研究前列腺癌复发和转移的方法

研究前列腺癌复发和转移的方法
【专利摘要】本发明公开了一种研究前列腺癌复发和转移的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于：采用含有前列腺组织的石蜡包埋组织样本，将所述样本制成HE染色组织切片，再将所述组织切片制成微阵列组织芯片，对所述微阵列组织芯片进行免疫组化染色，在显微镜下观察，根据各样本的着色细胞百分比范围获得着色细胞数分值，根据染色强度获得阳性着色强度系数，将着色细胞数分值乘以阳性着色强度系数得到MS4A8B基因的蛋白表达水平等级，根据MS4A8B基因的蛋白表达水平等级，或对MS4A8B基因的蛋白表达水平等级和MS4A8B基因的增殖指数进行相关性分析，从而判断前列腺癌复发率和转移率。本发明通过检测待检组织样本的前列腺癌基因的蛋白表达水平以及增殖指数，来研究前列腺癌的复发和转移。
【专利说明】
研究前列腺癌复发和转移的方法
[0001 ] 本申请是申请日为2013年6月24日，申请号为201310253540.6,发明名称为"前列 腺癌基因标记物在标记前列腺癌复发和转移中的用途及方法"的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明设及用于癌症诊断、研究和治疗的组合物和方法，包括但不限于癌症标记。 更具体地，本发明设及用作前列腺癌复发和转移标记的基因标记物。
[0003] 发明背景
[0004] 前列腺癌是欧美男性发病率最高的恶性肿瘤，在美国位于男性肿瘤死亡率的第二 位，次于肺癌。据统计，美国2012年有24，1740个新诊断的前列腺癌患者，占全部新发肿瘤患 者的29%;有2,8170人死于前列腺癌，占全部死于肿瘤的9%。近年来我国前列腺癌发病率 也不断升高。
[0005] 临床用于前列腺癌诊断及治疗后复发监测的唯一标志物是血清学标志物前列腺 特异性抗原(PSA)，但经PSA为基础的筛查发现的患者中有约1/3为进展缓慢、侵袭性低、无 临床症状的隐匿性前列腺癌，导致部分病例过度诊治，增加了不必要的痛苦和损伤，且筛查 对前列腺癌整体致死率并无实质性改善，提示许多隐匿性亚临床肿瘤的被诊断和治疗。运 使得研究重点由W往患病风险基因易感性研究转为早期诊断侵袭性前列腺癌和发现致死 性前列腺癌分子标签研究。
[0006] 肿瘤标志物的发现和合理应用是肿瘤早期发现、早期诊断的前提。迄今为止，全球 预测早期复发W及预后不佳的前列腺癌的标志物尚不成熟，对于新诊断前列腺癌患者，了 解疾病进展风险和指引治疗过程的工具也很有限。因此，检出侵袭性前列腺癌标志物的研 究己经成为前列腺癌运种具有高度的分子和临床异质性的肿瘤防治急需解决的的重大科 学问题。几项研究试图鉴别出前列腺癌进展高风险标志物，但多数未达到预期目的。
[0007] 目前，前列腺癌复发和转移高风险组织学标志物多为血清学标志物和组织学标志 物。
[000引1.血清学标志物
[0009] PSA衍生参数如PSA速率，倍增时间和密度可改善侵袭性前列腺癌检出敏感性。欧 洲前列腺癌研究国际的一项关于主动随访的实验结果显示PSA动态变化和密度是最适宜的 评估危险和个体化治疗的预测工具(Bul et al. ,2013);在缺乏二次活检和Gleason分级升 高等其他提示进展指标的情况下，单纯PSA不足W启动积极的治疗(Adamy et al. ,2011)。
[0010] 目前只有PSA密度进入2012年NCCN指南推荐用于预测低风险前列腺癌的参数，但 大多数医生仍只检测总PSA。诊断骨转移主要靠骨成像技术，早期不敏感且为侵袭性、费用 昂贵。血浆中来源于骨代谢的因子与前列腺癌骨转移高风险相关，反映了肿瘤和骨微环境 之间相互作用的骨重塑过程的失衡，包括骨形成标志物和骨吸收标志物两类，可用于诊断 骨转移但不能提前预知转移高风险。
[0011] 2.组织学标志物
[0012] 由于前列腺腺体是一系列致癌多基因事件发生的中屯、，因而组织学标志物对于进 展高风险的预测价值不能忽略。几项试图鉴别出前列腺癌进展高风险标志物的研究多数未 达到预期目的，尚无与进展高风险的组织学标志物应用于临床。
[0013] 近来的证据提示前列腺隐匿癌腺泡中并无关键的（癌基因）激活事件发生或其受 抑制故得W终生保持在亚临床状态。隐匿癌和临床癌之间的差异提示运些事件在前列腺癌 启动/进展早期可导致细胞衰老的发生，后者作为机体抑制肿瘤的机制起作用，尤其是肿瘤 抑制基因 NKX3.1下调是早期持续的事件并与前列腺上皮细胞增殖增加和不良预后相关 化in et al. ,2009)。目前认为由NKX3.1丢失引起的TMPRSS2-ERG转位代表着前列腺原位癌 早期事件的发生，随后PTEN、p27化ip)、RB、E-ca化erin和TP53的丢失和下调被认为是侵袭 早期和后期转移的原因 （Netto and Epstein,2010)。
[0014] 利用免疫组化和转基因技术的系列研究证实了 PTEN上游分子SMAD-4(-个TG邱/ 成骨蛋白信号轴成员）的下调W及cyclin Dl和细胞黏附分子OSteopontin的上调与前列腺 癌生化复发和转移相关(Ding et al. ,2011)。与外来物质W及致癌物的清除相关的谷脫甘 肤-S-转移酶启动子区的甲基化被认为是前列腺癌进展的早期事件，在一些病例中与 TMPRSS2转位和早期侵袭相关(Ahmed，2010)。组蛋白甲基化酶EZH2，可使DNA甲基化和组蛋 白修饰下调肿瘤抑制基因 RAS GTP酶，从而激活DAB2IP蛋白上调RAS和NF-KB表达促进肿瘤 增殖和转移，与前列腺癌更为恶化的疾病状态包括转移至关重要(Min et al. ,2010)。
[0015] 前列腺癌发病、进展和转移很多与AR突变相关，目前的治疗也是围绕阻断运条途 径进行。但由于AR是一个下游转录祀基因，前列腺癌的诊断和去势治疗效果并不完全依赖 于AR的表达，部分前列腺癌组织和细胞不表达AR;另外由雄激素敏感性前列腺癌化SPC)转 变为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)设及AR途径和部分非AR途径激活等多种复杂过程，有多种 基因、信号分子及表型改变参与，运些因素限制了AR在前列腺癌进展预测中的价值(Saraon e1:al. ,2011)。
[0016] 前列腺特异性膜抗原(PSMA)是由前列腺上皮细胞分泌的一种n型完整的跨膜糖 蛋白，被认为是一种前列腺上皮标志。有报道PSMA在高分级、分期前列腺癌W及激素难治性 前列腺癌患者的水平明显升高，与不良的临床预后有关。但由于在前列腺良性上皮中过高 的表达率，使得PSM在前列腺癌进展预测中的价值大大降低。
[0017] 然而，与其他肿瘤不同，前列腺癌往往多种病理组织形态并存甚至混杂着正常腺 体运一独特性使得前列腺癌进展和复发预测的组织标志物研究困难重重，尽管投入巨大但 鲜有进展。通过生物信息学的分析手段入手，从疾病进展模型出发，从基因整体水平研究前 列腺癌的发病机制将有可能寻找出更合适的前列腺癌进展的分子标志物，运将为前列腺癌 的诊断预防和治疗提供关键依据。

【发明内容】

[0018] 本发明的目的之一在于提供一种前列腺癌特异性表达的基因，用W标记前列腺癌 的发展情况，为制定前列腺癌的治疗决策提供依据。
[0019] 本发明的目的之二在于提供一种前列腺原发癌特异性表达的基因，用W标记前列 腺癌的复发，从而可W用来识别和判断前列腺癌的复发，为制定前列腺癌的治疗决策提供 依据。
[0020] 本发明的目的之=在于提供一种前列腺转移癌特异性表达的基因，用W标记前列 腺癌的转移，从而可W用来识别和判断前列腺癌的转移，为制定前列腺癌的治疗决策提供 依据。
[0021] 本发明的目的之四在于提供一种标记前列腺癌的复发和转移的方法，其通过一种 前列腺癌特异性表达的基因来特异性标记前列腺癌的发展情况，为制定前列腺癌的治疗决 策提供依据。
[0022] 本发明的目的之五在于提供一种标记前列腺癌的复发和转移的方法，其通过一种 前列腺原发癌特异性表达的基因来特异性标记前列腺癌的复发，从而可W用来识别和判断 前列腺癌的复发，为制定前列腺癌的治疗决策提供依据。
[0023] 本发明的目的之六在于提供一种标记前列腺癌的复发和转移的方法，其通过一种 前列腺转移癌特异性表达的基因来特异性标记前列腺癌的转移，从而可W用来识别和判断 前列腺癌的转移，为制定前列腺癌的治疗决策提供依据。
