一种检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的多重dpo-pcr引物组合及方法
【专利摘要】本发明提供了两组引物对，本发明还提供了所述的两组引物对在检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌，或制备检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的产品中的应用；本发明同时还提供了含有该两组引物对的试剂盒及应用，以及基于两组引物对或试剂盒的检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的方法。经实验证明，本发明的两组引物对特异性好、灵敏度高、检测效率高，且基于该两组引物对建立的副溶血弧菌和霍乱弧菌的多重DPO?PCR方法高通量、灵敏、准确和快速，为同时检测副溶血弧菌和霍乱弧菌提供了更有效的方法。
【专利说明】
一种检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的多重DPO-PCR引物组合及 方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物检测领域，特别涉及检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的方法、引物及 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 多重PCR是指在一个反应管内加入多对引物同时对多个靶基因进行扩增，可以实 现对样品的高通量检测，目前已经被广泛应用于转基因物种的检测。由于在PCR反应体系内 加入了多对引物，体系复杂，稳定性不高，限制了其使用。D P 0 ( D u a I p r i m i n g oligonucleotide)引物技术的主要原理为其引物包含两个各自独立的特异性引物区域，5' 端序列由18-25个碱基组成并与靶基因序列配对，3'端序列由6-12个碱基用来引导PCR反应 的特异性延伸，这两段独立的特异性区域利用寡聚次黄嘌呤（In 〇Sine，I)进行连接，由于次 黄嘌呤比一般碱基的退火温度低，在退火时寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构，从而使5' 和3'区域形两个独立功能的双特异性引物结构，研究表明5'和3'引物区域中任何有3个及 以上碱基的错配，PCR反应将不能进行，而且由于其特殊的结构，引物自身以及引物之间很 少形成二级结构且对退火温度不敏感。该技术的优点主要在于它对退火温度等影响普通多 重PCR的关键因素不敏感，适用范围广，而且该技术特异性强，扩增效率高，为多重PCR技术 的应用提供了新的前景。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏、准确和快速的基于多重DPO-PCR技术 的可同时检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的方法，本发明还提供了用于该方法的特异性好、灵 敏度高、检测效率高和适用范围广的两组引物对，以及含有该两组引物对的试剂盒及其应 用。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0005] 本发明第一方面提供了两组引物对，其中一组引物对包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列，另一组引物对包含SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的核苷酸序 列。
[0006] 本发明第二方面提供了所述的两组引物对在检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱 弧菌，或制备检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的产品中的应用。
[0007] 在一优选例中，所述检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌包括:检测或辅助检 测生物样品是否感染副溶血弧菌和霍乱弧菌，以及检测或辅助检测病原菌是否为或候选为 副溶血弧菌和霍乱弧菌。
[0008] 在一优选例中，所述制备检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的产品包括：制 备检测或辅助检测生物样品是否感染副溶血弧菌和霍乱弧菌的产品，以及制备检测或辅助 检测病原菌为或候选为副溶血弧菌和霍乱弧菌的产品。
