管进行操作，可有效避免气溶胶污染导致的假阳性。
【附图说明】
[0029] 图1为肉眼观察特异性检测图，其中1为阴性对照，2至5为S株金黄色葡萄球菌，6 为肺炎克雷伯困，7为弗劳地氏构t缘酸杆困，8为伤寒杆困，9为琼氏不动杆困，10为大肠杆 困。
[0030] 图2为肉眼观察灵敏度检测图，其中1为阴性对照，2至9分别为2X10MV化至2X IO8 个AiL, C为阴性对照。
[0031] 图3为紫外线下观察灵敏度检测图，其中1为阴性对照，2至9分别为2X10MV化至 2X IO8个/化，C为阴性对照。
【具体实施方式】：
[0032] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明技术方案做进一步详细描述。
[0033] 实施例1.特异性祀基因筛选及引物设计：
[0034] 1.本地 BLAST 分析
[00：35]从NCBKhttp: //www. ncbi . nlm. nih. gov/genome/)中下载的金黄色葡萄球菌全基 因组序列，对本地的核酸数据库进行本地BLAST检索，获取得到金黄色葡萄球菌各序列片段 与数据库比对结果。
[0036] 2. BLAST 重确认
[0037] 使用在线BLAST功能，使用巧巾策略确认其菌种特异性和金黄色葡萄球菌鉴定可用 性。一种策略为BLAST时排除金黄色葡萄球菌，结果显示无任何相似序列者为金黄色葡萄球 菌特异基因；第二种策略为BLAST时选择在金黄色葡萄球菌内进行检索，结果返回大量相似 序列者是不同金黄色葡萄球菌菌株共有序列。结合两种策略，最终得出conserved low-complexity protein 符合两种策略标准。
[003引 3.引物设计
[0039] 针对金黄色葡萄球菌conserved low-complexity protein基因，设计特异引物。 金黄色葡萄球菌特异引物通过在线设计特异性寡核巧酸引物工具primerexplorer (http://primerexplorer. jp/elamp4.0.0/index.html)设计完成。
[0040] 实施例2:试剂盒的制备
[0041] 1. WDNA合成仪合成引物。
[0042] 外引物F3 :GGTTCAACAGCACCAGCGA;
[0043] 外引物B3 :GCGGTTGTGATGGTGATGC;
[0044] 内引物FIP: TGCTACCGCCCTGATTTGAATTTTTACACAACCATCTAATCCGA;
[0045] 外引物BIP: TAAACAACAGAATACACCGGCCCTTTTCTGCTTAGAAGACTCGTTTG。
[0046] 2.购置Bst DNA聚合酶，分装于无菌离屯、管。
[0047] 3.配制反应溶液：2.5mmol/L dNTPS、25mmol/L Tris-HCUpH 8.0)，lOmmol/L MgCl2，内引物F3和B3均为0.5mmol/L，外引物FIP和BIP均为2mmol/L。分装于无菌离屯、管。 [004引 4.配制样本预处理液：20mmol/LS径甲基氨基甲烧缓冲液[Tris-HCKpH 8.0)]、 1.2%曲拉通(Triton X-100)和50U/ml溶葡球菌素，分装于无菌离屯、管。
[0049] 5.购置显色液SYBR Green I，分装于无菌离屯、管。
[(K)加]6.阳性对照：构建包含conserved low-complexity protein基因片段的阳性质 粒，分装于无菌离屯、管。
[0化1 ] 7.将2-6项所述离屯、管组装成试剂盒。
[0052] 实施例3:金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒的应用
[0化3] 材料与方法
[0054] 1.菌株:金黄色葡萄球菌标准株1株，金黄色葡萄球菌临床分离株3株，非金黄色葡 萄球菌9株(肺炎克雷伯菌、弗劳地氏构祿酸杆菌、伤寒杆菌、琼氏不动杆菌、大肠杆菌、粪肠 球菌、溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、摩氏摩根菌）。所有菌株经梅里埃全自动快速微生物质 谱检测系统V口邸MS进行鉴定。菌株用LB培养基于37°C进行培养。
[0化日]2.样本处理:若原始材料为液体培养基样本，取ImL进行离屯、，1000 Orpm 2min，去 除上清；若为固体培养基培养，直接挑取单菌落，生理盐水漂洗。将上述菌体样本中加入 50uL样本预处理液，37 °C解育IOmin后，煮沸5min，冷却后1000化pm离屯、2min，所得上清即为 样品模板DNA。
[0056] 3.在200uL反应管中配制反应体系，包括：反应溶液20]iL、Bst DNA polymerase) 0.扣L(4U)、模板DNA2.扣L，显色液化L。于65°C反应60min。肉眼观察结果，阳性反应显示为 黄绿色，阴性显示为澄色;也可与紫外线观察，阳性反应显示为明显的黄色巧光。
[0057] 4.特异性检测:使用试剂盒对上述13株细菌进行扩增，根据显色反应观察结果，阳 性反应显示为黄绿色，阴性显示为澄色，从而验证该试剂盒的特异性。
[0化引 5.敏感性检测；W金黄色葡萄球菌基因组为模板，用上述引物F3和B3进行PCR扩 增，回收条带并克隆入PMD19-T simple载体中，作为阳性对照。
[0059] 5.1. W金黄色葡萄球菌基因组为模板，用上述特异引物进行PCR扩增，反应体系为 100化，hq 0.化L，10X聚合酶缓冲液10iiL，dNTP祉1^，1旨叫化^模板化^上下游引物各化 L，力时地2〇补足100化。
[0060] 5.2.在PCR仪中按W下程序扩增：
[006。 （1)预变性
[0062] 95 °C 5 分钟
[0063] (2) 30 个循环：