[0024] 本发明的目的之屯在于提供一种检测样本中前列腺癌特异性表达情况的试剂在 标记前列腺癌复发和转移中的应用，用W标记前列腺癌的发展情况，为制定前列腺癌的治 疗决策提供依据。
[0025] 本发明的目的之八在于提供一种检测样本中前列腺癌特异性表达情况的试剂在 标记前列腺癌复发和转移中的应用，用W标记前列腺癌的复发，从而可W用来识别和判断 前列腺癌的复发，为制定前列腺癌的治疗决策提供依据。
[0026] 本发明的目的之九在于提供一种检测样本中前列腺癌特异性表达情况的试剂在 标记前列腺癌复发和转移中的应用，用W标记前列腺癌的转移，从而可W用来识别和判断 前列腺癌的转移，为制定前列腺癌的治疗决策提供依据。
[0027] 为了实现上述目的，本发明公开了 MS4A8B基因在标记前列腺癌的复发和转移中的 应用。
[002引其中，所述MS4A8B基因在待检测组织样本中的表达情况是标记前列腺癌的指标。
[0029] 其中，所述MS4A8B基因在待检测组织样本中的表达情况越高，前列腺癌复发和转 移的概率越高。
[0030] 其中，对所得MS4A8B基因表达情况进行评分，给予MS4A8B基因表达评分，根据所得 MS4A8B基因表达评分，判断前列腺癌的复发和转移。
[0031] 基于本发明公开的MS4A8B基因在标记前列腺癌的复发和转移中的应用，本发明进 一步公开了一种MS4A8B基因标记前列腺癌的复发和转移的方法，其中所述MS4A8B基因在待 检测组织样本中的表达情况是标记前列腺癌的指标。
[0032] 优选的，所述MS4A8B基因标记前列腺癌的复发和转移的方法包含W下步骤：
[0033] 检测待检组织样本的MS4A8B基因表达情况；
[0034] 所述MS4A8B基因在待检测组织样本中的表达情况越高，前列腺癌复发和转移的概 率越高。
[0035] 优选的，所述MS4A8B基因标记前列腺癌的复发和转移的方法包含W下步骤：
[0036] 检测待检组织样本的MS4A8B基因表达情况；
[0037] 对所得MS4A8B基因表达情况进行评分，给予MS4A8B基因表达评分；
[0038] 根据所得MS4A8B基因表达评分，判断前列腺癌的复发和转移。
[0039] 其中，待检组织样本的MS4A8B基因表达可W通过，包括但不限于，使用DNA探针或 巧光探针直接检测前列腺癌组织DNA基因组中的MS4A8B基因，设计MS4A8B的PCR引物使用逆 转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MS4A8B的mRNA，使用免疫组化、免疫巧光、流式细胞等 方法检测转录MS4A8B基因的蛋白并对蛋白进行染色标记。
[0040] 其中，对所得MS4A8B基因表达情况，采用W下标准给予MS4A8B基因表达评分：
[0041 ] 基于待检测组织样本的MS4A8B基因表达的阳性细胞的百分比：
[0042] 阳性细胞数巧％为〇分，5%~25%为1分，26%~50%为2分，51 %~75%3分，76% ~100%为4分；
[0043] 基于待检测组织样本的MS4A8B基因表达的阳性强度系数：
[0044] 阴性(-)为0,弱阳性(+ )为0.25,阳性(++)为0.5,强阳性(+++)为1;
[0045] 阳性细胞的百分比的计分与阳性强度系数的计分相乘即为MS4A8B基因表达评分。
[0046] 其中，MS4A8B基因表达评分可换算为MS4A8B基因表达阳性等级：计分相乘<1分为 阴性(-)，计分相乘含1分为弱阳性(+ )，计分相乘含2分为阳性(++)，计分相乘含3分为强阳 性(+++)。
[0047] 其中，当采用免疫组化、免疫巧光、流式细胞等方法检测转录MS4A8B基因的蛋白并 对蛋白进行染色标记时，如采用免疫组化染色时，相应的，阳性细胞的百分比换算为着色细 胞数的百分比，而阳性强度系数换算为阳性着色强度系数:无色为0,淡黄色为0.25,栋黄色 为0.5,栋褐色为1。
[004引其中，根据所得MS4A8B基因表达评分判断前列腺癌的复发的标准为：
[0049] MS4A8B基因表达评分越高，前列腺癌复发和转移的概率越高。
[0050] 具体而言，MS4A8B基因表达评分每增加1分，前列腺癌复发的概率增加110.6%， MS4A8B基因表达评分每增加1分，发生远处转移的风险增加31.7%
[0051 ]优选的，根据所得MS4A8B基因表达评分判断前列腺癌的复发的标准为：
[0052] MS4A8B基因表达评分不大于1的为低度表达，其前列腺癌复发率低和转移率低；
[0053] MS4A8B基因表达评分大于1但不大于2的为中度表达，其前列腺癌复发率中和转移 率中.
[0054] MS4A8B基因表达评分大于2的为高度表达，其前列腺癌复发率高和转移率中。
[0055] 具体而言，MS4A8B基因表达评分不大于1分，一年无复发生存概率为97.22%，两年 无复发生存概率为91.00%，S年无复发生存概率为90.99% ;MS4A8B基因表达评分大于1分 但不大于2分，一年无复发生存概率为96.39 %，两年无复发生存概率为87.68 %，=年无复 发生存概率为67.84% ;MS4A8B基因表达评分大于2分，一年无复发生存概率为94.73%，两 年无复发生存概率为72.25 %，=年无复发生存概率为53.552 %。
[0056] 具体而言，MS4A8B基因表达评分小于或等于1分，发生远处转移的概率为 15.625% ;MS4A8B基因表达评分大于1分，发生远处转移的概率为23.30%。
[0057] 基于本发明公开的MS4A8B基因在标记前列腺癌的复发和转移中的应用，本发明进 一步公开了一种检测样本中MS4A8B基因表达情况的试剂在标记前列腺癌复发和转移中的 应用，其中所述MS4A8B基因在待检测组织样本中的表达情况是标记前列腺癌的指标。
[0058] 优选的，所述MS4A8B基因在待检测组织样本中的表达情况越高，前列腺癌复发和 转移的概率越高。
[0059] 优选的，所述判断前列腺癌复发和转移为对所得MS4A8B基因表达情况进行评分， 给予MS4A8B基因表达评分，根据所得MS4A8B基因表达评分，判断前列腺癌的复发和转移。
[0060] 其中，所述检测样本中MS4A8B基因表达情况的试剂，为基于检验出MS4A8B基因表 达情况而设计的特异性针对MS4A8B基因，MS4A8B基因的mRNA，MS4A8B基因的转录蛋白的基 因片段、基因嵌合物、RNA、特异性蛋白、多肤及含有上述物质的试剂，其包括但不限于为使 用DNA探针或巧光探针直接检测前列腺癌组织DNA基因组中的MS4A8B基因而配置的试剂，为 设计MS4A8B的PCR引物使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MS4A8B的mRNA而配置的 试剂，为使用免疫组化、免疫巧光、流式细胞等方法检测转录MS4A8B基因的蛋白并对蛋白进 行染色标记而配置的试剂。
[0061] 实验结果表明，MS4A8B基因由于具有W下生物学特征，其对于前列腺癌具有特异 性表达，可W作为基因标志物用于识别和诊断前列腺癌的复发和转移：
[0062] UMS4A8B基因在正常组织和癌组织中存在明显的表达差异，并且在不同癌组织中 存在明显的表达差异，因此MS4A8B基因是一个前列腺癌特异性表达的基因；
[0063] 2、MS4A8B基因在良性前列腺组织、癌旁组织、HPIN、前列腺癌原发灶和转移癌样本 中存在明显的表达差异，前列腺癌原发灶和转移癌样本中MS4A8B基因的表达远远高于良性 前列腺组织、癌旁组织、HPIN。因此MS4A8B基因是一个前列腺癌转移癌特异性表达基因；
[0064] 3、MS4A8B基因在正常前列腺组织细胞，前列腺原发癌组织细胞和前列腺癌转移灶 组织细胞中存在明显的表达差异，前列腺癌转移癌样本中MS4A8B基因的表达也高于前列腺 癌原发灶中MS4A8B基因的表达。因此MS4A8B基因是一个前列腺原发癌尤其是转移癌特异性 表达基因；
[0065] 4、MS4A8B基因通过作用于Gl-S细胞周期调控点促进细胞增殖，因此在前列腺癌进 展中扮演重要角色。
[0066] 实验结果进一步表明，MS4A8B基因对于前列腺癌具有特异性表达，特别对于前列 腺癌的原发癌和转移癌特具有异性表达，其中：
[0067] 1、MS4A8B基因表达评分越高，发生生化复发和转移的风险越高，其中
[0068] MS4A8B基因表达评分不大于1的为低度表达，其前列腺癌复发率低和转移率低；
[0069] MS4A8B基因表达评分大于1但不大于2的为中度表达，其前列腺癌复发率中和转移 率中.