[0009] 本发明第三方面提供了一种试剂盒，包括所述的两组引物对。
[0010] 在一优选例中，还包括PCR扩增试剂。
[0011] 在一优选例中，所述PCR扩增试剂包括dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液和Taq DNA聚合 酶中的至少一种。
[0012] 在一优选例中，所述dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液和Taq DNA聚合酶均来源于TaKaRa 公司的货号为RR060A的试剂盒。
[0013]在一优选例中，还包括DNA提取试剂盒。
[0014]在一优选例中，所述DNA提取试剂盒包括来自天根生化科技有限公司货号为DP302 的细菌基因组DNA提取试剂盒所包含的试剂。
[0015] 在一优选例中，还包括阳性对照和阴性对照。
[0016] 本发明第四方面提供了所述的试剂盒在检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌， 或制备检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的产品中的应用。
[0017] 在一优选例中，所述检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌包括:检测或辅助检 测生物样品是否感染副溶血弧菌和霍乱弧菌，以及检测或辅助检测病原菌是否为或候选为 副溶血弧菌和霍乱弧菌。
[0018] 在一优选例中，所述制备检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的产品包括：制 备检测或辅助检测生物样品是否感染副溶血弧菌和霍乱弧菌的产品，以及制备检测或辅助 检测病原菌为或候选为副溶血弧菌和霍乱弧菌的产品。
[0019] 本发明第五方面提供了一种检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的多重DPO-PCR方法，包括使用所述的两组引物对或所述试剂盒的步骤。
[0020] 在一优选例中，所述检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌包括:检测或辅助检 测生物样品是否感染副溶血弧菌和霍乱弧菌，以及检测或辅助检测病原菌是否为或候选为 副溶血弧菌和霍乱弧菌。
[0021 ]在一优选例中，包括如下步骤：
[0022] 1)多重 DPO-PCR 扩增
[0023] 以生物样品或病原菌含有的DNA为模板与权利要求1所述的两组引物对或权利要 求3-4中任一项所述试剂盒进行多重DPO-PCR扩增。
[0024] 2)根据多重DPO-PCR扩增的结果判断生物样品是否感染副溶血弧菌和霍乱弧菌， 或病原菌是否为或候选为副溶血弧菌和霍乱弧菌。
[0025]在一优选例中，在步骤1)之前还包括在生物样品或病原菌中提取DNA的步骤。
[0026]在一优选例中，所述在生物样品或病原菌中提取DNA是采用天根生化科技有限公 司货号为DP302的细菌基因组DNA提取试剂盒进行。
[0027]在一优选例中，所述多重DPO-PCR扩增的结果判断的标准为：
[0028]若所述多重DPO-PCR扩增得到的扩增产物同时含有大小为463bp和307bp的片段， 则所述生物样品同时感染副溶血弧菌和霍乱弧菌，或病原菌为或候选为副溶血弧菌和霍乱 弧菌;若所述多重DPO-PCR扩增得到的扩增产物只含有大小为307bp的片段，则所述生物样 品感染副溶血弧菌且排除霍乱弧菌，或病原菌为或候选为副溶血弧菌且排除霍乱弧菌;若 所述多重DPO-PCR扩增得到的扩增产物只含有大小为463bp的片段，则所述生物样品感染霍 乱弧菌且排除副溶血弧菌，或病原菌为或候选为霍乱弧菌且排除副溶血弧菌;若所述多重 DPO-PCR扩增得到的扩增产物未含有大小为463bp和307bp的片段，则所述生物样品未感染 副溶血弧菌和霍乱弧菌，或病原菌不为或候选不为副溶血弧菌和霍乱弧菌。
[0029] 在一优选例中，所述多重DPO-PCR扩增的反应体系如下： 模板 DNA SOng 两组引物对 其中每条引物的终浓度均为0.2 pmol/L
[0030] Mix I 0.25 Mix 2 25 'uL ddH20 补足
[0031] 在一优选例中，所述Mix I内含DNA聚合酶，Mix 2内含dNTPs、MgCl2、反应缓冲液。 [0032] 在一优选例中，所述Mix 1和Mix 2均来自TaKaRa公司的货号为RR060A试剂盒。 [0033] 在一优选例中，所述多重DPO-PCR反应条件为:94°C 1分钟；94°C30秒，退火温度为 45 °C ~65 °C 90秒，72 °C 90秒，共40个循环；72 °C 10分钟。