[0064] 95 °C 30 秒钟
[0065] 59 °C 30 秒钟
[0066] 72 °C 20 秒钟
[0067] (3)后扩增
[006引 72°C 1分钟
[0069] 5.3.循环结束后，将PCR产物用1.5 %琼脂糖凝胶电泳，并用北京庄盟国际生物基 因科技有限公司的小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
[0070] (I)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分）
[0071] 放入干净的离屯、管中，称取重量。
[0072] (2)向胶块中加入2倍体积溶胶液，55°C水浴10分钟，其间不断溫和地上下翻转离 屯、管，W确保胶块充分溶解。
[0073] (3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12，00化pm离屯、1分钟，倒掉收集管中的 废液，将吸附柱放入收集管中。
[0074] (4)向吸附柱中加入70化L漂洗液化，12，00化pm离屯、1分钟，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱放入收集管中。
[0075] (5)向吸附柱中加入50化漂洗液W2，12，00化pm离屯、1分钟，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱放入收集管中。
[0076] (6)将吸附柱放入收集管中，12,0(K)rpm离屯、2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置 于室溫放置数分钟，彻底惊干。
[0077] (7)将吸附柱放入一个干净离屯、管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30化的洗脱缓 冲液TE，室溫放置2分钟。12，00化pm离屯、2分钟，收集DNA溶液。
[007引 5.4.大肠杆菌D册a感受态细胞的制备：
[0079] (1)挑取单个D册a菌落，接种于3mL不含氨节青霉素的LB培养基中，37°C培养过夜， 次日取上述菌液按比例1:100再接种于50mL LB培养基中，37°C振荡2小时。当0D600值达到 0.35时，收获细菌培养物。
[0080] (2)将细菌转移到一个50mL预冷的无菌聚丙締管中，冰上放置10分钟，使培养物冷 却。
[0081] (3)于4°C下2700g离屯、10分钟，吸出培养液，并将管倒置1分钟W使残留的培养基 流尽。
[0082] (4)每50血初始培养液且30mL预冷的O.lmol/L CaC12-MgC12溶(80mmol/L MgCl2, 20mmol/L化CI2)重悬细胞沉淀。
[0083] (5)于4°C下4100巧m离屯、10分钟，吸出上清液，并将管倒置1分钟W使残留的液体 流尽。
[0084] (6)每50mL初始培养物用2mL预冷的0.1mol/L CaCb溶液重悬细胞沉淀，分装后备 用。
[0085] 5.5.连接及连接产物的转化：
[0086] (1)在微量离屯、管中加入化L Takara pMD19-T simple载体、AjiLconserved low-complexity protein 基因 PCR 产物及化 L 的连接酶缓冲混合物。
[0087] (2)16°C 反应 3 小时。
[008引 （3)全量(1化L)加入至10化1 D册a感受态细胞中，冰中放置30分钟。
[0089] (4) 42 °C加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。
[0090] (5)加入37 °C溫浴过的LB培养基890化，37 °C缓慢振荡培养60分钟。
[0091] (6)取2(K)化涂布于含有氨节青霉素的LB培养基上，37°C培养16hW形成单菌落。
[0092] 5.6.产物筛选及鉴定
[0093] 挑取上述单菌落于含氨节青霉素的LB培养基中，37 °C缓慢振荡培养4h，进行PCR扩 增。扩增引物及扩增条件同前述最优反应条件。将经PCR确证的阳性克隆进行质粒提取后， W美国Applied Biosystems3730A全自动核巧酸序列测定仪进行核巧酸序列的测定。测序 引物为BcaBESTTMSequencingPrimer M13-47(5'CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3'），目的片 段测序验证正确后进行后续研究。
[0094] 5.7.阳性质粒提取：
[00M] (1)取5mL过夜培养的菌液，加入离屯、管中，12,00化pm离屯、1分钟，尽量吸除上清。
[0096] (2)向留有菌体沉淀的离屯、管中加入25化L溶液1，使用移液器或满旋振荡器彻底 悬浮细菌沉淀。
[0097] (3)向离屯、管中加入25化L溶液2,溫和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
[009引 （4)向离屯、管中加入35化L溶液3，立即溫和地上下翻转6-8次，充分混匀，即出现白 色絮状沉淀。12,0(K)rpm离屯、10分钟，此时在离屯、管底部形成沉淀。将上一步收集的上清液 用移液器转移到吸附柱中，12,0(K)rpm离屯、60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集 管中。
[0099] (5).向吸附柱中加入7(K)化漂洗液化，12,00化pm离屯、30-60秒，倒掉收集管中的废 液，将吸附柱放入收集管中。
[0100] (6)向吸附柱中加入50化L漂洗液化，12，0(K)rpm离屯、60秒，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱放入收集管中。