[0070] MS4A8B基因表达评分大于2的为高度表达，其前列腺癌复发率高和转移率中；
[0071] 2、MS4A8B基因高度表达患者表现出易于复发的特点，而且运一特点随着时间的延 长越发明显；
[0072] 3、MS4A8B基因表达评分每增加1分，发生生化复发的风险增加110.6% ;
[0073] 4、154488基因表达评分每增加1分，发生远处转移的风险增加31.7%。
[0074] 因此，MS4A8B基因可W作为基因标志物用于识别和诊断前列腺癌术后复发和转 移，从而预测前列腺癌的复发和转移并制定治疗决策。
[0075] 因此，MS4A8B基因可W作为基因标志物用于识别和诊断前列腺癌术后复发和转 移，从而预测前列腺癌的复发和转移并制定治疗决策。
[0076] MS4A8B基因表达为低度表达或中度表达的早期前列腺癌患者，在行前列腺癌根治 术时有15.625 %的概率发生转移，而同期行前列腺根治的患者，MS4A8B基因高度表达者，其 发生远处转移的概率为23.3%。如果根据MS4A8B基因表达的情况给患者行前列腺癌淋己结 区域辅助放疗，順T(numbe;r need to化eat) = 13.29.也就是说，根据MS4A8B基因表达，每 淋己结清扫13个病人，有一个病人获益。
【附图说明】
[0077] 图1为MS4A8B基因的mRNA水平在前列腺癌和多种肿瘤和相应正常组织中的表达图 谱。
[0078] 图2A-2B为MS4A8B基因在前列腺细胞系中的差异性表达和4个前列腺癌细胞系中 MS4A8B下调后细胞周期检测结果的不意图。
[0079] 图3A-3F为LNCaP细胞系中下调MS4A8B基因后的增殖能力和细胞周期的变化的示 意图。
[0080] 图4为LNCaP细胞系中下调MS4A8B基因后的细胞周期相关蛋白的变化的示意图。 [0081 ]图5为PC3细胞系中下调MS4A8B基因后的转移能力变化的示意图。
[0082] 图6为PC3细胞系中下调MS4A8B基因后的EMT标志物的变化的示意图。
[0083] 图7A-7E为过表达MS4A8B基因对正常前列腺上皮RWPE-I细胞周期W及细胞增殖的 影响的示意图。
[0084] 图8A-8F为前列腺癌组织微阵列忍片样本中MS4A8B蛋白的免疫组化分析情况的示 意图。
[0085] 图9为MS4A8B基因在良性前列腺组织、癌旁组织、HPIN、前列腺癌原发灶和转移癌 样本中的表达图谱。
[0086] 图10A-10C为MS4A8B基因表达与Gleason评分、增殖指数、调亡指数的相关分析示 意图。
[0087] 图11为MS4A8B基因表达与无复发生存时间(RFS)的相关分析示意图。
【具体实施方式】
[0088] 鉴于前列腺癌与其他肿瘤不同，其往往多种病理组织形态并存甚至混杂着正常腺 体，使得前列腺癌进展、复发和转移预测的组织标志物研究困难重重。通过生物信息学的分 析手段，从前列腺癌疾病进展模型出发，从基因整体水平研究前列腺癌的发病机制，寻找出 更合适的前列腺癌进展的分子标志物，为前列腺癌的复发和转移预测提供基因标志物和判 断标准。
[0089] 基因标志物的筛选:MS4A8B基因
[0090] 基于此，采用课题组自主研发的生物信息学分析软件化taAnalysort)ne 1.0,对前 列腺癌进展模型的海量高通量数据进行多种类、多水平、多角度、多系列的筛选，分别计算 并多次比较前列腺癌组织和良性前列腺组织之间、配对的前列腺癌和癌旁组织等各个分组 之间、前列腺癌原发灶和转移灶之间的差异性蛋白，筛选到一个跨膜蛋白家族成员MS4A8B 基因，其在前列腺癌组织中特异性升高并与前列腺癌进展、复发和转移相关。
[0091] 后续研究中，Kaplan-Meier生存曲线分析表明前列腺癌组织高表达该蛋白的患者 较低表达该蛋白的患者，其无生化复发生存时间（RFS)明显缩短(p<0.05);进一步研究发现 该蛋白与患者Gleason评分、增殖指数呈正相关(Spearman分析)(於0.001)。
[0092] 在体外细胞模型研究中，在高表达该蛋白的前列腺癌细胞系中进行特异性敲除该 基因的表达，导致前列腺癌的增殖和转移能力下降；而且，在低表达该蛋白的正常前列腺上 皮细胞系中上调该基因的表达，导致前列腺上皮细胞的增殖和转移能力增强。
[0093] MS4A8B基因简介
[0094] MS4A8B，即人跨膜蛋白，全名membrane-spanning 4-domains ,subfamily A, memberSB，官方名字MS4A8，别名MS4A4; 4SPAN4; CD20L5oNCBI Gene ID: 83661 〇MS4A8B是含 有四个跨膜结构域的疏水性蛋白MS4A(Membrane-spanning 4-domains,subfamily A)家族 成员之一。
[00M]为进一步研究MS4A8B基因在人不同组织中的差异性表达，我们收集了常用的人多 种癌组织和相应的癌旁组织，通过PCR检测MS4A8B基因的mRNA在该人多种正常和肿瘤组织 中的表达，获取MS4A8B基因在人多种正常和肿瘤组织中的表达谱，并进行相应表达谱分析。
[0096] 所有统计学分析用SPSS 17.0统计软件进行处理。不同组间比较用独立t检验(常 变量），两组间均数的比较用t检验，分类变量的比较用X2检验，多组间比较用单因素方差分 析。数值用均数±SD表示。P<0.05认为有显著性差异，在统计学上有意义。
[0097] MS4A8B基因对前列腺癌的特异性表达
[0098] 我们收集了 13种常见肿瘤样本，包括前列腺癌样本，该13种常见肿瘤样本为经外 科切除的冰冻组织样本，均于-70°C保存于复旦大学附属肿瘤医院组织库(除非小细胞肺癌 外所有肿瘤样本)和大连医科大学附属第二医院（非小细胞肺癌样本），医学伦理委员会伦 理编号050432-4-1212B，所有患者均签署知情同意书。所有样本包括配对的癌旁组织，其中 前列腺癌样本行冰冻切片染色经病理医生确定癌腺体超过80%，并进行激光显微切割 化CM)获取癌及癌旁正常组织样本。
[0099] 采用RT-PCR检测该人13种正常和肿瘤组织中MS4A8B的mRNA水平，并采用管家基因 e-actin校正各样本中MS4A8B的mRNA表达强度，得到表1所示的人13种组织的MS4A8B表达谱 分析。
[0100] 夫1 .人n种纽织的MS4A8R其巧夫巧谱A析
[0101]
[0102] 根据表1所示的人13种组织的MS4A8B表达谱分析，得到如图1所示的，经RT-PCR检 巧化勺人13种正常和肿瘤组织中MS4A8B的mRNA水平，其中巧由是经管家基因 e-actin校正之后 的MS4A8B的表达强度。如图1所示，其中MS4A8B基因的mRNA水平在前列腺癌(p<0.05)和几种 正常组织包括肺(p<〇. 05)、结肠 (p<0.0 l)和宫颈(p<0.05)中明显升高。
[0103] 表1和图I的结果表明，MS4A8B基因的mRNA在大多数组织中不表达，仅在正常肺、结 肠和宫颈组织中表达。肿瘤组织中MS4A8B基因在前列腺癌过表达，与正常对照前列腺组织 升高3倍(p<0.05)，而在肾癌和胃癌中升高的幅度很小且无统计学意义(p〉0.05)。由此可见 MS4A8B基因在正常组织和癌组织中存在明显的表达差异，并且在不同癌组织中存在明显的 表达差异，因此MS4A8B基因是一个前列腺癌特异性表达的基因，其对于在存有多种病理组 织形态甚至混杂着正常腺体的前列腺癌组织中，特异性识别出前列腺癌具有重大价值。
