一种高效的双向转录/表达质粒及其在流感病毒反向遗传学中的应用

一种高效的双向转录/表达质粒及其在流感病毒反向遗传学中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种高效的双向转录/表达质粒及其在流感病毒反向遗传学中的应用。本发明的一种双向转录/表达质粒是以真核表达载体pEF4/myc?His B为骨架进行改造得到的。为了建立马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)的反向遗传操作系统，本发明使用构建得到的双向转录/表达质粒双向分别表达马流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、NS以及M基因，通过共转染、测序、生长曲线的绘制和酶切鉴定，成功拯救得到一株EIV及其突变体。同时与现有的pBD系统进行产毒量的比较，表明本发明建立的反向遗传操作系统优于pBD系统。本发明的提出为流感病毒的反向遗传研究提供了一种新的技术手段，同时也为日后深入研究马流感病毒的传播，致病机理，乃至疫苗候选株的筛选奠定了坚实基础。
【专利说明】
-种高效的双向转录/表达质粒及其在流感病毒反向遗传学 中的应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种双向转录质粒及其在流感病毒反向遗传学中的应用，本发明属于 生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 流感病毒属于正黏病毒科((Irthomyxoviridae)，根据NP蛋白和M蛋白的抗原性可 分为，A、B和C型流感病毒。其中，C型流感病毒仅溫和感染人，几乎无症状。A型和B型流感病 毒均可导致季节性的流感，而A型流感病毒可W造成全球大流行。此外，流感病毒的基因组 由7(C型)或8(A型和B型)个分节段的单链负义RNA组成，容易发生重排，产生新的毒株，运使 流感的防控遇到了挑战。研究流感病毒对于促进流感病毒的认识和流感的防控具有积极意 义。
[0003] 反向遗传学为流感病毒研究中应用最为广泛的工具之一。目前，已经有许多病毒 捶救系统被应用于流感病毒的相关研究中，其中W8质粒系统最为简便易行，其核屯、是双向 转录/表达载体。运类载体一般拥有转录方向相对的poll启动子和pol II启动子，能够W同 一CDNA为模板分别转录病毒负链RNA和表达病毒蛋白，进而组装出病毒。2000年，化ffman等 首次利用PHW2000载体建立了HlNl的8质粒系统。2005年，李泽君等首次使用基于地D载体的 8质粒系统研究H5N1禽流感病毒。尽管PHW2000和P抓均采用强有力的CMV启动子，捶救的第 一代病毒的滴度仍然较低，需要通过MDCK细胞或鸡胚扩大培养，费时费力，难W适应诸多研 究需求。然而，有报道称EFl-a启动子比CMV启动子活性要高。或许可W采用EFl-a启动子构 建双向转录/表达载体，建立8质粒反向遗传系统，捶救出更高滴度的病毒。
[0004] 基于上述假设，经过科学实验验证，特提出本发明。

【发明内容】

[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种高效的双向转录/表达质粒及其在流感病 毒反向遗传学中的应用。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用了 W下技术手段：
[0007] 一种双向转录/表达载体，其特征在于W真核表达载体祀FVmyc-His B为骨架进 行改造:在所述祀F4/myc-HiS B载体的KpnI和BclI酶切位点之间插入鼠源的poll终止子、 BsmBI酶切位点和人源的poll启动子序列；在其SphI和BspQI酶切位点之间插入一段短的 Linker序列，替换原载体上从fIori到SV40poly A信号之间的非必需元件，所述的Linker序 列为5 ' -CTGGGGATGCGGTGGGCTCTATG-3 '，将改造后的载体命名为祀Z。
[000引在本发明中，优选的，所述的双向转录/表达载体的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所 /J、- O
[0009]进一步的，本发明还提出了一种马流感病毒的反向遗传操作系统，其含有8个基于 本发明所述的双向转录/表达质粒而构建的重组质粒，分别表达野生型或突变型的马流感 病毒 PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、NSW及M基因节段。