[0034] 在一优选例中，所述退火温度为60 °C。
[0035] 本发明第六方面提供了一种筛选副溶血弧菌和霍乱弧菌的系统，包括：
[0036] 核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取所述生物样品或病原菌中的核酸样 本；
[0037]多重DPO-PCR扩增装置，所述多重DPO-PCR扩增装置与所述核酸提取装置相连，适 用于采用权利要求1所述的两组引物对或权利要求3-4中任一项所述试剂盒对所述核酸样 本进行多重DPO-PCR扩增；以及
[0038] 判断装置，所述判断装置与所述多重DPO-PCR扩增装置相连，以便基于多重DPO-PCR扩增的结果，判断所述生物样品是否感染副溶血弧菌和霍乱弧菌，或病原菌是否为或候 选为副溶血弧菌和霍乱弧菌。
[0039] 在一优选例中，所述多重DPO-PCR扩增的反应体系如下： 核酸样本 50 ng 两组引物对 其中每条引物的终浓度均为0.2 fimol/L
[0040] Mix 1 0.25 μL. Mix 2 25 ^iL CidH2O 补足允50丨止。
[0041 ] 在一优选例中，所述Mix 1内含DNA聚合酶，Mix 2内含dNTPs、MgCl2、反应缓冲液。 [0042] 在一优选例中，所述Mix 1和Mix 2来自TaKaRa公司的货号为RR060A试剂盒。
[0043] 在一优选例中，所述多重DPO-PCR反应条件为:94°C 1分钟；94°C30秒，退火温度为 45 °C ~65 °C 90秒，72 °C 90秒，共40个循环；72 °C 10分钟。
[0044] 在一优选例中，所述退火温度为60°C。
[0045] 本发明的生物样品为血液、细胞、组织等，或混杂了血液、细胞、组织等的食物等 等;而病原菌则是一种纯菌种或至少二种以上的菌种的混合。
[0046] 本发明的有益效果包括：
[0047] (1)本发明针对设计的多条多重DPO-PCR引物进行了大量筛选，综合其特异性、灵 敏度、引物与引物之间的作用，以及所使用的各引物与多重DPO-PCR扩增试剂盒的适配性， 最终筛选出特异性好、灵敏度高、适用性广且可同时检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的两组引 物对。
[0048] (2)本发明针对在前述两组引物对的基础上建立了副溶血弧菌和霍乱弧菌的多重 DPO-PCR方法，可对副溶血弧菌和霍乱弧菌进行定性检测，且特异性好、通量高、快速，提高 了检测效率，为副溶血弧菌和霍乱弧菌的检测提供了更有效的方法。
【附图说明】
[0049 ]图1为本发明实施例4中多重DPO-PCR引物组合的特异性试验电泳检测结果。其中M 为marker DL1000，1:阴性对照；2:副洛血弧囷和霍乱弧囷；3:副洛血弧囷；4:霍乱弧囷。 [0050]图2为本发明实施例5中多重DPO-PCR引物组合的特异性试验电泳检测结果。其中M 为marker DL1000，1:阴性对照;2:阳性对照;3:副溶血弧菌;4:霍乱弧菌;5:溶藻弧菌;6:创 伤弧菌;7:拟态弧菌;8:美丽弧菌;9:河流弧菌；10:哈维氏弧菌；11:大肠杆菌；12:金黄色葡 萄球菌;13:沙门氏菌;14:单增李斯特菌。
[0051 ]图3为本发明实施例6中多重DPO-PCR引物组合的灵敏度试验电泳检测结果。其中M 为marker DL1000，1-6:两种弧菌模板量依次为100ng、10ng、lng、0 · lng、0 · Olng和0 · OOlng。
[0052] 图4为本发明实施例7中多重DPO-PCR引物组合的退火温度敏感实验的电泳检测结 果。其中M为marker DL100 0，1 -5:退火温度分别为45 °C、50 °C、55 °C、60 °C 和65 °C。
【具体实施方式】
[0053] 除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
[0054] 下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅 是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，均按照常 规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual ,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂或仪 器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0055] 以下实施例中使用的副溶血弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、美丽 弧菌、河流弧菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和单增李斯特菌均由湛 江出入境检验检疫局提供。