[0104] 目前为止，临床广泛用于鉴别前列腺癌良恶性的组织学标记物是a甲酯基辅酶A消 旋酶(alpha methyla巧I-CoA racemase，AMACR，又称P504S)，其在前列腺癌组织中高表达， 但AMACR组织特异性不佳，在肾乳头状肿瘤、结肠直肠肿瘤、卵巢肿瘤、乳腺肿瘤、膀脫肿瘤、 肺肿瘤、淋己肿瘤和黑色素瘤等多种肿瘤组织中都过度表达，且与前列腺癌分期、Gleason 评分、切缘、生化复发等反映患者预后的指标相关。相比之下，MS4A8B在前列腺癌组织中的 高特异性提示我们可W特异识别前列腺组织来源肿瘤尤其是异位转移的前列腺癌组织。
[0105] MS4A8B基因对前列腺原发癌和转移癌的特异性表达
[0106] 我们使用免疫印迹分析(Western blot)的方法检测MS4A8B基因在前列腺细胞系 RWPE-I，22RV1，LNCaP，PC3和DU145中的表达。如图2A所示，结果表明MS4A8B基因高表达于4 个前列腺癌细胞系22RV1，LN化P，PC3和DU145,但正常前列腺永生化上皮RWPE-I细胞系中不 表达MS4A8B基因。
[0107] 该结果说明，MS4A8B基因在来源于前列腺原发癌的前列腺细胞系22RV1，来源于前 列腺癌转移灶的前列腺细胞系LN化P，PC3和DU145中高表达，而不表达于来源于正常前列腺 永生化上皮的前列腺细胞系RW阳-1中。由此可见MS4A8B基因在正常前列腺组织细胞，前列 腺原发癌组织细胞和前列腺癌转移灶组织细胞中存在明显的表达差异，因此MS4A8B基因是 一个前列腺癌特异性表达的基因，因此MS4A8B基因是一个前列腺癌的原发癌和转移癌特异 性表达基因，其对于前列腺癌的复发和转移的鉴别和诊断具有重大价值。
[0108] MS4A8B基因对前列腺癌细胞发展的特异性表达
[0109] 对于上述4种MS4A8B基因高表达的前列腺癌细胞系22RV1，LN化P，PC3和DU145，我 们针对MS4A8B基因的转录蛋白，设计了巧中siRNA#l-3,并转染上述4种前列腺癌细胞系进行 流式检测。如图3B所示，流式细胞细胞周期检测表明其中MS4A8B基因的siRNA#2显示了明显 的G0/G1期细胞比例升高及相应S期细胞比例下降。图2B的结果表明，MS4A8B沉默在多种前 列腺癌细胞系中均会导致Gl-S阻滞，MS4A8B基因的siRNA#2在4种前列腺癌细胞22RV1， LNCaP，PC3，DUl 45中导致最明显的MS4A8B基因的下调和G1-S阻滞。
[0110] 根据不同前列腺癌细胞系中MS4A8B基因的不同表达量差异和3种不同SiRNA对 MS4A8B基因的干扰效率，我们选取了 LN化P细胞作为细胞模型W及MS4A8B基因的S iRNA#2进 一步研究。
[0111] 如图3A所示，在LNCaP细胞中转染MS4A8B基因的S i RNA#2，其中MS4A8B基因表达被 有效抑制（免疫印迹），随后下调MS4A8B基因的蛋白后(Western blot)。如图3B和图3C所示， 采用流式检测，比较MS4A8B基因的siRNA#2转染后与未转染的细胞，结果表明MS4A8B基因蛋 白的下调导致前列腺癌细胞LNCaP细胞中的Gl-S阻滞，G0/G1细胞比例降低、S期细胞比例上 升。如图3D所示，采用EdU检测，结果表明MS4A8B基因蛋白的下调导致LN化P细胞中S期细胞 明显减少。如图3E所示，采用CCK8实验，实验均重复3次，结果均表明MS4A8B基因蛋白的下调 导致LNCaP细胞种S期细胞活性明显减弱W及生存率明显降低(P<0.05)。如图3F所示，采用 克隆形成实验，结果表明MS4A8B基因蛋白的下调导致克隆形成明显减少。
[0112] 上述结果表明下调MS4A8B基因的蛋白导致前列腺癌增殖减少。
[0113] 其中，Gl-S细胞周期调控点控制真核细胞从Gl期进入S期，在运个调控点处， 切Clin D1、切ClinEl和其他几种细胞周期相关蛋白p21，p27/Kipl起作用。基于此，我们进 一步检测了细胞周期相关蛋白和表示细胞增殖活性的PCNA蛋白的表达情况。如图4所示，结 果表明，MS4A8B基因下调后，LNCaP细胞较阴性对照细胞显示了更低的切C1 in D1，切C1 in El，p21and PCNA水平，也就是说LNCaP细胞在MS4A8B基因下调后，切Clin D1，切Clin E1， p21和PCNA蛋白明显下调，说明伴随LNCaP细胞增殖能力下降的标志物也发生显著改变。
[0114] 转移性前列腺癌患者最普遍的转移部位是骨转移，PC3细胞系其中最常用的一种 细胞系模型，该细胞系高表达MS4A8B基因，因而我们选取了的PC3细胞系作为细胞模型进行 MS4A8B基因的转移功能研究。如图5所示，我们对PC3细胞进行MS4A8B的RNAi，转染48小时后 进行划痕实验，发现下调MS4A8B蛋白后，运些前列腺癌细胞的迁移能力明显减弱。
[0115] 基于此，我们进一步检测了转移相关蛋白的表达情况，如图6所示，我们发现，表明 转移能力较强、EMT表型明显的PC3细胞在MS4A8B下调后，波形蛋白（Vimentin)也发生了非 常明显的下调，说明伴随PC3细胞转移能力下降的EMT标志物也发生显著改变。
[0116] 在RW阳-1细胞中上调MS4A8B基因的蛋白，促进细胞增殖，W进一步阐明MS4A8B基 因在前列腺癌中的角色。我们将构建的带有MS4A8B开放性阅读框(ORF)的过表达载体转染 进不表达MS4A8B基因的永生化正常前列腺上皮RW阳-1细胞中，并与对照组相比。如图7A所 示，RWPE-I细胞转染MS4A8B基因过表达载体后，MS4A8B基因被有效地过表达，转染MS4A8B基 因过表达载体的RWPE-I细胞MS4A8B基因的表达量明显升高。如图7B和图7C所示，采用流式 检测细胞周期，RWPE-I细胞转染MS4A8B基因过表达载体后，与转染阴性对照载体相比，Gl/ GO期细胞比例减少，S期细胞比例增力日。如图7D所示，采用CCK8实验，RWPE-1细胞转染MS4A8B 基因过表达载体后，与转染阴性对照载体相比，细胞活性增加。如图7E所示，采用克隆形成 实验，实验均重复3次，RWPE-I细胞转染MS4A8B基因过表达载体后，与转染阴性对照载体相 比，克隆形成明显增加，P<〇. 05。
[0117] 上述结果表明MS4A8B基因通过作用于Gl-S细胞周期调控点促进细胞增殖，因此在 前列腺癌进展中扮演重要角色，其对于前列腺癌的复发和转移的鉴别和诊断具有重大价 值。
[011引 MS4A8B基因作为前列腺癌的基因标志物
[0119] 综上所述，MS4A8B基因由于具有W下生物学特征，其对于前列腺癌具有特异性表 达，可W作为基因标志物用于识别和诊断前列腺癌的复发和转移：
[0120] UMS4A8B基因在正常组织和癌组织中存在明显的表达差异，并且在不同癌组织中 存在明显的表达差异，因此MS4A8B基因是一个前列腺癌特异性表达的基因；
[0121] 2、MS4A8B基因在良性前列腺组织、癌旁组织、HPIN、前列腺癌原发灶和转移癌样本 中存在明显的表达差异，前列腺癌原发灶和转移癌样本中MS4A8B基因的表达远远高于良性 前列腺组织、癌旁组织、HPIN。因此MS4A8B基因是一个前列腺癌转移癌特异性表达基因；
[0122] 3、MS4A8B基因在正常前列腺组织细胞，前列腺原发癌组织细胞和前列腺癌转移灶 组织细胞中存在明显的表达差异，前列腺癌转移癌样本中MS4A8B基因的表达也高于前列腺 癌原发灶中MS4A8B基因的表达。因此MS4A8B基因是一个前列腺原发癌尤其是转移癌特异性 表达基因；
[0123] 4、MS4A8B基因通过作用于Gl-S细胞周期调控点促进细胞增殖，因此在前列腺癌进 展中扮演重要角色。
