用于幽门螺旋杆菌个体化治疗的人cyp2c19基因分型参比品及其制备方法
【专利摘要】本发明是一种用于幽门螺旋杆菌个体化治疗的人CYP2C19基因分型参比品及其制备方法，参比品为人CYP2C19（CYP2C19*2和CYP2C19*3）重组质粒，人CYP2C19（CYP2C19*2和CYP2C19*3）重组质粒包括野生型和突变型。本发明极大地方便了结果的判定，保证了判定的准确性，可将以上参比质粒制备成试剂盒，将为基因分型提供便利，有助于同型输注的开展，并为评估基因分型方法的准确性、特异性和灵敏度提供重要的参考依据。
【专利说明】
用于幽门螺旋杆菌个体化治疗的人CYP2C19基因分型参比品及其制备方法
[0001 ] 技术领域:
本发明涉及幽门螺杆菌检测技术，特别涉及一种人类幽门螺旋杆菌抗原基因分型参比品及其制备方法。
[0002]【背景技术】:
全球半数以上人口感染幽门螺杆菌(Helicobacter pylori ,H.pylori),中国是一个
H.pylori感染率较高的国家，达56.22 %，某些地区高达77.22 %。几乎所有感染幽门螺杆菌的人均患有慢性胃炎，只有少数会发展成为消化性溃疡，而其中有约I % - 2 %发展成为胃癌。幽门螺杆菌感染与临床消化道疾病发生发展密切相关，如慢性胃炎，消化性溃疡，十二指肠溃疡，胃癌和淋巴细胞增生等。1994年WHO将HP列为I类致癌因子。研究表明，幽门螺杆菌感染为胃癌发生的病因，对幽门螺杆菌的根除可明显降低人群胃癌的发生风险。因此，HP感染的根除治疗一直是HP研究领域中的重点和热点，具有重要的临床意义。
[0003]HP耐药是全球性问题，是HP根治率下降的主要原因。以质子栗抑制剂(PPI)结合阿莫西林和克拉霉素(或甲硝唑)的三联疗法，是国内外公认的一线抗HP感染治疗组合。喹诺酮类药物是HP根治的二线药物。抗HP治疗的疗效主要受到以下两个因素影响:一是抗生素耐药，由于近年来抗生素的滥用，克拉霉素、甲硝唑、喹诺酮耐药不断上升，使得三联疗法或喹诺酮的有效率下降；另外一个重要因素是PPI的使用。PPI代谢与人细胞色素P450(CYP450)同工酶CYP2C 19密切相关，CYP2C19的基因多态性(强代谢、中代谢和弱代谢)决定了PPI在人体内的代谢速度。因此，在使用三联疗法之前，提供准确的抗生素耐药信息和CYP2C19的类型，针对性地选择药物进行个体化用药，能够提高幽门螺杆菌根除率，同时减少抗生素滥用带来的不良反应和资源浪费。
[0004]因此，为促进对幽门螺杆菌个体化治疗的研究，提供一种用于幽门螺旋杆菌个体化治疗的人CYP2C19基因分型参比品，用于评估人类幽门螺旋杆菌抗原基因分型方法的准确性、特异性和灵敏度，具有十分重要的意义。
[0005]
【发明内容】
:
本发明的目的就是针对现有技术之不足，而提供一种用于幽门螺旋杆菌个体化治疗的人CYP2C19基因分型参比品及其制备方法。
[0006]本发明的技术方案如下:
用于幽门螺旋杆菌个体化治疗的人C Y P 2 C19基因分型参比品，参比品为人C Y P 2 C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重组质粒，所述人 CYP2C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重组质粒包括野生型和突变型。
[0007]作为优选，人CYP2C19(CYP2C19*2和CYP2C19*3)重组质粒中CYP2C19*2的第5个外显子第681位碱基是G，CYP2C19*3的第4个外显子第636位碱基是G。
[0008]作为优选，野生型的制备方法为:
A、扩增步骤:提取正常人基因组DNA模板，先对CYP2C19基因进行PCR扩增得到中间产物； B、混合步骤:所述中间产物通过T4 DNA连接酶连接至PGEM ? T4_vector，连接中间产物转化感受态大肠杆菌JM109，在37 °C恒温过夜培养后培养12-14小时挑选单克隆，再摇菌15小时，提取质粒后测序，保存测序正确的人CYP2C19(CYP2C19*2和CYP2C19*3)野生型重组质粒。
[0009]作为优选，扩增步骤中，扩增引物包括正向引物和反向引物:正向引物为ATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTG;反向引物为TCAGACAGGAATGAAGCACAGCTG；扩增条件为:94°C，预变性 5min;94°C 变性 30s，60°C 退火 30s，72°C 延伸 208，30个循环；72°(:延伸21^11。
[0010]作为优选，混合步骤中摇菌转速为200rpm。
[0011]作为优选，突变型的制备方法为:
在特定位点采用定点突变方法弓I入突变碱基，首先以引进的突变碱基在引物序列中为目标，结合突变位点的具体情况设计上下游突变引物FM、RM;