[0056] 实施例1
[0057]本实施例提供了两组引物对及其应用。
[0058] 两组引物对的筛选方法为：针对副溶血弧菌col lagenase基因 （GenBank ID : AF326572.1)和霍乱弧菌ompW基因 （GenBank ID: X51948.1 )，设计了多条多重DPO-PCR引物 并进行了大量筛选，综合其特异性、灵敏度、引物与引物之间的作用，以及所使用的各引物 与多重DPO-PCR扩增试剂盒的适配性，最终筛选出特异性好、重复性好且灵敏度高的如下可 同时检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的多重DPO-PCR引物组合（引物序列中的I为次黄嘌呤）：
[0059] VP-F：57-AGCGCAAGTCACAGAGAAAGTTGAIIIIIATCAGCA CGA-37(SEQ ID NO：1)；
[0060] VP-RiS7-CTTTGCCACGTTGTACATGTGGTIIIIITCAAACGCC G-37(SEQ ID N0：2)；
[0061] VC-FiS7-CGCTCCTGTATTTGCTCACCAAGIIIIIGACTTTATT GTG-37(SEQ ID N0：3)；
[0062] VC-R:5' -GAGCATATAATCAAAGCCAACGTTAIIIIIAAGTCC CCAT-3' (SEQ ID NO:4)。
[0063] 上述多重DPO-PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成。
[0064] 利用上述多重DPO-PCR引物组合可同时针对副溶血弧菌和霍乱弧菌进行多重DPO-PCR扩增，得到的DPO-PCR扩增产物的大小分别为307bp和463bp。
[0065] 在应用上，上述两组引物对可应用于检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌上， 例如检测或辅助检测生物样品是否感染副溶血弧菌和霍乱弧菌，或检测或辅助检测病原菌 是否为或候选为副溶血弧菌和霍乱弧菌;还可以用来制备检测或辅助检测副溶血弧菌和霍 乱弧菌的产品，例如制备检测或辅助检测生物样品是否感染副溶血弧菌和霍乱弧菌的产 品，或制备检测或辅助检测病原菌为或候选为副溶血弧菌和霍乱弧菌的产品。
[0066] 实施例2
[0067] 本实施例提供了一种试剂盒及其应用，所述试剂盒包括：
[0068] (I)SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4(来自实施例 1);
[0069] (2)dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶中的至少一种。
[0070] 上述dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶优选来源于TaKaRa公司的货号为 RR060A的试剂盒。
[0071]进一步优选包括DNA提取试剂盒，所述DNA提取试剂盒优选来源于天根生化科技 (北京)有限公司货号为DP302的细菌基因组DNA提取试剂盒。
[0072]进一步优选包括阳性对照和阴性对照。
[0073] 实验证明，上述细菌基因组DNA提取试剂盒、TaKaRa公司的货号为RRO60A的试剂 盒，以及与SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4的联合使用，效果更加 优越，具体表现在特异性强、重复性好和灵敏度高。
[0074] 在应用上，上述试剂盒可应用于检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌上，例如 检测或辅助检测生物样品是否感染副溶血弧菌和霍乱弧菌，或检测或辅助检测待测生物样 品是否为或候选为副溶血弧菌和霍乱弧菌;还可以用来制备检测或辅助检测副溶血弧菌和 霍乱弧菌的产品，例如制备检测或辅助检测生物样品是否感染副溶血弧菌和霍乱弧菌的产 品，或制备检测或辅助检测病原菌为或候选为副溶血弧菌和霍乱弧菌的产品。
[0075] 实施例3
[0076]本实施例提供了一种检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的方法，例如检测或 辅助检测生物样品是否感染副溶血弧菌和霍乱弧菌，或检测或辅助检测病原菌是否为或候 选为副溶血弧菌和霍乱弧菌，该方法使用了实施例1的两组引物对或实施例2的试剂盒。 [0077]上述方法包括如下步骤：