[0124] 因此，本发明公开了MS4A8B基因在标记前列腺癌的复发和转移中的应用。其中，所 述MS4A8B基因在待检测组织样本中的表达情况是标记前列腺癌的指标。其中，所述MS4A8B 基因在待检测组织样本中的表达情况越高，前列腺癌复发和转移的概率越高。其中，对所得 MS4A8B基因表达情况进行评分，给予MS4A8B基因表达评分，根据所得MS4A8B基因表达评分， 判断前列腺癌的复发和转移。
[0125] 根据本发明公开的MS4A8B基因在标记前列腺癌的复发和转移中的应用，本发明进 一步公开了一种检测样本中MS4A8B基因表达情况的试剂在标记前列腺癌复发和转移中的 应用，其中所述MS4A8B基因在待检测组织样本中的表达情况是标记前列腺癌的指标。其中， 所述MS4A8B基因在待检测组织样本中的表达情况越高，前列腺癌复发和转移的概率越高。 其中，所述判断前列腺癌复发和转移为对所得MS4A8B基因表达情况进行评分，给予MS4A8B 基因表达评分，根据所得MS4A8B基因表达评分，判断前列腺癌的复发和转移。
[01%] 所述检测样本中MS4A8B基因表达情况的试剂，为基于检验出MS4A8B基因表达情况 而设计的特异性针对MS4A8B基因，MS4A8B基因的mRNA，MS4A8B基因的转录蛋白的基因片段、 基因嵌合物、RNA、特异性蛋白、多肤及含有上述物质的试剂，其包括但不限于为使用DNA探 针或巧光探针直接检测前列腺癌组织DNA基因组中的MS4A8B基因而配置的试剂，为设计 MS4A8B的PCR引物使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MS4A8B的mRNA而配置的试 剂，为使用免疫组化、免疫巧光、流式细胞等方法检测转录MS4A8B基因的蛋白并对蛋白进行 染色标记而配置的试剂。
[0127] 根据本发明公开的MS4A8B基因在标记前列腺癌的复发和转移中的应用W及检测 样本中MS4A8B基因表达情况的试剂在标记前列腺癌复发和转移中的应用，本发明进一步公 开了一种MS4A8B基因标记前列腺癌的复发和转移的方法，其中所述MS4A8B基因在待检测组 织样本中的表达情况是标记前列腺癌的指标，所述MS4A8B基因在待检测组织样本中的表达 情况越高，前列腺癌复发和转移的概率越高。
[0128] 所述MS4A8B基因标记前列腺癌的复发和转移的方法包含W下步骤：
[0129] 检测待检组织样本的MS4A8B基因表达情况；
[0130] 对所得MS4A8B基因表达情况进行评分，给予MS4A8B基因表达评分；
[0131] 根据所得MS4A8B基因表达评分，判断前列腺癌的复发和转移。
[0132] 其中，待检组织样本的MS4A8B基因表达可W通过，包括但不限于，使用DNA探针或 巧光探针直接检测前列腺癌组织DNA基因组中的MS4A8B基因，设计MS4A8B的PCR引物使用逆 转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MS4A8B的mRNA,使用免疫组化、免疫巧光、流式细胞等 方法检测转录MS4A8B基因的蛋白并对蛋白进行染色标记。
[0133] 其中，对所得MS4A8B基因表达情况，采用W下标准给予MS4A8B基因表达评分：
[0134] 基于待检测组织样本的MS4A8B基因表达的阳性细胞的百分比：
[0135] 阳性细胞数巧％为0分，5%~25%为1分，26%~50%为2分，51 %~75%3分，76% ~100%为4分；
[0136] 基于待检测组织样本的MS4A8B基因表达的阳性强度系数：
[0137] 阴性(-)为0,弱阳性(+ )为0.25,阳性(++)为0.5,强阳性(+++)为1;
[0138] 阳性细胞的百分比的计分与阳性强度系数的计分相乘即为MS4A8B基因表达评分。
[0139] 其中，MS4A8B基因表达评分可换算为MS4A8B基因表达阳性等级：计分相乘<1分为 阴性(-)，计分相乘分为弱阳性(+ )，计分相乘含2分为阳性(++)，计分相乘含3分为强阳性(+ ++)。
[0140] 其中，当采用免疫组化、免疫巧光、流式细胞等方法检测转录MS4A8B基因的蛋白并 对蛋白进行染色标记时，如采用免疫组化染色时，相应的，阳性细胞的百分比换算为着色细 胞数的百分比，而阳性强度系数换算为阳性着色强度系数:无色为0,淡黄色为0.25,栋黄色 为0.5,栋褐色为1。
[0141] 其中，根据所得MS4A8B基因表达评分判断前列腺癌的复发的标准为:MS4A8B基因 表达评分越高，前列腺癌复发和转移的概率越高。具体而言，MS4A8B基因表达评分每增加1 分，前列腺癌复发的概率增加110.6% ,MS4A8B基因表达评分每增加1分，发生远处转移的风 险增加31.7%
[0142] 优选的，根据所得MS4A8B基因表达评分判断前列腺癌的复发的标准为：
[0143] MS4A8B基因表达评分不大于1的为低度表达，其前列腺癌复发率低和转移率低；
[0144] MS4A8B基因表达评分大于1但不大于2的为中度表达，其前列腺癌复发率中和转移 率中.
[0145] MS4A8B基因表达评分大于2的为高度表达，其前列腺癌复发率高和转移率中。
[0146] 具体而言，MS4A8B基因表达评分不大于1分，一年无复发生存概率为97.22%，两年 无复发生存概率为91.00%，S年无复发生存概率为90.99% ;MS4A8B基因表达评分大于1分 但不大于2分，一年无复发生存概率为96.39 %，两年无复发生存概率为87.68 %，=年无复 发生存概率为67.84% ;MS4A8B基因表达评分大于2分，一年无复发生存概率为94.73%，两 年无复发生存概率为72.25 %，=年无复发生存概率为53.552 %。
[0147] 具体而言，MS4A8B基因表达评分小于或等于1分，发生远处转移的概率为 15.625% ;MS4A8B基因表达评分大于1分，发生远处转移的概率为23.30%。
[0148] 具体而言，我们针对140例石蜡包埋前列腺癌组织样本，采用上述步骤，检测140例 石蜡包埋前列腺癌组织样本的MS4A8B基因表达情况，标记140例石蜡包埋前列腺癌组织样 本的前列腺癌复发和转移情况。
[0149] 1、取样
[0150] 采用含有前列腺组织的石蜡包埋组织样本，其来自复旦大学附属肿瘤医院2009年 1月~2010年12月收治的140例术前未经内分泌治疗和放疗的临床局限性前列腺癌患者，行 前列腺癌根治性切除术的组织样本W及作为对照的8例膀脫癌行膀脫根治性切除术的前列 腺样本，经10%福尔马林固定石蜡包埋，年龄60~89岁，平均72.3岁。
[0151] 根据2002年AJCC TOM分期，病理分级采用Gleason评分。全部肥切片经病理医生复 片，并标记选择良性前列腺组织、高分级前列腺上皮内瘤变化GPIN)、前列腺癌、转移淋己结 组织等代表性肿瘤区域作为组织微阵列忍片的模板。
[0152] 肥染色法，又称苏木精-伊红染色法化emato巧lin-eosin staining)，石蜡切片技 术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体 着紫蓝色;伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。肥染色法是组织 学、胚胎学、病理学教学与科研W及临床病理实践中最基本、使用最广泛的技术方法。
[0153] 此外，收集所有患者的临床和病理特征数据。
[0154] 2、组织切片和组织微阵列忍片制作
