自然杀伤细胞的体外扩增方法
【专利摘要】本发明公开了一种自然杀伤细胞的体外扩增方法，包括以下步骤：S1、将从外周血中分离获得的单个核细胞用无血清培养液进行培养，同时加入IFN?γ刺激第一预定时间；S2、在所述第一预定时间后，在所述无血清培养液中加入第一类细胞因子进行刺激诱导；S3、培养第二预定时间后，在所述无血清培养液中加入第二类细胞因子进行诱导扩增，并进行细胞补液，培养第三预定时间；S4、收集细胞。根据本发明实施例的自然杀伤细胞的体外扩增方法，所培养出来的NK细胞对于靶细胞的杀伤效果更强，作用更明显。
【专利说明】
自然杀伤细胞的体外扩増方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及细胞培养技术领域，更具体地，涉及一种自然杀伤细胞的体外扩增方法。
【背景技术】
[0002]自然杀伤细胞(naturalkiller cell，NK)是属淋巴细胞谱系，含有穿孔蛋白和粒酶颗粒的细胞毒性淋巴细胞。其对靶细胞的识别无MHC限制性，无需预先致敏即可直接杀伤肿瘤细胞，也可分泌细胞因子调节其他免疫细胞的功能，是机体天然免疫的主要承担者，也是获得性细胞免疫的核心调节细胞，在肿瘤免疫、抗病毒感染及清除非己细胞中发挥重要作用。有研究证明自然杀伤细胞其实不仅是天然免疫系统中的重要作用成分，它同样具有获得性免疫细胞的一些特征。在免疫系统中，NK细胞反应的速度比T细胞或B细胞要快，其作用机制主要是识别靶细胞，通过释放穿孔素、颗粒酶和分泌多种细胞因子，迅速溶解某些肿瘤细胞，发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。
[0003]但由于NK细胞在人外周血中的含量极低及肿瘤组织中分布频率较低(<10%)，仅占单个核细胞的5%_10%，极大的限制了NK细胞作为过继免疫细胞在临床上的应用。多年来，人们一直尝试能在体外实现NK细胞的大量扩增，但是目前的常规技术主要是在体外培养体系中加入IL-2、IL-12、IL-15和γ-1FN等因子组合来促进NK的扩增，经过一段时间的培养后仅可以使NK细胞扩增几倍或十几倍，纯度亦不理想，因此也不能满足实际的应用。并且这种方法因子需求量较大，成本较高，培养效果不稳定，不适合体外大规模的应用。
【发明内容】
[0004]本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。为此，本发明提出一种自然杀伤细胞的体外扩增方法，该扩增方法流程短，成本低，培养效果好。
[0005]根据本发明实施例的自然杀伤细胞的体外扩增方法，包括以下步骤:S1、将从外周血中分离获得的单个核细胞用无血清培养液进行培养，同时加入IFN- γ刺激第一预定时间；S2、在所述第一预定时间后，在所述无血清培养液中加入第一类细胞因子进行刺激诱导；S3、培养第二预定时间后，在所述无血清培养液中加入第二类细胞因子进行诱导扩增，并进行细胞补液，培养第三预定时间；S4、收集细胞。
[0006]根据本发明实施例的自然杀伤细胞的体外扩增方法，采用类似CIK方法的细胞前期诱导扩增方法，使细胞在分化的同时还能保证大量的扩增，以确保后期细胞再次诱导的成功。并且相比较于传统的方法，本方法在前期诱导过程中，并没有添加PHA或者其他类似的能够刺激细胞大量扩增的化学物质，并不存在对免疫细胞过度刺激的作用，因此所培养出来的NK细胞对于靶细胞的杀伤效果更强，作用更明显。
[0007]另外，根据本发明上述实施例的自然杀伤细胞的体外扩增方法，还可以具有如下附加的技术特征:
[0008]根据本发明的一个实施例，所述步骤SI包括:S11、采集外周血，并将采集的血样进行离心分离，得到上层血浆和下层血液;S12、吸取上层血浆，56度灭活后备用；S13、将下层血液用生理盐水稀释至原血样的体积，混匀，得到稀释血液;S14、将稀释血液加入添加有淋巴细胞分离液的离心管中进行离心，吸取分离液界面乳白色单个核细胞层转移至离心管中，离心两次并计数；S15、用无血清培养基将单个核细胞重悬，并调整细胞浓度至1.5 X1fVml，并转移至培养瓶中继续培养;S16、在所述培养瓶中加入无血清培养基，并按照10 %的浓度在培养基中加入56度灭活的所述上层血浆，同时加入干扰素-γ刺激第一预定时间。
[0009]根据本发明的一个实施例，在所述步骤SI中，所述干扰素-γ的浓度为2000U/ml，所述第一预定时间为22-26小时。