[0078] 步骤一：多重DPO-PCR扩增
[0079]以生物样品或病原菌的DNA为模板，采用两组引物对进行多重DPO-PCR扩增，得到 多重DPO-PCR扩增产物，同时设置空白对照(模板为超纯水）。
[0080] 多重DPO-PCR反应体系如表1所示。其中，Mix 2内含dNTPs、MgCl2和反应缓冲液； Mix 1内含DNA聚合酶，Mix 2和Mix 1均来自TaKaRa公司的货号为RR060A的试剂盒。
[0081] 表1
LUUB3J 多里UPO-PCK反应条仵：941:预雙性Imin;然后941:雙性30s，60XJ退火90s，72XJ延 伸90s，在此条件下进行40个循环;最后72 °C再延伸IOmin。
[0084] 步骤二:多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测
[0085]多重DPO-PCR反应结束后，取5yL的多重DPO-PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳 检测，在凝胶成像系统上观察结果并对扩增产物进行测序。
[0086]所述多重DPO-PCR扩增的结果判断的标准为：
[0087]若所述多重DPO-PCR扩增得到的扩增产物同时含有大小为463bp和307bp的片段， 则所述生物样品同时感染副溶血弧菌和霍乱弧菌，或病原菌为或候选为副溶血弧菌和霍乱 弧菌;若所述多重DPO-PCR扩增得到的扩增产物只含有大小为307bp的片段，则所述生物样 品感染副溶血弧菌且排除霍乱弧菌，或病原菌为或候选为副溶血弧菌且排除霍乱弧菌;若 所述多重DPO-PCR扩增得到的扩增产物只含有大小为463bp的片段，则所述生物样品感染霍 乱弧菌且排除副溶血弧菌，或病原菌为或候选为霍乱弧菌且排除副溶血弧菌;若所述多重 DPO-PCR扩增得到的扩增产物未含有大小为463bp和307bp的片段，则所述生物样品未感染 副溶血弧菌和霍乱弧菌，或病原菌不为或候选不为副溶血弧菌和霍乱弧菌。
[0088] 如果生物样品或病原菌还未提取DNA，上述方法步骤（1)多重DPO-PCR扩增之前还 可以包括使用细菌基因组DNA提取试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司，货号为 DP302)按照试剂盒说明书对生物样品或病原菌中的DNA进行提取的步骤。
[0089] 实施例4
[0090] 本实施例对实施例3建立的检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的方法进行了 有效性验证，所用的供试材料如下:副溶血弧菌和霍乱弧菌。
[0091] 步骤一:基因组DNA的提取
[0092]采用天根生化科技(北京)有限公司的货号为DP302的细菌基因组DNA提取试剂盒 按照试剂盒说明书分别提取副溶血弧菌和霍乱弧菌的基因组DNA。
[0093] 步骤二：多重DPO-PCR扩增
[0094]采用阴性对照模板和各种基因组DNA模板：
[0095]组1以水为模板(阴性对照）；
[0096] 组2以副溶血弧菌和霍乱弧菌的基因组DNA混合物为模板；
[0097] 组3以副溶血弧菌的基因组DNA为模板；
[0098] 组4以霍乱弧菌的基因组DNA为模板。
[0099]分别以组1-组4为模板，进行多重DPO-PCR扩增，多重DPO-PCR扩增的方法同实施例 3的步骤一。
[0100] 步骤三:多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测
[0101 ]多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测的方法同实施例3的步骤二。
[0102] 结果分析：
[0103] 结果如图1所示，组1(阴性对照）的DPO-PCR扩增产物无条带;组2(副溶血弧菌和霍 乱弧菌）的DPO-PCR扩增产物含有2个条带，大小分别为307bp和463bp;组3 (副溶血弧菌）的 DPO-PCR扩增产物含有1个条带，大小为307bp;组4(霍乱弧菌）的DPO-PCR扩增产物含有1个 条带，大小为463bp。说明本发明的基于实施例1的两组引物对和实施例2的试剂盒建立的检 测或辅助副溶血弧菌和霍乱弧菌的方法可以有效检测副溶血弧菌和霍乱弧菌。
[0104] 实施例5
[0105] 本实施例对实施例1的两组引物对进行了特异性验证，所用的供试材料如下：副溶 血弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、美丽弧菌、河流弧菌、哈维氏弧菌、大肠 杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和单增李斯特菌。