[0155] 事先将所有样本的皿染色切片和对应蜡块置于显微镜下寻找目的取样区域并在 蜡块上标记，规划好微阵列忍片中的位置制成Excel表。使用Quick-Ray钻头将标记区域从 蜡块取下，蜡块水平置于桌面，紧握Quick-Ray,如ick-Ray探针垂直于标记区域，如ick-Ray 探针插入蜡块慢慢取下约5mm深度蜡柱。使用Quick-Ray探针所取下蜡柱（组织块）打入由 UNITMA设计的recipient block。预制蜡块放置于水平的桌面，从供体蜡块萃取的组织垂直 的打入预制蜡块的桐，慢慢的使用Quick-Ray的钻头垂直打入约4mm，使用抹平的工具或手 去调整所有萃取的组织突出的高度。将预制蜡块(需要切的片向下)放置在包埋模盘内放置 于烘箱60摄氏度30分钟（需要切的部分即抹平的一面向下）。待蜡块成透明状取出，在加入 白蜡，将预制蜡块包埋。预制蜡块置于冷盘让蜡块冷固后，切片机切片(约4微米）。
[0156] 切片的所有的病理学指标均由病理科资深医生确定。
[0157] 组织微阵列（tissue microarrays,TMAs)，也称组织忍片（tissue chip)，是生物 忍片技术的一个重要分支，是将许多不同个体组织标本W规则阵列方式排布于同一载玻片 上，进行同一指标的原位组织学研究。该技术自1998年问世W来，W其大规模、高通量、标准 化等优点得到大范围的推广应用。组织忍片与基因忍片和蛋白质忍片一起构成了生物忍片 系列，使人类第一次能够有效利用成百上千份组织标本，在基因组、转录组和蛋白质组=个 水平上进行研究，被誉为医学、生物学领域的一次革命。组织忍片技术可W与其他很多常规 技术如免疫组织化学（IHC)、核酸原位杂交（ISH)、巧光原位杂交(FISH)、原位PCR等结合应 用，它的应用领域正在不断地拓展。作为一项新兴的生物学研究技术，正W它绝对的优越性 展示着自己的潜力。
[015引 3、MS4A8B基因表达、MS4A8B基因表达评分和MS4A8B基因表达阳性等级
[0159] 在上述步骤中，通过石蜡包埋前列腺癌组织样本的切片的微阵列忍片的免疫组化 染色，进行MS4A8B基因的蛋白水平的表达研究。
[0160] 免疫组织化学染色采用MaxVisionTMplus免疫组织化学试剂盒化口-5020)购自福 州迈新生物技术有限公司，参照试剂盒使用说明书操作进。10%福尔马林固定、石蜡包埋的 切片经二甲苯脱蜡后，梯度乙醇依次水化后置双蒸水中。0.OlmM化is缓冲液(pH 6.0)121 °C加热20分钟修复抗原，室溫自然冷却后用含1 %BSA的化is缓冲液室溫处理20分钟封闭内 源性免疫原。抗MS4A8B基因兔多克隆抗体(稀释度为1:50)和PCNA鼠单克隆抗体(稀释度为 1:500)4°C过夜。皿P-mer羊抗兔/鼠 IgG二抗解育，DAB显色。通用型生物素标记的羊抗小鼠 IgG37°C解育20分钟，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。
[0161] 免疫组化染色，是应用免疫学基本原理一一抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性 结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（巧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确 定组织细胞内抗原（多肤和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学 技术（immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术（immuno巧tochemistry)。
[0162] MS4A8B基因阳性表达为细胞胞膜和(或)胞浆上呈现栋黄色颗粒，采用半定量结果 判断，根据W下标准，分别对上述个样本镜下阳性细胞的百分比和染色强度给予评分：
[0163] 1、着色细胞数:每张切片上观察5个高倍视野（X200)，计数阳性细胞百分比，阳性 细胞数<5%为0分，5%~25%为1分，26%~50%为2分，51 %~75%3分，76%~100%为4 分；
[0164] 2、阳性着色强度系数:无色为0,淡黄色为0.25,栋黄色为0.5,栋褐色为1;
[0165] 3、着色细胞数的计分与阳性着色强度系数的计分，二者计分相乘即为MS4A8B基因 表达评分，可换算为MS4A8B基因表达阳性等级:计分相乘<1分为阴性(-)，计分相乘M分为 弱阳性(+ )，计分相乘含2分为阳性(++)，计分相乘含3分为强阳性(+++)。
[0166] 由此得到140例石蜡包埋前列腺癌组织样本的MS4A8B基因表达评分和MS4A8B基因 表达阳性等级。
[0167] 4、PCNA阳性反应
[0168] 在上述步骤中，通过石蜡包埋前列腺癌组织样本的切片的微阵列忍片的TUN化调 亡实验，进行PCNA阳性反应的表达研究。
[0169] 使用德国罗氏TUNH^调亡检测试剂盒(No. 11684817910)。二甲苯脱蜡10分钟，换新 鲜的二甲苯再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟，90%乙醇2分钟，70%乙醇2分钟，蒸馈水2分 钟。滴加20g/ml不含D化Se的蛋白酶K ,20-37 °C作用15-30分钟，PBS缓冲溶液洗涂3次。在用 PBS配制的3%过氧化氨溶液(3%H202in PBS)室溫解育封闭10分钟，W灭活切片内源的过 氧化物酶，PBS洗涂3次。生物素标记，37°C解育60分钟。PBS洗涂1次，滴加标记反应终止液， 室溫解育10分钟，PBS洗涂3次。样品的DAB显色，苏木素复染。
[0170] 增殖细胞核抗原（ProIiferatingCeIlNucIearAntigen简称PCNA)由Miyachi等于 1978年在SLE(系统性红斑狼疮)患者的血清中首次发现并命名，因其只存在于正常增殖细 胞及肿瘤细胞内而得名，W后的研究发现PCNA与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动 上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标，因此近年来掀起了对PCNA研究的热潮，尤 其在肿瘤学方面的研究。
[0171] W细胞核褐色染色作为阳性调亡细胞，计算阳性调亡细胞所占总数的百分比作为 调亡指数(Al )，具体计算是每个样本计数至少5个视野，每个视野计数1000个细胞，取平均 值作为调亡指数。
[0172] PCNA阳性反应为位于细胞核内的栋黄色均匀颗粒，每个样本切片观察至少5个有 代表性高倍视野，观察不少于500个细胞中阳性染色细胞，PCNA表达均W细胞核表达阳性细 胞所占总细胞数的百分率计算：
[0173] 根据得到的140例石蜡包埋前列腺癌组织样本的MS4A8B基因表达评分，判断各样 本前列腺癌的复发和转移概率。
[0174] MS4A8B基因表达与前列腺癌的复发转移关系的统计学分析
[0175] 由于MS4A8B基因是一个前列腺癌特异性表达基因，特别是前列腺原发癌和转移癌 特异性表达基因，MS4AS8B基因可W作为前列腺癌生化复发的独立预测因子，其表达情况可 W用于预测前列腺癌复发率和转移率，也就是说，当代表MS4A8B基因表达情况的MS4A8B基 因表达评分较低时，其前列腺癌复发率和转移率低，当代表MS4A8B基因表达情况的MS4A8B 基因表达评分较高时，其前列腺癌复发率和转移率高。
[0176] 因此将MS4A8B基因表达评分分为3组：
[0177] MS4A8B基因表达评分不大于1的为低度表达，其前列腺癌复发率低和转移率低；
[0178] MS4A8B基因表达评分大于I但不大于2的为中度表达，其前列腺癌复发率中和转移 率中.