[0010]根据本发明的一个实施例，在所述步骤SI中，所述单个核细胞在5%二氧化碳以及37度环境下在所述无血清培养液内培养。
[0011]根据本发明的一个实施例，在所述步骤S2中，所述第一类细胞因子为鼠抗人CD3单克隆抗体、人重组白介素-1a和人重组白介素-2。
[0012]根据本发明的一个实施例，所述鼠抗人⑶3单克隆抗体的浓度为80-100ng/ml，所述人重组白介素-1a的浓度为900-1000U/ml，所述人重组白介素-2的浓度为1000U/ml。
[0013]根据本发明的一个实施例，在所述步骤S3中，所述第二预定时间为3-5天，所述第三预定时间为8-10天。
[0014]根据本发明的一个实施例，所述第二类细胞因子为重组白介素-15和重组白介素-1。
[0015]根据本发明的一个实施例，所述重组白介素-15的浓度为45-55ng/ml，所述重组白介素-7的浓度为70-80ng/ml。
[0016]根据本发明的一个实施例，在所述步骤S3中，所述细胞补液的成分添加了人重组白介素-2、硫酸庆大霉素和自体血浆的无血清培养液，所述人重组白介素-2的浓度为I X106U/L，硫酸庆大霉素浓度为8X 104U/L，自体血浆浓度为1%。
[0017]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0018]本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:
[0019]图1是根据本发明实施例的自然杀伤细胞的体外扩增方法的流程图；
[0020]图2是采用本发明实施例的自然杀伤细胞的体外扩增方法和常规扩增方法培养的自然杀伤细胞扩增倍数对比图；
[0021]图3是采用常规扩增方法培养自然杀伤细胞的纯度示意图；
[0022]图4是采用本发明实施例的自然杀伤细胞的体外扩增方法培养自然杀伤细胞的纯度示意图；
[0023]图5是采用本发明实施例的自然杀伤细胞的体外扩增方法和常规扩增方法获得的自然杀伤细胞培养杀伤活性对比图。
【具体实施方式】
[0024]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0025]下面结合附图1具体描述根据本发明实施例的自然杀伤细胞的体外扩增方法。
[0026]如图1所示，根据本发明实施例的自然杀伤细胞的体外扩增方法包括以下步骤:
[0027]S1、将从外周血中分离获得的单个核细胞用无血清培养液进行培养，同时加入IFN-γ刺激第一预定时间。
[0028]S2、在第一预定时间后，在无血清培养液中加入第一类细胞因子进行刺激诱导。
[0029]S3、培养第二预定时间后，在无血清培养液中加入第二类细胞因子进行诱导扩增，并进行细胞补液，培养第三预定时间。
[0030]S4、收集细胞。
[0031 ]由此，根据本发明实施例的自然杀伤细胞的体外扩增方法，采用类似CIK方法的细胞前期诱导扩增方法，使细胞在分化的同时还能保证大量的扩增，以确保后期细胞再次诱导的成功。并且相比较于传统的方法，本方法在前期诱导过程中，并没有添加PHA或者其他类似的能够刺激细胞大量扩增的化学物质，并不存在对免疫细胞过度刺激的作用，因此所培养出来的NK细胞对于靶细胞的杀伤效果更强，作用更明显。
[0032]根据本发明的一个实施例，步骤SI包括:S11、采集外周血，并将采集的血样进行离心分离，得到上层血浆和下层血液；S12、吸取上层血浆，56度灭活后备用；S13、将下层血液用生理盐水稀释至原血样的体积，混匀，得到稀释血液;S14、将稀释血液加入添加有淋巴细胞分离液的离心管中进行离心，吸取分离液界面乳白色单个核细胞层转移至离心管中，离心两次并计数;S15、用无血清培养基将单个核细胞重悬，并调整细胞浓度至1.5 X 1Vml，转移至培养瓶中继续培养;S16、在上述培养瓶中加入无血清培养基，并按照10%的浓度在培养基中加入56度灭活的上层血浆，同时加入干扰素-γ刺激第一预定时间。
[0033]优选地，在步骤SI中，干扰素-γ的浓度为2000U/ml，第一预定时间为22_26小时。进一步地，在步骤SI中，单个核细胞在5%二氧化碳以及37度环境下在无血清培养液内培养。
[0034]在本发明的一些【具体实施方式】中，在步骤S2中，第一类细胞因子为鼠抗人CD3单克隆抗体、人重组白介素-1a和人重组白介素-2。优选地，鼠抗人CD3单克隆抗体的浓度为80-100ng/ml，人重组白介素-1a的浓度为900-1000U/ml，人重组白介素-2的浓度为1000U/ml。