[0106] 步骤一:基因组DNA的提取
[0107]采用天根生化科技(北京)有限公司的货号为DP302的细菌基因组DNA提取试剂盒 按照试剂盒说明书分别提取副溶血弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、美丽弧 菌、河流弧菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的基因组 DNA0
[0108] 步骤二：多重DPO-PCR扩增
[0109] 采用阴性对照模板和各种基因组DNA模板：
[0110]组1以水为模板(阴性对照）。
[0111] 组2以副溶血弧菌和霍乱弧菌的基因组DNA混合物为模板(阳性对照）。
[0112] 组3以副溶血弧菌的基因组DNA为模板。
[0113] 组4以霍乱弧菌的基因组DNA为模板。
[0114] 组5以溶藻弧菌的基因组DNA为模板。
[0115] 组6以创伤弧菌的基因组DNA为模板。
[0116] 组7以拟态弧菌的基因组DNA为模板。
[0117] 组8以美丽弧菌的基因组DNA为模板。
[0118] 组9以河流弧菌的基因组DNA为模板。
[0119] 组10以哈维氏弧菌的基因组DNA为模板。
[0120]组11以大肠杆菌的基因组DNA为模板。
[0121] 组12以金黄色葡萄球菌的基因组DNA为模板。
[0122] 组13以沙门氏菌的基因组DNA为模板
[0123] 组14以单增李斯特菌的基因组DNA为模板。
[0124] 分别以组1 -组14为模板，进行多重DPO-PCR扩增，多重DPO-PCR扩增的方法同实施 例3的步骤一。
[0125] 步骤三:多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测
[0126] 多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测的方法同实施例3的步骤二。
[0127] 结果分析：
[0128] 结果如图2所示，从组3-组14中顺利检出组3的副溶血弧菌和组4霍乱弧菌，其余组 5-组14均无扩增，由此证明本发明实施例1的两组引物对具有高特异性;进一步的，本发明 基于两组引物对及试剂盒建立的检测或辅助副溶血弧菌和霍乱弧菌的方法能够准确的对 副溶血弧菌和霍乱弧菌进行检测。
[0129] 实施例6
[0130] 本实施例对实施例1的两组引物对进行了灵敏度验证，所用的供试材料如下：副溶 血弧菌和霍乱弧菌。
[0131] 步骤一:基因组DNA的提取
[0132] 采用天根生化科技(北京)有限公司的货号为DP302的细菌基因组DNA提取试剂盒 按照试剂盒说明书分别提取副溶血弧菌和霍乱弧菌的基因组DNA，并将得到的基因组DNA进 行10倍稀释，制备不同浓度的副溶血弧菌的基因组DNA和霍乱弧菌的基因组DNA的混合物。
[0133] 步骤二：多重DPO-PCR扩增
[0134] 采用不同浓度的副溶血弧菌的基因组DNA和霍乱弧菌的基因组DNA的混合物作为 模板：
[0135] 组1:以IOOngAxL的副溶血弧菌基因组DNA(IyL)和IOOngAxL的霍乱弧菌的基因组 DNA(IyL)为模板。
[0136] 组2:以IOngAxL的副溶血弧菌基因组DNA(IyL)和IOngAxL的霍乱弧菌的基因组DNA (IyL)为模板。
[0137] 组3:以Ing/yL的副溶血弧菌基因组DNA(IyL)和Ing/yL的霍乱弧菌的基因组DNA(1 yL)为模板。
[0138] 组4:以0.1 ngAxL的副溶血弧菌基因组DNA(IyL)和0.1 ngAxL的霍乱弧菌的基因组 DNA(IyL)为模板。
[0139] 组5:以0.OlngAxL的副溶血弧菌基因组DNA(IyL)和0.OlngAxL的霍乱弧菌的基因 组DNA(IyL)为模板。
[0140] 组6:以0.OOlngAxL的副溶血弧菌基因组DNA(IyL)和0.OOlngAxL的霍乱弧菌的基 因组DNA(IyL)为模板。
[0141] 分别以组1-组6为模板，进行多重DPO-PCR扩增，多重DPO-PCR扩增的方法同实施例 3的步骤一。
[0142] 步骤三:多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测
[0143] 多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测的方法同实施例3的步骤二。
[0144] 结果分析：
[0145] 结果如图3所示，组1-4有条带，说明本发明实施例1的两组引物对具有较高的灵敏 度，可检测出样品中仅含有〇. Ing的微量DNA。
[0146] 实施例7