[0179] MS4A8B基因表达评分大于2的为高度表达，其前列腺癌复发率高和转移率中。
[0180] 对于通过MS4A8B基因表达评分来判断前列腺癌的复发和转移概率的标准，我们对 上述140例石蜡包埋前列腺癌组织样本的患者进行了为期3-4年的随访跟踪，随后采用统计 学方法分析处理了上述140例石蜡包埋前列腺癌组织样本的MS4A8B基因表达评分W及相应 患者的实际复发和转移情况。
[0181] 所有统计学分析用SPSS 17.0统计软件进行处理。不同组间比较用独立t检验(常 变量），两组间均数的比较用t检验，分类变量的比较用X2检验，多组间比较用单因素方差分 析。数值用均数±SD表示。P<0.05认为有显著性差异，在统计学上有意义。良性、癌旁、癌前 病变、前列腺癌及转移癌之间MS4A8B基因表达水平不属于正态分布故使用非参数Wilcoxon 符号秩和检验或Mann-Whitney U检验。Spearman等级相关系数分析用于分析MS4A8B基因表 达与Gleason评分、增殖指数和调亡指数的相关性。单因素和多因素分析用于评估MS4A8B基 因预测临床参数的价值。Kaplan-Meier法用于绘制无复发生存时间（RFS)曲线，双侧log-rank 法评估 MS4A8B 和 WS 统计学相关性。
[0182] 随访计算到最后一次临床无肿瘤复发随访。Wp<0.05差异才被认为具有显著性， 并在统计学上有意义。每一项分析至少有=次结果。数值用均数±SD表示。
[0183] 1、如图8A-8F所示的是前列腺癌组织微阵列忍片样本中MS4A8B蛋白的免疫组化分 析情况，其中褐色代表MS4A8B基因阳性表达。其中，图8A为良性前列腺组织不表达MS4A8基 因的情况。图8B中，左侧为前列腺癌表达MS4A8B基因，右侧为前列腺癌旁腺体不表达MS4A8B 基因，白色箭头显示为PIN,轻度表达MS4A8B基因，其Gleason评分为，3+3 = 6。
[0184] 图8C~8E中，不同Gleason评分的前列腺癌原发灶，临床局限性前列腺癌术后样本 中分级由中等到高，其中图8C的样本为Gleason评分，3+3 = 6,图8D的样本为为Gleason评 分，4+3 = 7,图8E的样本为Gleason评分，4+4 = 8。图8F中的前列腺转移癌样本(淋己结转移 癌），显不了最强的MS4A8B基因染色。
[01化]对于上述140例石蜡包埋前列腺癌组织样本的免疫组化染色的MS4A8B基因表达情 况进行统计学分析，得到MS4A8B基因在良性前列腺组织、癌旁组织、HPIN、前列腺癌原发灶 和转移癌样本中的表达量统计学结果。所有数据W均值+标准误显示，所有五组俩俩之间比 较均显示显著性差异(Wilcoxon符号秩和检验，P值均<.OOl)。
[0186] 2、根据上述表达量统计学结果，得到如图9所示的MS4A8B基因在良性前列腺组织、 癌旁组织、HPIN、前列腺癌原发灶和转移癌样本中的表达图谱。图9表明，MS4A8B基因高度表 达于前列腺癌原发癌和转移癌中，因此MS4A8B基因是一个前列腺癌的原发癌和转移癌特异 性表达基因，采用MS4A8B基因作为标记物，可W准确有效识别和判定前列腺癌的原发癌和 转移癌，其在前列腺癌的复发和转移识别和诊断中有重要作用。
[0187] 3、根据上述结果，研究MS4A8B基因表达与前列腺癌临床病理特征之间的联系。分 析140例石蜡包埋前列腺癌组织样本的患者临床特征，其中全部前列腺癌患者的无生化复 发(bRFR)的比率是75%，PSA和Gleason评分均与生化复发相关说明本组样本取样、统计及 随访数据较为客观。
[0188] 如图10A-10C所示的是MS4A8B基因表达与Gleason评分、增殖指数、调亡指数的相 关分析。
[0189] 如图IOA所示，MS4A8B基因表达与Gleason评分正相关(Spearman等级相关分析，相 关系数0.206 .OOl)。如图IOB所示，MS4A8B基因表达与增殖指数呈正相关(Spearman等级 相关分析，相关系数0.411，於.001)。如图IOC所示，MS4A8B基因表达与和调亡指数呈正相关 (Spearman等级相关分析，相关系数0.213，p<. OOl)。
[0190] 4、进一步分析MS4A8B基因表达与前列腺癌的临床病理特征，如表4所示。
[0191] 表4MS4A8B蛋白表达与临床病理参数的单因素和多因素相关分析
[0192]
[0193]
[0194] *Crude 0R，p<0.05
[01 巧]^adjusted 0R,ad_justed OR for age,GS,PSA at dia即osis,T s1:age,p<0.05
[0196] 单因素分析表明MS4A8B基因是血管侵犯（OR= 1.376，95%CI，1.025to 1.846，p< .05)、盆腔淋己结转移（03=1.407,95%(：1，1.0481〇 1.890，口<.05)和生化复发（0尺= 1.478，95 % Cl，1.068to 2.046，p<. 05)的预测因子。年龄，Gleason评分，诊断时PSA水平和T 分期矫正后的多因素分析表明，MS4A8B基因是生化复发的独立预测因子(OR=I. 730,95% CI,1.196to 2.503,p<.01)〇
[0197] 5、根据W上随访结果W及临床特征，进行MS4A8B基因表达与无复发生存时间 (RFS)的相关分析。
[0198] 如前所述MS4A8B基因表达评分分为3组：
[0199] MS4A8B基因表达评分不大于1的为低度表达，其前列腺癌复发率低和转移率低；
[0200] MS4A8B基因表达评分大于1但不大于2的为中度表达，其前列腺癌复发率中和转移 率中.
[0201] MS4A8B基因表达评分大于2的为高度表达，其前列腺癌复发率高和转移率中。
[0202] 按照上述MS4A8B基因表达评分将总共140例患者分为3组，平均随访38.2个月，低 和高表达MS4A8B两组之间显示了统计学差异（双侧log-rank法，p<0.05)，其他两种比较未 显示统计学差异（低表达VS.中度表达，P = O. 306;中度表达VS.高表达，P = O. 460)。采用 Kaplan-Meier生存曲线处理前列腺癌患者经根治术后不同MS4A8B基因表达水平之间的关 系，得到图11。
[0203] 根据图11所示，W上结果提示尽管中位随访时间仅3.61年，但仍可得出MS4A8B基 因是前列腺癌患者行根治术后生化复发的独立预测因子的结论。
[0204] 6、140例石蜡包埋前列腺癌组织样本的MS4A8B基因表达结果分析
[0205] 根据随访结果W及临床特征，进行MS4A8B基因表达与无复发生存时间（RFS)的相 关分析。总共140例患者按照MS4A8B基因表达水平分为3组(0或1为低度表达;2为中度表达； 3或4为高度表达），平均随访38.2个月。统计分析140例石蜡包埋前列腺癌组织样本的每一 个样本MS4A8B基因表达情况W及该样本对应的患者的前列腺癌复发情况的跟踪数据，得到 表5所示的统计数据。
[0206] 表5MS4A8B基因表达情况与复发转移关系表
[02。71
[020引其中，MS4A8B基因低度表达和高度表达两组之间显示了统计学差异（双侧log-rank 法， p<0.05) ，其他两种比较未显示统计学差异 (低度表达 VS. 中度表达,P=O.306; 中度 表达VS.高度表达，P = O.460)。采用Kaplan-Meier生存曲线处理前列腺癌患者经根治术后 不同MS4A8B基因表达水平之间的关系，得到图11。
[0209] 根据图11所示，W上结果提示尽管中位随访时间仅3.61年，但仍可得出MS4A8B基 因是前列腺癌患者行根治术后生化复发的独立预测因子的结论。
[0210] 表5的统计数据进一步验证了 MS4A8B基因表达评分与前列腺癌复发率和转移率之 间的关系，即：
[0211] UMS4A8B基因表达评分不大于1的低度表达患者，其临床一年无复发生存概率 97.22%、二年无复发生存概率91.00%、=年无复发生存概率90.99%，表明其前列腺癌复 发率低和转移率低；
[0212] 2、MS4A8B基因表达评分大于1但不大于2的中度表达患者，其临床一年无复发生存 概率96.39%、二年无复发生存概率87.68%、=年无复发生存概率67.84%，表明其前列腺 癌复发率中和转移率中；
[0213] 3、MS4A8B基因表达评分大于2的高度表达患者，其临床一年无复发生存概率 94.73%、二年无复发生存概率72.25%、=年无复发生存概率53.552%，表明其前列腺癌复 发率高和转移率中。
[0214] 综上所述，结合表5和图11，基于140例石蜡包埋前列腺癌组织样本的MS4A8B基因 表达情况，进一步证明了，MS4A8B基因对于前列腺癌具有特异性表达，特别对于前列腺癌的 原发癌和转移癌特具有异性表达，其中：
[0215] 1、MS4A8B基因表达评分越高，发生生化复发和转移的风险越高，其中
[0216] MS4A8B基因表达评分不大于I的为低度表达，其前列腺癌复发率低和转移率低；
[0217] MS4A8B基因表达评分大于1但不大于2的为中度表达，其前列腺癌复发率中和转移 率中.