[0035]根据本发明的一个实施例，在步骤S3中，第二预定时间为3-5天，第三预定时间为8-10天。优选地，第二类细胞因子为重组白介素-15和重组白介素-7。进一步地，重组白介素-15的浓度为45-55呢/1111，重组白介素-7的浓度为70-80呢/1111。
[0036]在本发明的一些【具体实施方式】中，在步骤S3中，细胞补液的成分为添加了人重组白介素-2、硫酸庆大霉素和自体血浆的无血清培养液，人重组白介素-2的浓度为I X 16U/L，硫酸庆大霉素浓度为8 X 104U/L,自体血浆浓度为I %。
[0037]换言之，为了解决现有技术中NK细胞扩增后纯度不理想、成本偏高等问题，本发明提供一种新的NK细胞的体外扩增的方法，可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活性强的NK细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标。
[0038]具体地，根据本发明实施例的自然杀伤细胞的体外扩增方法可以由以下步骤构成:
[0039]a:将从外周血中分离获得的单个核细胞用无血清培养液接种在细胞培养瓶中，同时加入干扰素-γ (IFN- γ )，刺激24h。
[0040]b:24h后在培养瓶中添加鼠抗人CD3单克隆抗体(CD3)，人重组白介素-2(IL-2)，人重组白介素-1a(IL-1a)等细胞因子，进行刺激诱导。
[0041 ] c:第3、4、5天对细胞进行观察，并按照情况进行细胞补液，细胞补液培养基为添加了人重组白介素_2、硫酸庆大霉素和自体血浆的无血清培养液。
[0042]d:第六天在培养基中添加重组白介素-15(IL-15)和重组白介素_7(1L_7)，对细胞再次进行诱导刺激24h，然后转入细胞培养袋中继续培养。
[0043]e:收获NK细胞。
[0044]根据本发明实施例的自然杀伤细胞的体外扩增方法，从临床实际应用可行性出发，在考虑安全性、有效性的前提下，通过对细胞来源、应用的培养基类型、细胞因子组合以及NK细胞临床上实际应用时患者可接受成本等各方面综合衡量，优化出最佳NK细胞培养扩增方案，以期为能够实现NK细胞在临床过继免疫疗法的大规模应用，提高临床疗效并减轻患者经济负担奠定基础。
[0045]根据本发明实施例的自然杀伤细胞的体外扩增方法可以产生如下有益效果:
[0046]第一，针对传统方法中NK细胞前期扩增问题，本发明的扩增方法采用类似CIK方法的细胞前期诱导扩增方法，使细胞在分化的同时还能保证大量的扩增，以确保后期细胞再次诱导的成功。
[0047]第二，传统的方法中难以解决NK细胞的纯度问题，本发明的扩增方法采用IL-15，IL-7结合IL-2对NK细胞进行综合诱导。因为PBMC中细胞表型种类很多，而具有NK细胞表型的只有5%左右，大部分都是具有⑶3表型的T细胞，所以需要使用精确浓度的IL-15以及IL-7进行刺激，同时使用IL-2对细胞进行诱导扩增，本发明的扩增方法培养的NK细胞的纯度能够达到96%左右。
[0048]第三，相比较于传统的方法，本发明的扩增方法在前期诱导过程中，并没有添加PHA或者其他类似的能够刺激细胞大量扩增的化学物质，并不存在对免疫细胞过度刺激的作用，因此所培养出来的NK细胞对于靶细胞的杀伤效果更强，作用更明显。
[0049]另外，目前基于NK细胞的肿瘤生物治疗取得了较大进展，但是NK细胞只占正常外周血淋巴细胞的5 %左右，含量很少，而无论是从外周血中直接提取NK细胞还是采用细胞因子组合诱导(组合细胞因子直接诱导需要的细胞因子浓度较高)的方法，成本都较高，而且培养出来的NK细胞，状态一般，纯度也不高，细胞的杀伤活性也不强。
[0050]相比较于传统的方法，本发明的扩增方法首先解决了细胞扩增的问题，传统的方法在PBMC提取之后，细胞前期扩增倍数有限，导致后期分化成的NK细胞增值速率降低，细胞培养周期增加，从而导致收获的NK细胞状态一般，细胞杀伤活性不强;本发明的扩增方法前期的细胞诱导方法能够使细胞分化的同时大量扩增，从而保证二次诱导后，细胞的扩增的起始数目。
[0051 ]在细胞的纯度方面，本发明的扩增方法采用IL-15，IL-7结合IL-2对NK细胞进行综合诱导，三种因子的浓度都是经过反复试验得出的结果，在大大降低成本的同时还能够很好地提高细胞的纯度。