[0147] 本实施例提供了对实施例1的两组引物对的退火温度敏感性的检测，包括如下步 骤：
[0148] 步骤一:基因组DNA的提取
[0149] 采用天根生化科技(北京)有限公司的货号为DP302的细菌基因组DNA提取试剂盒 按照试剂盒说明书分别提取副溶血弧菌和霍乱弧菌的基因组DNA，将副溶血弧菌和霍乱弧 菌的基因组DNA混合得到副溶血弧菌和霍乱弧菌的基因组DNA混合物。
[0150] 步骤二：多重DPO-PCR扩增
[0151] 采用副溶血弧菌和霍乱弧菌的基因组DNA混合物进行多重DPO-PCR扩增，用不同的 退火温度(45 °C、50 °C、55 °C、60 °C、65 °C)分别进行DPO-PCR扩增，其余反应条件同实施例3的 步骤一，分别得到多重DPO-PCR扩增产物。
[0152] 步骤三:多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测
[0153 ]多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测的方法同实施例3的步骤二。
[0154] 结果分析：
[0155] 结果如图4所示：电泳检测结果显示用不同的退火温度(45°C、50°C、55°C、60°C、65 °C)进行多重DPO-PCR扩增得到的多重DPO-PCR扩增产物均含有大小为307bp和463bp的片 段，无非特异性扩增条带，说明本发明的多重DPO-PCR引物对退火温度不敏感。
[0156] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 两组引物对，其特征在于，其中一组引物对包含SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示的 核苷酸序列，另一组引物对包含SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。2. 根据权利要求1所述的两组引物对在检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌，或制 备检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的产品中的应用； 任选的，所述检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌包括:检测或辅助检测生物样品 是否感染副溶血弧菌和霍乱弧菌，以及检测或辅助检测病原菌是否为或候选为副溶血弧菌 和霍乱弧菌； 任选的，所述制备检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的产品包括：制备检测或辅 助检测生物样品是否感染副溶血弧菌和霍乱弧菌的产品，以及制备检测或辅助检测病原菌 为或候选为副溶血弧菌和霍乱弧菌的广品。3. -种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的两组引物对。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR扩增试剂； 任选的，所述PCR扩增试剂包括dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液和Taq DNA聚合酶中的至少 一种； 任选的，所述dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液和Taq DNA聚合酶均来源于TaKaRa公司的货号 为RR060A的试剂盒； 任选的，还包括DNA提取试剂盒； 任选的，所述DNA提取试剂盒包括来自天根生化科技有限公司货号为DP302的细菌基因 组DNA提取试剂盒所包含的试剂； 任选的，还包括阳性对照和阴性对照。5. 权利要求3或4所述的试剂盒在检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌，或制备检测 或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的产品中的应用； 任选的，所述检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌包括:检测或辅助检测生物样品 是否感染副溶血弧菌和霍乱弧菌，以及检测或辅助检测病原菌是否为或候选为副溶血弧菌 和霍乱弧菌； 任选的，所述制备检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的产品包括：制备检测或辅 助检测生物样品是否感染副溶血弧菌和霍乱弧菌的产品，以及制备检测或辅助检测病原菌 为或候选为副溶血弧菌和霍乱弧菌的广品。