[0010] 在本发明中，优选的，所述的流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、NSW及M基因节段的 核巧酸序列分别如SEQ ID NO.2-9所示。
[0011] 在本发明的一个具体实施例中，优选的，HA基因节段带有化ndn I和NdeI酶切位 点，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 10所示。
[0012] 更进一步的，本发明还提出了 W上任一项所述的反向遗传操作系统在马流感病毒 捶救中的用途。
[0013] -种利用本发明所述的反向遗传操作系统捶救马流感病毒的方法，包括W下步 骤：
[0014] (1)双向转录/表达载体的构建
[001日]真核表达载体pEF4/myc-His B为骨架进行改造 :在所述pEF4/myc-His B载体的 Kpn I和Bc 11酶切位点之间插入鼠源的PO 11终止子、BsmBI酶切位点和人源的PO 11启动子序 列；在其SphI和BspQI酶切位点之间插入一段短的Linker序列，替换原载体上从flori到 SV40poly A信号之间的非必需元件，所述的Linker序列为5'-CTGGGGATGCGGTGGGCTCTATG-3'，将改造后的载体命名为祀Z;
[0016] (2)携带病毒CDNA的重组质粒的构建和分子标记的引入
[0017] 提取A/equine/Jilin/1/1989株的病毒RNA，Wunil2为反转录引物，W各个节段相 应引物对为扩增引物，使用RT-PCR方法扩增8个基因节段:PB2，PBl，PA，HA，NP，NA，M和NS;各 个节段经BsmBI或BsaI酶切后，分别定向克隆至I帖Z的BsmBI之中，构建得至化个重组质粒； [001引所述的引物序列如下所示：
[00191
[0020] (3)重组病毒的捶救
[0021] 使用步骤(2)构建得到的8个节段的重组质粒共转染细胞，捶救重组病毒。
[0022] 在本发明所述的方法中，优选的，还包括使用W下引物对对野生型HA节段进行 T449C和C983T的无义点突变，构建含有突变型HA节段的重组质粒，使其HA节段含有单一的 HindIII和NdeI酶切位点，使用含有突变的HA节段的重组质粒和分别含有另外7个节段的重 组质粒共转染细胞，捶救重组病毒；
[0023] 5 '-CTTCGCTGAAAGCTTCACTTGGACA-3 '
[0024] 5 '-TGTCCAAGTGAAGCTTTCAGCGAAG-3 ' 和 [00 巧]5 '-CAAGATCACATATGGAGCATGTCCC-3 '
[0026] 5，-GGGACATGCTCCATATGTGATCTTG-3 '
[0027] 更优选的，突变的HA节段的核巧酸序列如SEQ ID NO. 10所示。
[002引在本发明所述的方法中，优选的，步骤(1)构建得到的双向转录/表达载体祀Z的核 巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0029] 在本发明所述的方法中，优选的，流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、NSW及M基因节 段的核巧酸序列分别如SEQ ID NO.2-9所示。
[0030] 相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
[0031] 本发明采用了人源的EFl-a和poll启动子创造出了优化的双向转录/表达载体， EFl-a启动子和BGH poly A信号位于poll启动子和终止子外侧且两个启动子的转录方向相 对，并在poll启动子和终止子之间含有两个BsmBI酶切位点W便于插入外源DNA片段，具有 利用同一模板转录出HiRNA和负链RNA的功能，可W应用于负链RNA病毒的研究中，建立反向 遗传系统。本发明将其运用于EIV化89株及其变异体的反向遗传学中，成功捶救了EIV JL89。并且此系统与国内现有的P抓系统相比，该系统可W大量捶救第一代病毒，其滴度是 P抓系统的19倍，显著高于地D系统，产毒量更高。
【附图说明】
[0032] 图1为双向转录/表达载体祀Z的构建示意图；
[0033] 图2为祀Z-VEGFP的构建示意图；
[0034] 图3为绿色巧光的检测结果；
[0035] 图4为负链RNA完整性检测结果；