第一轮PCR反应，用突变引物RM(CYP2C19 *2_RM: GGGTTCTCGGGAAATAATCAAT;
CYP2C19 *3-RM: CTGGATTCAGGGGGTGCTTAC)及正向侧引物F(ATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTG)扩增含突变位点的DNA片段；
反应体系:
模板DNA 10ng
10 X扩增缓冲液1ul
20 mmol /I, 4种dNTP混合溶液1.0ul
5 umol/L 引物FM (30pmols)6.0ul
5 umol/L 引物R (30pmols)6.0ul
Pfu DNA聚合酶I?2 U
加水至10ul
反应条件:
94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20个循环94 °C, Imin ； 72 °C, 1min ；
第二轮PCR反应，用突变引物FM(CYP2C19 *2_FM: ATTATTTCCCAGGAACCCATAAC；CYP2C19 *3-FM: GCACCCCCTGMTCCAGATATG)与反向侧弓丨物R (TCAGACAGGAATGAAGCACAGCTG)同样以野生型质粒为模板扩增含突变位点及其下游的DNA片段。
[0012]反应体系:
模板DNA 10ng
10 X扩增缓冲液1ul
20 mmol /I, 4种dNTP混合溶液1.0ul
5 umol/L 引物F (30pmols)6.0ul
5 umol/L 引物RM (30pmols)6.0ul
Pfu DNA聚合酶I?2 U
加水至10ul
反应条件:
94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20个循环94 °C, Imin ； 72 °C, 1min ； 第三轮PCR反应，PCRl和PCR2产物经琼脂糖凝胶电泳分离、试剂盒回收纯化后等比例混合。取上述混合物为模板，用引物F和R扩增全长片段。
[0013]反应体系:
PCRl扩增产物50ng PCR2扩增产物50ng 10 X扩增缓冲液1ul
20 mmol /I, 4种dNTP混合溶液1.0ul5 umol/L 引物F (30pmols)6.0ul
5umol/L 引物R(30pmols)6.0ulTaq DNA聚合酶I?2 U加水至10ul反应条件:
94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20个循环94 °C, Imin ； 72 °C, 1min
纯化后的定点突变的目标片段被T4 DNA连接酶连接至PGEM ? T4-vector，同样将产物转化感受态大肠杆菌JM109，在37°C恒温过夜培养后挑选单克隆，再摇菌15小时，提取质粒后测序，保存测序正确的突变型重组质粒。
[0014]作为优选，突变碱基和特定点位具体为CYP2C19*2的第5个外显子第681位碱基G突变为A，CYP2C19*3的第4个外显子第636位碱基G突变为A。
[0015]本发明的有益效果在于:
本发明利用分子生物学技术，包括PCR扩增，载体连接，转化克隆，以及定点突变技术建立了人类幽门螺旋杆菌抗原基因分型参比质粒，该参比质粒含有正确的基因序列，并在不同的基因分型方法中起到了预期的效果，并且也可以作为阳性对照，极大地方便了结果的判定，保证了判定的准确性，可将以上参比质粒制备成试剂盒，将为基因分型提供便利，有助于同型输注的开展，并为评估基因分型方法的准确性、特异性和灵敏度提供重要的参考依据。
[0016]【具体实施方式】:
实施例1:用于幽门螺旋杆菌个体化治疗的人CYP2C19基因分型参比品，参比品为人CYP2C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重组质粒，所述人 CYP2C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重组质粒包括野生型和突变型。
[0017]人CYP2C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重组质粒中 CYP2C19*2 的第 5 个外显子第 681位碱基是G，CYP2C19*3的第4个外显子第636位碱基是G。
[0018]野生型的制备方法为:
A、扩增步骤:提取正常人基因组DNA模板，先对CYP2C19基因进行PCR扩增得到中间产物；
B、混合步骤:所述中间产物通过T4DNA连接酶连接至PGEM ? T4_vector，连接中间产物转化感受态大肠杆菌JM109，在37 °C恒温过夜培养后培养12-14小时挑选单克隆，再摇菌15小时，提取质粒后测序，保存测序正确的人CYP2C19(CYP2C19*2和CYP2C19*3)野生型重组质粒。