6. -种检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的多重DP0-PCR方法，其特征在于，包括 使用权利要求1所述的两组引物对或权利要求3-4中任一项所述试剂盒的步骤； 任选的，所述检测或辅助检测副溶血弧菌和霍乱弧菌包括:检测或辅助检测生物样品 是否感染副溶血弧菌和霍乱弧菌，以及检测或辅助检测病原菌是否为或候选为副溶血弧菌 和霍乱弧菌。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于:包括如下步骤： 1) 多重DP0-PCR扩增 以生物样品或病原菌含有的DNA为模板与权利要求1所述的两组引物对或权利要求3-4 中任一项所述试剂盒进行多重DP0-PCR扩增； 2) 根据多重DP0-PCR扩增的结果判断生物样品是否感染副溶血弧菌和霍乱弧菌，或病 原菌是否为或候选为副溶血弧菌和霍乱弧菌； 任选的，在步骤1)之前还包括在生物样品或病原菌中提取DNA的步骤； 任选的，所述在生物样品或病原菌中提取DNA是采用天根生化科技有限公司货号为 DP302的细菌基因组DNA提取试剂盒进行； 任选的，所述多重DPO-PCR扩增的结果判断的标准为： 若所述多重DPO-PCR扩增得到的扩增产物同时含有大小为463bp和307bp的片段，则所 述生物样品同时感染副溶血弧菌和霍乱弧菌，或病原菌为或候选为副溶血弧菌和霍乱弧 菌;若所述多重DPO-PCR扩增得到的扩增产物只含有大小为307bp的片段，则所述生物样品 感染副溶血弧菌且排除霍乱弧菌，或病原菌为或候选为副溶血弧菌且排除霍乱弧菌;若所 述多重DPO-PCR扩增得到的扩增产物只含有大小为463bp的片段，则所述生物样品感染霍乱 弧菌且排除副溶血弧菌，或病原菌为或候选为霍乱弧菌且排除副溶血弧菌；若所述多重 DPO-PCR扩增得到的扩增产物未含有大小为463bp和307bp的片段，则所述生物样品未感染 副溶血弧菌和霍乱弧菌，或病原菌不为或候选不为副溶血弧菌和霍乱弧菌。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述多重DPO-PCR扩增的反应体系如下： 模板DNA 50 ng 两组引物对 其中每条引物的终浓度均为0.2 μ mol/L Mix 1 0.25 μL^ Mix 2 25 μL ddH,(3 补足允50 pL; 任选的，所述Mix 1内含DNA聚合酶，Mix 2内含dNTPs、MgCl2、反应缓冲液； 任选的，所述Mix 1和Mix 2均来自TaKaRa公司的货号为RR060A试剂盒； 任选的，所述多重DPO-PCR反应条件为:94°C 1分钟；94°C 30秒，退火温度为45 °C~65°C 90秒，72 °C 90秒，共40个循环;72 °C 10分钟； 任选的，所述退火温度为60°C。9. 一种筛选副溶血弧菌和霍乱弧菌的系统，其特征在于，包括： 核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取所述生物样品或病原菌中的核酸样本； 多重DP0-PCR扩增装置，所述多重DP0-PCR扩增装置与所述核酸提取装置相连，适用于 采用权利要求1所述的两组引物对或权利要求3-4中任一项所述试剂盒对所述核酸样本进 行多重DP0-PCR扩增；以及 判断装置，所述判断装置与所述多重DP0-PCR扩增装置相连，以便基于多重DP0-PCR扩 增的结果，判断所述生物样品是否感染副溶血弧菌和霍乱弧菌，或病原菌是否为或候选为 副溶血弧菌和霍乱弧菌。10. 根据权利要求9所述的系统，其特征在于： 所述多重DP0-PCR扩增的反应体系如下： 核酸样本 50 ng 两组引物对 其中每条引物的终浓度均为0.2 pmol/L Mix 1 0.25 pL Mix 2 uL ddH20 补足半50 μL; 任选的，所述Mix 1内含DNA聚合酶，Mix 2内含dNTPs、MgCl2、反应缓冲液； 任选的，所述Mix 1和Mix 2来自TaKaRa公司的货号为RR060A试剂盒； 任选的，所述多重DP0-PCR反应条件为:94°C 1分钟；94°C 30秒，退火温度为45 °C~65°C 90秒，72 °C 90秒，共40个循环;72 °C 10分钟； 任选的，所述退火温度为60°C。
【文档编号】C12Q1/04GK105861499SQ201610414413
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月13日
【发明人】龙阳, 汪天杰, 魏霜, 马新华, 袁俊杰, 张娜, 杨卓瑜, 杨劲, 丁秀琼, 刘骁
【申请人】湛江出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 中华人民共和国汕头出入境检验检疫局