[0036] 图5为扩增的8个片段的电泳检测结果；
[0037] 图6为HA节段的酶切鉴定结果；
[003引图7为在MDCK细胞中的生长动力学曲线；
[0039] 图8为采用祀Z系统W及地D系统捶救病毒滴度的测定结果。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但运些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可W对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但运些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0041] 本发明W下实施例中所设及的主要试剂和实验材料
[0042] 1、病毒株和细胞
[0043] A/equine/Jilin/1/1989化3N8)病毒株(简称化89)已记载在文献（黑龙江省一株 马流感病毒的全基因组测序及同源性分析，赵創等，《中国动物检疫》，2015年12期），现由中 国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存、提供;HEK293T细胞和MDCK细胞由本实验室保存。
[0044] 2、主要试剂
[0045] pEF4/myc-His B质粒、Superscript III反转录酶、RNA酶抑制剂、Lipofectamine 2000转染试剂购自invitrogen公司；T4RNA连接酶、Phusion DNA聚合酶、限制性内切核酸酶 购自化W England Biolabs公司；病毒RNA提取试剂盒购自Qiagen公司；PMD18-T载体购自 化KaRa公司；P抓载体由陈化兰研究员惠赠；SPF鸡胚购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究 所。
[0046] 实施例1双向转录/表达载体的构建及功能鉴定
[0047] 1、双向转录/表达载体的构建
[004引如图1所示，W真核表达载体祀FVmyc-His B为骨架进行改造:在其Kpn巧邮ClI酶 切位点之间插入必需元件（Insert 1，序列如SEQ ID NO. 11所示）--鼠源的poll终止子 (化011，33bp)、BsmBI酶切位点和人源的poll启动子(PpolI，236bp)序列；在其SphI和BspQI 酶切位点之间插入一段短的Linker序列（Insert 2，序列为5'-CTGGGGATGCGGTGGGCTCTATG-3'），替换原载体上从flori到SV40poly A信号之间的非必需元件。改造后的载体命名为 祀z，其核巧酸序列如SEQ ID NO. I所示。
[0049] 2、携带报告基因的重组质粒构建
[0050] 在pEZ载体中插入报告基因 W验证其双向转录/表达功能。使用引物对（5 ' -TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAGATATTTAAAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3'（BsmBI)/5 '-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3 '（BsmBI ))，WEGFP基因 为模板，利用PCR方法获得报告基因（vEGFP，765bp)，其5 '末端和3 '末端分别融合上EIV 化89株M节段的5'非编码区（5'UTR)和3'非编码区（3'UTR)，经限制性内切酶BsmBI酶切后定 向插入于祀Z载体的BsmBI之中，构建重组质粒(pEZ-vEGFP)(图2)。
[0化1] 3、绿色巧光的检测
[0052] 按照Lipofectamin 2000说明书，将重组质粒pEZ-vEGFP转染丰度达90% W上的 293T细胞，加后换液，4化后置于倒置巧光显微镜下观察绿色巧光。实验中同时设置空载体 对照。
[0化3] 4、负链RNA完整性的检测
[0化4] 质粒转染4化后使用TRIzol提取细胞中的总RNADWunil2(5'-AGCAAAAGCAGG-3'） 为反转录引物，W引物对M-F/M-R(表1)为扩增引物，通过RT-PCR方法扩增vEGFP，克隆于 PMD18-T载体并测序验证。