[0019]扩增步骤中，扩增弓I物钮証向弓I物和反向弓I物:正向弓I物为ATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTG ；反向引物为TCAGACAGGAATGAAGCACAGCTG ；扩增条件为:94°C，预变性5min ； 94°C 变性30s，60°C退火30s，72°C延伸20s，30个循环；72°C延伸2min。
[0020]混合步骤中摇菌转速为200 rpm。
[0021]突变型的制备方法为:
在特定位点采用定点突变方法弓I入突变碱基，首先以引进的突变碱基在引物序列中为目标，结合突变位点的具体情况设计上下游突变引物FM、RM;
第一轮PCR反应，用突变引物RM(CYP2C19 *2_RM: GGGTTCTCGGGAAATAATCAAT;
CYP2C19 *3-RM: CTGGATTCAGGGGGTGCTTAC)及正向侧引物F(ATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTG)扩增含突变位点的DNA片段；
反应体系:
模板DNA 10ng
10 X扩增缓冲液1ul
20 mmol /I, 4种dNTP混合溶液1.0ul
5 umol/L 引物FM (30pmols)6.0ul
5 umol/L 引物R (30pmols)6.0ul
Pfu DNA聚合酶I?2 U
加水至10ul
反应条件:
94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20个循环94 °C, Imin ； 72 °C, 1min ；
第二轮PCR反应，用突变引物FM(CYP2C19 *2_FM: ATTATTTCCCAGGAACCCATAAC；CYP2C19 *3-FM: GCACCCCCTGMTCCAGATATG)与反向侧弓丨物R (TCAGACAGGAATGAAGCACAGCTG)同样以野生型质粒为模板扩增含突变位点及其下游的DNA片段。
[0022]反应体系:
模板DNA 10ng
10 X扩增缓冲液1ul
20 mmol /I, 4种dNTP混合溶液1.0ul
5 umol/L 引物F (30pmols)6.0ul
5 umol/L 引物RM (30pmols)6.0ul
Pfu DNA聚合酶I?2 U
加水至10ul
反应条件:
94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20个循环94 °C, Imin ； 72 °C, 1min ；
第三轮PCR反应，PCRl和PCR2产物经琼脂糖凝胶电泳分离、试剂盒回收纯化后等比例混合。取上述混合物为模板，用引物F和R扩增全长片段。
[0023]反应体系:
PCRl扩增产物50ng PCR2扩增产物50ng 10 X扩增缓冲液1ul 20 mmol /I, 4种dNTP混合溶液1.0ul 5 umol/L 引物F (30pmols)6.0ul 5 umol/L 引物R(30pmols)6.0ul Taq DNA聚合酶I?2 U 加水至10ul 反应条件:
94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20个循环94 °C, Imin ； 72 °C, 1min
纯化后的定点突变的目标片段被T4 DNA连接酶连接至PGEM ? T4-vector，同样将产物转化感受态大肠杆菌JM109，在37°C恒温过夜培养后挑选单克隆，再摇菌15小时，提取质粒后测序，保存测序正确的突变型重组质粒。
[0024]突变碱基和特定点位具体为CYP2C19*2的第5个外显子第681位碱基G突变为A，CYP2C19*3的第4个外显子第636位碱基G突变为A。
[0025]以上所述仅为本发明的较佳实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
【主权项】
1.用于幽门螺旋杆菌个体化治疗的人CYP2C19基因分型参比品，其特征在于:所述参比品为人 CYP2C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重组质粒，所述人 CYP2C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重组质粒包括野生型和突变型。2.根据权利要求1所述的用于幽门螺旋杆菌个体化治疗的人CYP2C19基因分型参比品，其特征在于:所述人CYP2C19(CYP2C19*2和CYP2C19*3)重组质粒中CYP2C19*2的第5个外显子第681位碱基是G，CYP2C19*3的第4个外显子第636位碱基是G。3.