[0052]在细胞的杀伤活性方面，本发明的扩增方法诱导出来的NK细胞对于靶细胞的杀伤效果更强，在细胞的诱导过程中，并不存在对免疫细胞过度刺激以及过度诱导增殖的作用，细胞在14天左右收集时，细胞活性还很强，细胞的纯度也很高，因此，细胞对靶细胞的杀伤效应很强。
[0053]下面结合具体实施例描述根据本发明实施例的自然杀伤细胞的体外扩增方法。
[0054]实施例一
[0055]一、外周血单个核细胞(PBMC)的分离和NK细胞的培养
[0056]1、采用本发明实施例的自然杀伤细胞的体外扩增方法进行外周血单个核细胞(PBMC)的分离和NK细胞的培养(实施例)
[0057]通过手采的方法采集外周血100ml，将采集的血样转至50ml离心管中。700g，离心分离1min，吸取上层血浆，56度灭活，待培养时备用。
[0058]用0.9%生理盐水稀释下层血液至原体积，混匀。将稀释血液等分成5份，分别缓慢加入添加有淋巴细胞分离液的离心管中，900g，离心20min。吸取分离液界面乳白色单个核细胞层，离心洗涤2次并计数。用无血清培养基将PBMC重悬，并调整细胞浓度至1.5 X 16/ml，转移细胞至T75培养方瓶中。
[0059]预先在T75培养方瓶中加入无血清培养基，并按照10%的浓度在培养基中加入自体血浆，同时加入细胞因子IFN- γ (2000U/ml ),5% 二氧化碳，37度培养24小时。
[0060]24 小时后在培养瓶中分别加入 Ant1-CD3McAb(80-100ng/ml)、IL-la(900-1000U/ml)和IL-2(1000U/ml)三种因子，对细胞进行诱导扩增，培养到第六天左右，在培养基中分别加入IL-15(50ng/ml)，IL-7(75ng/ml)对细胞诱导，同时细胞补液，此时细胞补液成分为添加了人重组白介素-2、硫酸庆大霉素和自体血浆的无血清培养液，扩增至第15天左右，对细胞进行收集。
[0061 ] 2、采用常规方法进行NK细胞的培养(对比例)
[0062]其中，外周血单核细胞的提取同上，提取之后，转入T75培养方瓶，同时添加10%的自体血浆以及11^-2，11^-12，几-7，11^-15四种细胞因子对细胞进行诱导扩增，培养基、培养时间、以及其他培养条件与上述培养方法相同。
[0063 ] 二、实施例与对比例的细胞扩增倍数的比较
[0064]分别在第O、7、14天从实施例和对比例中取培养细胞，用台盼蓝染色后计数，将计数当天的细胞总数除以培养前的细胞数(即第O天)，数值即为细胞的扩增倍数。以此方法可以动态比较两组细胞的扩增情况。
[0065]对比结果如图2所示。在培养的第7、14、21天，采用本发明实施例的自然杀伤细胞的体外扩增方法的对比例的NK细胞扩增倍数均显著高于对比例的扩增倍数。
[0066]三、实施例与对比例的细胞纯度的比较
[0067]在第14天分别从实施例和对比例两组培养体系取细胞培养液，PBS洗涤两次，洗涤后调整细胞浓度为2 X105/ml，加入流式抗体，4°C避光30min，洗掉多余抗体，PBS重悬上机检测。所用抗体来自美国BD公司。
[0068]实验结果如图3和图4所示，其中图3是对比例采用常规扩增方法培养自然杀伤细胞的纯度示意图，图4是实施例采用本发明实施例的自然杀伤细胞的体外扩增方法培养自然杀伤细胞的纯度示意图。
[0069]从图3和图4中可以看出，对比例的⑶(16+56)+⑶3 — NK细胞占65.27%，而实施例的⑶(16+56)+⑶3 — NK细胞占95.93%，可见，采用本发明实施例的自然杀伤细胞的体外扩增方法的NK细胞的纯度明显高于常规组。
[0070]四、实施例与对比例所得NK细胞对K562细胞杀伤活性的比较。
[0071]以处于对数生长期的K562细胞作为靶细胞，将其调整为IX 105/mL，将实施例和对比例两种方法培养14天的NK细胞作为效应细胞，按1: 1、2:1、5:1和10:1的效靶比将效应细胞和靶细胞混合，同时设效应细胞孔、靶细胞孔，每组均设3个平行孔，每孔终体积为200μ1，37°C、5%，C02培养箱中孵育，12h后每孔加入20ylCCK-8溶液，继续孵育4h，用酶标仪检测450nm时的OD值，按以下公式计算杀伤率:
[0072]杀伤率(％) = [1-(实验孔OD值-效应孔OD值/靶细胞孔OD值)]X100%。