[0101] (7)将吸附柱放入收集管中，12,0(K)rpm离屯、2分钟，置于室溫放置数分钟，W彻底 惊干吸附材料中残余的漂洗液。
[0102] (8)将吸附柱置于一个干净的离屯、管中，向吸附膜的中间部位滴加60化洗脱缓冲 液TE，室溫放置2分钟，12，00化pm离屯、1分钟将质粒溶液收集到离屯、管中。
[0103] 5.8.质粒数目换算
[0104] 巧紫外A化化度计测得质粒浓度。根据质粒数目换算公式：
[01化]
(注:x为质粒浓度;Y为质粒碱基对数;Na为阿伏伽德罗常 数;2692为载体碱基对数;660为碱基平均分子量)得到阳性质粒的浓度。
[0106] 5.9.取化L阳性质粒稀释至Ijl.0 X IO9个/化，取2化稀释好的阳性质粒进行10倍梯 度稀释，稀释成1.OX IO8至1.OXlO^个梯度。分别取每个梯度稀释液化L为模板。反应体系 为25化，包括反应溶液20化、Bst DNA polymerase)0.化L(4U)、模板DNA化L，显色液化L， d地2〇 0.扣L。
[0107] 结果
[010引1.特异性检测
[0109] 金黄色葡萄球菌标准株1株和金黄色葡萄球菌临床分离株3株扩增均为阳性，非金 黄色葡萄球菌9株(肺炎克雷伯菌、弗劳地氏构祿酸杆菌、伤寒杆菌、琼氏不动杆菌、大肠杆 菌、粪肠球菌、溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、摩氏摩根菌）均为阴性，结果见说明书附图1， 表明该方法特异性良好。
[0110] 2.灵敏度检测
[0111] 阳性质粒稀释后，每管终浓度为2Xl〇D个至2X IO8个，扩增结果见图2及图3,表明该 方法灵敏度为2拷贝/反应。
【主权项】
1. 一种金黄色葡萄球菌的特异基因，其特征在于，其序列如SEQ ID NO:5所示。2. -种基于权利要求1所述基因的应用环介导等温扩增检测金黄色葡萄球菌的试剂 盒，其特征在于，由四条引物、BstDNA聚合酶、反应液、样品预处理液、显色液和阳性对照液 组成。3. 根据权利要求2所述的应用环介导等温扩增检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征 在于，其四条引物为： 外引物F3: GGTTCAACAGCACCAGCGA，如SEQ ID NO: 1 所示； 外引物B3:GCGGTTGTGATGGTGATGC，如SEQIDN0:2所示； 内引物FIP: TGCTACCGCCCTGATTTGAATTTTTACACAACCATCTAATCCGA，如SEQ ID NO: 3所示； 外引物BIP:TAAACAACAGAATACACCGGCCCTTTTCTGCTTAGAAGACTCGTTTG，如SEQIDN0:4 所示。4. 根据权利要求2所述的应用环介导等温扩增检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征 在于，其反应溶液为2.5mmol/L dNTPS、25mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，10mmol/L MgCh，内引 物F3和B3均为0.5mmol/L，外引物FIP和BIP均为2mmol/L;分装于无菌离心管。5. 根据权利要求2所述的应用环介导等温扩增检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征 在于，其样本预处理液为20mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH 8.0、1.2 %曲拉通和50U/ ml溶葡球菌素，分装于无菌离心管。6. 根据权利要求2所述的应用环介导等温扩增检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征 在于，其显色液为SYBR Green I。7. -种检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，针对权利要求1所述目的基因及权利 要求2所述试剂盒，按下列步骤进行： (1) 若原始材料为液体培养基样本，取lmL进行离心，lOOOOrpm 2min，去除上清;若为固 体培养基培养，直接挑取单菌落，生理盐水漂洗;将上述菌体样本中加入50uL样本预处理 液，37°C孵育lOmin后，煮沸5min，冷却后lOOOOrpm离心2min; (2) 在200yL反应管中配制反应体系，包括：反应溶液20yL、Bst DNA polymerase，0.5y L，4U，模板DNA2.5yL，显色液2yL;于62-68 °C反应60min;反应于PCR仪进行，或水浴锅，或恒 温金属浴上完成。 (3) 于紫外线观察，阳性反应显示为明显的黄色荧光。8. 根据权利要求7所述的一种检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，所述步骤(3) 中，反应管无需打开进行电泳即肉眼观察结果，阳性反应显示为黄绿色，阴性显示为橙色。9. 根据权利要求7所述的一种检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，检测灵敏度为 2拷贝/反应。10. 权利要求1所述基因在金黄色葡萄球菌检测方面的应用。
【文档编号】C12R1/445GK105861702SQ201610326472
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】宋玉竹, 陈秭君, 张阿梅, 韩芹芹, 陈强, 张金阳, 夏雪山
【申请人】昆明理工大学