根据权利要求1所述的用于幽门螺旋杆菌个体化治疗的人CYP2C19基因分型参比品，其特征在于:所述野生型的制备方法为: A、扩增步骤:提取正常人基因组DNA模板，先对CYP2C19基因进行PCR扩增得到中间产物； B、混合步骤:所述中间产物通过T4DNA连接酶连接至PGEM ? T4_vector，连接中间产物转化感受态大肠杆菌JM109，在37 °C恒温过夜培养后培养12-14小时挑选单克隆，再摇菌15小时，提取质粒后测序，保存测序正确的人CYP2C19(CYP2C19*2和CYP2C19*3)野生型重组质粒。4.根据权利要求3所述的用于幽门螺旋杆菌个体化治疗的人CYP2C19基因分型参比品，其特征在于:所述扩增步骤中，扩增引物包括正向引物和反向引物:正向引物为ATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTG;反向引物为TCAGACAGGAATGAAGCACAGCTG；扩增条件为:94°C，预变性 5min;94°C 变性 30s，60°C 退火 30s，72°C 延伸 208，30个循环；72°(:延伸21^11。5.根据权利要求3所述的用于幽门螺旋杆菌个体化治疗的人CYP2C19基因分型参比品，其特征在于:所述混合步骤中摇菌转速为200 rpm。6.根据权利要求1所述的用于幽门螺旋杆菌个体化治疗的人CYP2C19基因分型参比品，其特征在于:所述突变型的制备方法为: 在特定位点采用定点突变方法引入突变碱基，首先以引进的突变碱基在引物序列中为目标，结合突变位点的具体情况设计上下游突变引物FM、RM; 第一轮PCR反应，用突变引物RM(CYP2C19 *2-RM:GGGTTCTCGGGAAATAATCAAT; CYP2C19 *3-RM: CTGGATTCAGGGGGTGCTTAC)及正向侧引物F (ATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTG)扩增含突变位点的DNA片段； 反应体系: 模板DNA 10ng 10 X扩增缓冲液1ul 20 mmol /I, 4种dNTP混合溶液1.0ul 5 umol/L 引物FM (30pmols)6.0ul 5 umol/L 引物R (30pmols)6.0ul Pfu DNA聚合酶I?2 U 加水至10ul 反应条件: 94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20个循环 94 °C, Imin ； 72 °C, 1min ； 第二轮PCR反应，用突变引物FM(CYP2C19 *2-FM:ATTATTTCCCAGGAACCCATAAC ；CYP2C19 *3-FM: GCACCCCCTGMTCCAGATATG)与反向侧弓丨物R( TCAGACAGGAATGAAGCACAGCTG)同样以野生型质粒为模板扩增含突变位点及其下游的DNA片段， 反应体系: 模板DNA 10ng 10 X扩增缓冲液1ul 20 mmol /I, 4种dNTP混合溶液1.0ul 5 umol/L 引物F (30pmols)6.0ul 5 umol/L 引物RM (30pmols)6.0ul Pfu DNA聚合酶I?2 U 加水至10ul 反应条件: 94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20个循环 94 °C, Imin ； 72 °C, 1min ； 第三轮PCR反应，PCRl和PCR2产物经琼脂糖凝胶电泳分离、试剂盒回收纯化后等比例混合，取上述混合物为模板，用引物F和R扩增全长片段， 反应体系: PCRl扩增产物50ng PCR2扩增产物50ng 10 X扩增缓冲液1ul 20 mmol /I, 4种dNTP混合溶液1.0ul 5 umol/L 引物F (30pmols)6.0ul 5 umol/L 引物R(30pmols)6.0ul Taq DNA聚合酶I?2 U 加水至10ul 反应条件: 94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20个循环 94 °C, Imin ； 72 °C, 1min 纯化后的定点突变的目标片段被T4 DNA连接酶连接至PGEM ? T4-vector，同样将产物转化感受态大肠杆菌JM109，在37°C恒温过夜培养后挑选单克隆，再摇菌15小时，提取质粒后测序，保存测序正确的突变型重组质粒。7.根据权利要求5所述的用于幽门螺旋杆菌个体化治疗的人CYP2C19基因分型参比品，其特征在于:突变碱基和特定点位具体为CYP2C19*2的第5个外显子第681位碱基G突变为A，CYP2C19*3的第4个外显子第636位碱基G突变为A。
【文档编号】C12Q1/68GK105861684SQ201610295403
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】钟婧, 黄惠莲, 戴利成
【申请人】湖州市中心医院