[0073]结果如图5所示，在不同效靶比，实施例所得NK细胞对K562细胞的杀伤活性均显著高于对比例。
[0074]因此，通过上述实施例可以看出，本发明的扩增方法能够使细胞分化的同时大量扩增，在大大降低成本的同时还能够很好地提高细胞的纯度，并且本发明的扩增方法诱导出来的NK细胞对于靶细胞的杀伤效果更强。
[0075]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0076]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1.一种自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，包括以下步骤: 51、将从外周血中分离获得的单个核细胞用无血清培养液进行培养，同时加入干扰素-T刺激第一预定时间； 52、在所述第一预定时间后，在所述无血清培养液中加入第一类细胞因子进行刺激诱B寸； 53、培养第二预定时间后，在所述无血清培养液中加入第二类细胞因子进行诱导扩增，并进行细胞补液，培养第三预定时间； 54、收集细胞。2.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述步骤SI包括: SI 1、采集外周血，并将采集的血样进行离心分离，得到上层血浆和下层血液； 512、吸取上层血浆，56度灭活后备用； 513、将下层血液用生理盐水稀释至原血样的体积，混匀，得到稀释血液； 514、将稀释血液加入添加有淋巴细胞分离液的离心管中进行离心，分别吸取分离液界面乳白色单个核细胞层转移至离心管中，离心两次并计数； 515、用无血清培养基将单个核细胞重悬，并调整细胞浓度至1.5X 1iVml，转移至培养瓶中继续培养； SI 6、在所述培养瓶中加入无血清培养基，并按照10 %的浓度在培养基中加入56度灭活的所述上层血浆，同时加入干扰素-T刺激第一预定时间。3.根据权利要求1或2所述的自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，在所述步骤SI中，所述干扰素-γ的浓度为2000U/ml，所述第一预定时间为22-26小时。4.根据权利要求1或2所述的自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，在所述步骤SI中，所述单个核细胞在5%二氧化碳以及37度环境下在所述无血清培养液内培养。5.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，在所述步骤S2中，所述第一类细胞因子为鼠抗人CD3单克隆抗体、人重组白介素-1a和人重组白介素-2。6.根据权利要求5所述的自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述鼠抗人CD3单克隆抗体的浓度为80-100ng/ml，所述人重组白介素-1a的浓度为900-1000U/ml，所述人重组白介素-2的浓度为1000U/ml。7.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，在所述步骤S3中，所述第二预定时间为3-5天，所述第三预定时间为8-10天。8.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述第二类细胞因子为重组白介素-15和重组白介素-7。9.根据权利要求8所述的自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述重组白介素-15的浓度为45-55ng/ml，所述重组白介素-7的浓度为70-80ng/ml。10.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，在所述步骤S3中，所述细胞补液的成分为添加了人重组白介素-2、硫酸庆大霉素和自体血浆的无血清培养液，所述人重组白介素-2的浓度为I X 106U/L，硫酸庆大霉素浓度为8X 104U/L,自体血浆浓度为I %。
【文档编号】C12N5/0783GK105861435SQ201610309545
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】齐来俊, 姚逸江
【申请人】南京华奥生物医药技术有限公司