[0055] 同时，利用RNA连接技术使RNA分子环化，WO-vEGFP F(5'-CTGCTGCCCGACAACCACTACCTGA-3 '）为反转录引物，W 引物对0-vEGFP F/O-vEGFP R(5 ' -GTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTC-3'）为扩增引物，通过RT-PCR方法扩增vEGFP的非编码区，克隆 于PMD18-T载体并测序验证。
[0056]结果：
[0057]双向转录/表达载体祀Z改造自真核表达载体祀F4/myc-化S B，在其poll启动子和 poll终止子序列之间含有两个BsmBI酶切位点W便于定向克隆外源DNA片段，其EFl-a启动 子和BGH poly A信号位于poll启动子和poll终止子外侧且两个启动子的转录方向相对（图 1)。其中EFl-a启动子和BGH poly A信号可W指导mRNA的转录，进而翻译出蛋白；而poll启 动子和POl I终止子能够控制负链RNA的转录。
[005引为了验证祀Z载体具有利用同一模板转录出mRNA和负链RNA的功能，构建重组质粒 祀Z-vEGFP，其vEGFP由5 ' UTR，EGFP和3 ' UTR组成（图2)。祀Z-vEGFP和祀Z分别转染293T细胞， 4化后观察绿色巧光。祀Z-VEGFP转染的细胞可W观察到绿色巧光，而祀Z转染的细胞没有绿 色巧光（图3)。运表明pEZ-vEGFP在细胞内W vEGFP为模板转录出相应的mRNA，进而翻译出 EGFP蛋白。
[0化9] 一方面，质粒转染后提取细胞总RNA进行RT-PCR扩增(RT组)和直接PCR扩增(No RT 组）。其中，仅pEZ-vEGFP转染后可W经RT-PCR扩增出与阳性对照(+Ctr 1)相符的条带，而其 他处理不能扩增出相应条带（图4A)，并且测序结果与vEGFP序列一致。另一方面，提取的RNA 分子经RNA连接酶作用后进行RT-PCR扩增。其中pEZ-vEGFP转染后能够扩增出与预期 (212bp)相符的条带，而祀Z转染后不能扩增出相应条带（图4B)。此外测序结果与预期一致 (图4C)。运表明祀Z-vEGFP在细胞内WvEGFP为模板转录出完整的具有精确的5'UTR和3'UTR 的负链RNA。
[0060] W上结果表明祀Z载体具有双向转录/表达功能，可W利用同一模板表达出相应的 蛋白和转录出完整的负链RNA。
[0061 ] 实施例沈IV反向遗传系统的建立
[0062] 1、携带病毒CDNA的重组质粒的构建和分子标记的引入
[0063] 按病毒RNA提取试剂盒使用说明书提取EIV化89株的病毒RNA，Wunil2为反转录 引物，W各个节段相应引物对(表1)为扩增引物，使用RT-PCR方法扩增8个基因节段(PB2， PB 1，PA，HA，NP，NA，M和NS)。各个节段经相应的限制性内切酶(BsmBI或BsaI)酶切后，分别定 向克隆到pEZ的BsmBI之中，构建得到8个重组质粒，所含有的8个基因节段一PB2、PB1、PA、 HA、NP、NA、NSW及M基因节段的核巧酸序列分别如沈QIDN0.2-9所示。
[0064] 表1扩增8个节段的引物
[00 化]
[0066] 此外，使用引物对S'-CTTCGCTGAAAGCTTCACTTGGACA-S'/S'-TGTCCAAGTGAAGCTTTCAGCGAAG-S ' 和5 ' -CAAGATCACATATGGAGCATGTCCC-3 ' /5 ' -GGGACATGCTCCATATGTGATCTTG-3'，对野生型(Wt)HA节段进行无义点突变(T449C和C 983T),构 建含有突变型(mutant)HA节段的重组质粒，使其HA节段含有单一的化ndin和NdeI酶切位 点，突变后的HA节段的核巧酸序列如SEQ ID NO. 10所示。
[0067] 结果：
[0068] 提取病毒RNA，经RT-PCR扩增8个节段（图5)，将其分别克隆至pEZ载体的BsmBI之 中，构建8个重组质粒。
[0069] 2、重组病毒的捶救
[0070] 使用含有突变的HA节段的重组质粒和分别含有另外7个节段的重组质粒共转染细 胞，捶救重组病毒。按照Lipofectamin 2000说明书，将8个重组质粒各0.扣g(共化g)和10化 脂质体分别溶于250化化ti-MEM中，二者混匀，逐滴加入到六孔板中丰度达90% W上的 293T细胞中，转染化后换液为无抗无血清的化ti-MEM，转染30h后加入终浓度为250ng/mL的 TPCK-膜酶，转染4她后收获上清，将其作为第一代重组病毒(dL89)。使用9~11日龄SPF鸡 胚扩大培养rJL89，7化后收获尿囊液，使用1 %鸡红细胞测定其血凝效价。