[021引 MS4A8B基因表达评分大于2的为高度表达，其前列腺癌复发率高和转移率中；
[0219] 2、MS4A8B基因高度表达患者表现出易于复发的特点，而且运一特点随着时间的延 长越发明显；
[0220] 3、MS4A8B基因表达评分每增加1分，发生生化复发的风险增加110.6% ;
[0221] 4、154488基因表达评分每增加1分，发生远处转移的风险增加31.7%。
[0222] 因此，MS4A8B基因可W作为基因标志物用于识别和诊断前列腺癌术后复发和转 移，从而预测前列腺癌的复发和转移并制定治疗决策。
[0223] MS4A8B基因表达为低度表达或中度表达的早期前列腺癌患者，在行前列腺癌根治 术时有15.625 %的概率发生转移，而同期行前列腺根治的患者，MS4A8B基因高度表达者，其 发生远处转移的概率为23.3%。如果根据MS4A8B基因表达的情况给患者行前列腺癌淋己结 区域辅助放疗，順T(numbe;r need to化eat) = 13.29.也就是说，根据MS4A8B基因表达，每 淋己结清扫13个病人，有一个病人获益。
【主权项】
1. 一种研究前列腺癌复发和转移的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于:采用 含有前列腺组织的石蜡包埋组织样本，将所述样本制成HE染色组织切片，再将所述组织切 片制成微阵列组织芯片，对所述微阵列组织芯片进行免疫组化染色，在显微镜下观察，根据 各样本的着色细胞百分比范围获得着色细胞数分值，根据染色强度获得阳性着色强度系 数，将着色细胞数分值乘以阳性着色强度系数得到MS4A8B基因的蛋白表达水平等级，根据 MS4A8B基因的蛋白表达水平等级判断前列腺癌复发率和转移率； 所述着色细胞百分比精确到百分位，所述着色细胞百分比〈5%时，着色细胞数分值为0 分;所述着色细胞百分比为5%~25%时，着色细胞数分值为1分;所述着色细胞百分比为 26 %~50 %时，着色细胞数分值为2分;所述着色细胞百分比为51 %~75 %时，着色细胞数 分值为3分;所述着色细胞百分比为76%~100%时，着色细胞数分值为4分； 所述染色强度呈无色时，阳性着色强度系数为0;所述染色强度呈淡黄色时，阳性着色 强度系数为〇. 25;所述染色强度呈棕黄色时，阳性着色强度系数为0.5;所述染色强度呈棕 褐色时，阳性着色强度系数为1; 所述着色细胞数分值乘以阳性着色强度系数〈1分时，MS4A8B基因的蛋白表达水平等级 为阴性;着色细胞数分值乘以阳性着色强度系数2 1分且<2分时，MS4A8B基因的蛋白表达 水平等级为弱阳性;着色细胞数分值乘以阳性着色强度系数2 2分且<3分时，MS4A8B基因 的蛋白表达水平等级为阳性;着色细胞数分值乘以阳性着色强度系数2 3分时，MS4A8B基因 的蛋白表达水平等级为强阳性。2. 根据权利要求1所述的研究前列腺癌复发和转移的方法，其特征在于:所述免疫组化 染色是采用免疫组织化学试剂盒，10%福尔马林固定、微阵列组织芯片经二甲苯脱蜡后，梯 度乙醇依次水化后置双蒸水中；经过浓度为O.OlmM且pH值为6.0的Tris缓冲液121°C加热20 分钟，室温自然冷却后，用含1%BSA的Tris缓冲液室温处理20分钟；然后加入抗MS4A8B基因 兔多克隆抗体和PCNA鼠单克隆抗体，4°C过夜;再经过HRP-mer羊抗兔八鼠 IgG二抗孵育，DAB 显色;接着采用通用型生物素标记的羊抗小鼠 IgG37°C孵育20分钟，DAB显色，苏木素复染， 中性树胶封片。3. 根据权利要求1所述的研究前列腺癌复发和转移的方法，其特征在于:所述HE染色组 织切片经病理医生复片，并标记选择良性前列腺组织、高分级前列腺上皮内瘤变、前列腺 癌、转移淋巴结组织作为所述微阵列组织芯片的模板。4. 根据权利要求1所述的研究前列腺癌复发和转移的方法，其特征在于:将所述组织切 片制成微阵列组织芯片是将所有样本的HE染色切片和对应供体蜡块置于显微镜下寻找目 的取样区域并在蜡块上标记，规划好微阵列组织芯片中的位置制成Excel表;使用钻头将标 记区域从供体蜡块上取下，供体蜡块水平置于桌面，探针垂直于标记区域，探针插入供体蜡 块取下5mm深度的蜡柱;预制蜡块放置于水平的桌面，使用探针将从供体蜡块取下的蜡柱垂 直的打入预制蜡块的洞中，垂直打入4mm，使用抹平的工具调整蜡柱突出的高度;将预制蜡 块放置在包埋模盘内，放置于烘箱60摄氏度30分钟，需要切的部分即抹平的一面向下;待蜡 块成透明状取出，再加入白蜡，将预制蜡块包埋;预制蜡块置于冷盘，让蜡块冷固后，切片机 切片，切片厚度4微米。5. -种研究前列腺癌复发和转移的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于:采用 含有前列腺组织的石蜡包埋组织样本，将所述样本制成HE染色组织切片，再将所述组织切 片制成微阵列组织芯片，对所述微阵列组织芯片进行免疫组化染色，在显微镜下观察，根据 各样本的着色细胞百分比范围获得着色细胞数分值，根据染色强度获得阳性着色强度系 数，将着色细胞数分值乘以阳性着色强度系数得到MS4A8B基因的蛋白表达水平等级；对所 述微阵列组织芯片进行凋亡实验，在显微镜下观察，以细胞核内出现棕黄色均匀颗粒的细 胞作为PCNA阳性反应表达细胞，对每个样本切片观察至少5个视野，每个视野计数不少于 500个细胞，增殖指数为PCNA阳性反应表达细胞占细胞总数的百分比；对MS4A8B基因的蛋白 表达水平等级和增殖指数进行相关性分析，从而判断前列腺癌复发率和转移率； 所述着色细胞百分比精确到百分位，所述着色细胞百分比〈5%时，着色细胞数分值为0 分;所述着色细胞百分比为5%~25%时，着色细胞数分值为1分;所述着色细胞百分比为 26 %~50 %时，着色细胞数分值为2分;所述着色细胞百分比为51 %~75 %时，着色细胞数 分值为3分;所述着色细胞百分比为76%~100%时，着色细胞数分值为4分； 所述染色强度呈无色时，阳性着色强度系数为0;所述染色强度呈淡黄色时，阳性着色 强度系数为〇. 25;所述染色强度呈棕黄色时，阳性着色强度系数为0.5;所述染色强度呈棕 褐色时，阳性着色强度系数为1; 所述着色细胞数分值乘以阳性着色强度系数〈1分时，MS4A8B基因的蛋白表达水平等级 为阴性;着色细胞数分值乘以阳性着色强度系数2 1分且<2分时，MS4A8B基因的蛋白表达 水平等级为弱阳性;着色细胞数分值乘以阳性着色强度系数2 2分且<3分时，MS4A8B基因 的蛋白表达水平等级为阳性;着色细胞数分值乘以阳性着色强度系数2 3分时，MS4A8B基因 的蛋白表达水平等级为强阳性。6. 根据权利要求5所述的研究前列腺癌复发和转移的方法，其特征在于:对所述微阵列 组织芯片进行凋亡实验是使用凋亡检测试剂盒，微阵列组织芯片二甲苯脱蜡10分钟，换新 鲜的二甲苯再脱蜡5至10分钟;无水乙醇5分钟，90%乙醇2分钟，70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟 依次脱蜡;滴加20g/ml不含DNase的蛋白酶K，20至37°C作用15至30分钟，PBS缓冲溶液洗涤3 次;再用PBS配制的浓度为3%的过氧化氢溶液室温孵育封闭10分钟，以灭活切片内源的过氧 化物酶，PBS洗涤3次;生物素标记，37 °C孵育60分钟;PBS洗涤1次，滴加标记反应终止液，室 温孵育10分钟，PBS洗涤3次;DAB显色，苏木素复染。7. 根据权利要求5所述的研究前列腺癌复发和转移的方法，其特征在于:所述免疫组化 染色是采用免疫组织化学试剂盒，10%福尔马林固定、微阵列组织芯片经二甲苯脱蜡后，梯 度乙醇依次水化后置双蒸水中；经过浓度为O.OlmM且pH值为6.0的Tris缓冲液121°C加热20 分钟，室温自然冷却后，用含1%BSA的Tris缓冲液室温处理20分钟；然后加入抗MS4A8B基因 兔多克隆抗体和PCNA鼠单克隆抗体，4°C过夜;再经过HRP-mer羊抗兔八鼠 IgG二抗孵育，DAB 显色;接着采用通用型生物素标记的羊抗小鼠 IgG37°C孵育20分钟，DAB显色，苏木素复染， 中性树胶封片。8. 根据权利要求5所述的研究前列腺癌复发和转移的方法，其特征在于:所述HE染色组 织切片经病理医生复片，并标记选择良性前列腺组织、高分级前列腺上皮内瘤变、前列腺 癌、转移淋巴结组织作为所述微阵列组织芯片的模板。9. 根据权利要求5所述的研究前列腺癌复发和转移的方法，其特征在于:将所述组织切 片制成微阵列组织芯片是将所有样本的HE染色切片和对应供体蜡块置于显微镜下寻找目 的取样区域并在蜡块上标记，规划好微阵列组织芯片中的位置制成Excel表;使用钻头将标 记区域从供体蜡块上取下，供体蜡块水平置于桌面，探针垂直于标记区域，探针插入供体蜡 块取下5mm深度的蜡柱;预制蜡块放置于水平的桌面，使用探针将从供体蜡块取下的蜡柱垂 直的打入预制蜡块的洞中，垂直打入4mm，使用抹平的工具调整蜡柱突出的高度;将预制蜡 块放置在包埋模盘内，放置于烘箱60摄氏度30分钟，需要切的部分即抹平的一面向下;待蜡 块成透明状取出，再加入白蜡，将预制蜡块包埋;预制蜡块置于冷盘，让蜡块冷固后，切片机 切片，切片厚度4微米。
【文档编号】G01N33/68GK105861692SQ201610301856
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2013年6月24日
【发明人】叶林, 叶定伟
【申请人】复旦大学附属肿瘤医院