[007。结果：
[0072] 利用定点突变技术构建HA节段上含有化ndIII和NdeI酶切位点的重组质粒。将该 质粒与另外7个质粒共转染293T细胞捶救重组病毒，在鸡胚中复制后HA效价达到2 8。运说明 捶救出重组病毒(dL89)。
[0073] 实施例3重组病毒的鉴定
[0074] 1、重组病毒的序列测定和其分子标记的检测
[0075] 按照实施例2方法1中所述引物和方法扩增rJL89的8个节段，克隆至PMD18T载体， 测定各个节段序列，并与化89各个节段序列进行比对分析。同时，使用限制性内切酶 Hindi H和NdeI对HA节段进行酶切鉴定。
[0076]结果：
[0077]克隆rJL89的8个节段，并测定其序列。dL89的各个节段与化89的比对显示，HA节 段含有无义突变(T44化和C983T),与化89的HA节段一致性达99.9%;而PB2、PB1、PA、NP、NA、M 和NS与化89的相应节段一致性达100%;运说明rJL89的遗传信息几乎全部源自化89。
[007引 r化89的HA节段含有化ndin和NdeI酶切位点，W此为分子标记区分捶救的重组病 毒株和亲本毒株。利用限制性内切酶化ndin和NdeI酶切该突变型(mutant)HA节段和野生 型（Wt)HA节段。结果显示，突变型（mutant)HA可W被化ndllI切割为两条带（约44化P和1 319bp)，被NdeI切割为两条带（约78加 P和980bp)，被化ndIII和NdeI双酶切为S条带（约 446bp、534bp和78化P);而野生型(Wt)HA不能被切割，与阴性对照(-C化1)带型相符（图6)。 运说明重组病毒rJL89已经稳定携带该分子标记。
[0079] 2、病毒生长动力学测定
[0080] Wo. Olmoi的病毒量感染MDCK细胞，分别于感染后3、6、9、12、24、36、48、60和7化收 获上清液。使用TCIDso法测定各个时间点的病毒滴度，将病毒液进行倍比稀释（i(ri~ 共11个稀释度），各个稀释度10化L接种8孔MDCK细胞，7化后统计各个稀释度下出现细胞病 变的孔数，计算病毒滴度(TCI化日/mL)。W感染时间化ours post infection)为横坐标，W病 毒滴度（IgTCI化o/mL)为纵坐标，绘制病毒生长曲线。并利用统计学方法分析各个时间点 r化89和化89病毒滴度的差异。
[00川结果：
[0082] r化89经鸡胚扩大培养后，其血凝效价达到28,与化89的血凝效价相同。运表明 r化89保存了化89的血凝特性。
[0083] r化89和化89感染MDCK细胞后不同时间点收获上清，并测定其病毒滴度，绘制生长 曲线（图7)。从图7结果可W看出:rJL89感染MDCK细胞后，在0~1化内其病毒滴度缓慢增长； 在12~4她内其病毒滴度迅速上升并达到峰值;之后维持在此滴度附近。运与化89的生长特 性相同。尽管二者在各个时间点的病毒滴度有差别，但差异不显著。运表明该系统成功捶救 出具有感染性的病毒粒子，且在MDCK细胞上rJL89具有与化89相同的生长特性。
[0084] 实施例4pEZ系统捶救病毒能力的评估
[0085] 方法；
[0086] 利用祀Z系统和P抓系统（由本实验室构建，亦含有化89的全基因组，参考文献:Li Z,Chen H,Jiao P,Deng G,Tian G,Li Y,Hoffmann E,Webster RG,Matsuoka Y,Yu K.Molecular basis of replication of duck HSNlinfluenza viruses in a mammalian mouse model.J Virol.2005Sep;79(18):12058-64.化bMed PMID:16140781;PubMed Central PMCID:PMC1212590.)，使用实施例2方法2中所述方法捶救病毒。使用实施例3方法 2所述方法测定第一代病毒的滴度。利用统计学方法分析二者差异。
[0087] 结果：
[0088] 使用pEZ系统和pBD系统同时捶救病毒，并测定第一代病毒的滴度。结果分别为 2.38X 10哺1.25 X IO4个TCIDso/mL，说明祀Z系统捶救病毒的滴度是P抓系统的19倍，二者 差异显著（图8)。
【主权项】
1. 一种双向转录/表达载体，其特征在于以真核表达载体pEF4/myc-His B为骨架进行 改造：在所述pEF4/myC-His B载体的ΚρηΙ和Ben酶切位点之间插入鼠源的poll终止子、 BsmB頂每切位点和人源的poll启动子序列；在其SphI和BspQI酶切位点之间插入一段短的 Linker序列，替换原载体上从fl ori到SV40poly A信号之间的非必需元件，所述的Linker 序列为5 ' -CTGGGGATGCGGTGGGCTCTATG-3 '，将改造后的载体命名为pEZ。2. 如权利要求1所述的双向转录/表达载体，其特征在于所述的双向转录/表达载体的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。3. -种马流感病毒的反向遗传操作系统，其特征在于含有8个基于权利要求1或2所述 的双向转录/表达质粒而构建的重组质粒，分别表达野生型或突变型的马流感病毒PB2、 PB1、？厶、拟、陬、嫩、吧以及1基因节段。4. 如权利要求3所述的反向遗传操作系统，其特征在于所述的流感病毒PB2、PB1、PA、 HA、NP、NA、NS以及M基因节段的核苷酸序列分别如SEQIDN0.2-9所示。5. 如权利要求3所述的反向遗传操作系统，其特征在于HA基因节段带有Hindlll和Ndel 酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示。6. 权利要求3-5中任一项所述的反向遗传操作系统在马流感病毒拯救中的用途。7. -种利用权利要求3-5任一项所述的反向遗传操作系统拯救马流感病毒的方法，其 特征在于包括以下步骤： (1) 双向转录/表达载体的构建 真核表达载体pEF4/myc-His B为骨架进行改造:在所述pEF4/myc-His B载体的ΚρηΙ和 Bell酶切位点之间插入鼠源的poll终止子、BsmBI酶切位点和人源的poll启动子序列;在其 SphI和BspQI酶切位点之间插入一段短的Linker序列，替换原载体上从flori到SV40poly A 信号之间的非必需元件，所述的1^111?^序列为5'-〇^^^^^了6066了666(：1'(^4了6-3'，将改造后 的载体命名为pEZ; (2) 携带病毒cDNA的重组质粒的构建和分子标记的引入 提取A/equine/Jilin/1/1989株的病毒RNA，以unil2为反转录引物，以各个节段相应引 物对为扩增引物，使用RT-PCR方法扩增8个基因节段:PB2，PB1，PA，HA，NP，ΝΑ，M和NS;各个节 段经BsmBI或Bsa頂每切后，分别定向克隆到pEZ的BsmBI之中，构建得到8个重组质粒； 所述的引物序列如下所示：(3)重组病毒的拯救 使用步骤(2)构建得到的8个节段的重组质粒共转染细胞，拯救重组病毒。8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于还包括使用以下引物对对野生型HA节段进行 T449C和C983T的无义点突变，构建含有突变型HA节段的重组质粒，使其HA节段含有单一的 Hindlll和Ndel酶切位点，使用含有突变的HA节段的重组质粒和分别含有另外7个节段的重 组质粒共转染细胞，拯救重组病毒； 5 '-CTTCGCTGAAAGCTTCACTTGGACA-3 ' 5 '-TGTCCAAGTGAAGCTTTCAGCGAAG-3 ' 和 5 '-CAAGATCACATATGGAGCATGTCCC-3 ' 5 '-GGGACATGCTCCATATGTGATCTTG-3 ' 优选的，突变的HA节段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示。9. 如权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(1)构建得到的双向转录/表达载体pEZ的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。10. 如权利要求7所述的方法，其特征在于流感病毒ro2、PBl、PA、HA、NP、NA、NS&&MS 因节段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2-9所示。
【文档编号】C12N7/01GK105861555SQ201610309169
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】王晓钧, 张翔, 郭巍, 张振宇, 胡哲
【申请人】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所