人源脐带血造血干细胞体外高效扩增方法
【专利摘要】本发明公开了人源脐带血造血干细胞体外高效扩增方法，其包括以下步骤：（1）采集脐带血:无菌条件下,针吸法抽取足月顺产或剖腹产手术的新生儿脐带血放入离心管内，用肝素抗凝，冷冻保存；（2）脐带间充质干细胞的体外培养、扩增；（3）生物活性因子的制备；（4）裂解液的制备。本发明的生物活性因子或物质中不含任何动物源成分，利用此生物活性因子或物质可开发成具有细胞生物学活性功能的产品，作用于人体后可活化机体干细胞，修复或替代受损、病变和衰老的细胞，具有调节机体细胞代谢功能，增强机体免疫力，延缓衰老等功效。
【专利说明】
人源脐带血造血干细胞体外高效扩増方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及人源脐带血造血干细胞体外高效扩增方法。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞，可以从骨髓、外周血、脂肪及皮肤等多种组织中获得，作为一类多能干细胞，它可以向成骨、软骨、肌肉、神经及胰岛样细胞等方向增殖分化。目前MSCs主要来源于成人骨髓，但成人骨髓MSCs细胞数量及增殖分化潜能随供体年龄的增加而下降，病毒感染率较高，且采集具有创伤，使其来源受限。最近，已开发出从脐带或胎盘组织提取MSCs,它也是一类具有多向分化潜能的干细胞，越来越多的研究表明其极具开发潜质，与骨髓MSCs相比具有明显的优势:(1)来源充足，取材方便，成本低廉；(2)间充质干细胞含量丰富，较为原始，分化能力强，可在体外进行分离、培养，扩增迅速，且生物学性状稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛功能，可以提供充足的细胞来源；(3)免疫原性极低，免疫排斥的概率极低，且还具有一定的免疫抑制功能；(4)可以支持造血和促进移植功能；(5)旁分泌能力强，在增殖生长过程中会产生大量生物活性因子。
[0003]干细胞不但可以产生或分泌大量的生物活性因子，而且干细胞内也含有丰富的生物活性物质，这些干细胞生物活性因子或物质可有效调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞等。例如干细胞可以产生干细胞生长因子(SCF)、神经生长因子(NGF)、基质细胞源性生长因子(SDF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、白介素-6与白介素-7(IL-6与IL-7)、巨核细胞集落刺激因子(M-CSF),肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)等因子，这些细胞因子具有促进细胞增殖、分化、抗凋亡等功能；干细胞还可以产生天然免疫蛋白，例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等，可以抵御或修复自身和外界因素对机体细胞造成的损伤。
[0004]因此，利用干细胞分泌产生的生物活性因子或干细胞内的生物活性物质激活机体干细胞，进而通过自身干细胞生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞，在疾病防治与保健美容领域具有广阔的应用前景。
[0005]为解决这一问题，本发明提供人源脐带血造血干细胞体外高效扩增方法，从人脐带造血中提取干细胞，利用无血清间充质干细胞培养基(不含动物源成分)进行体外培养、扩增，然后提取干细胞培养、扩增过程中分泌的生物活性因子和干细胞内的生物活性物质，利用这类生物活性因子或生物活性物质激活人体自身干细胞来生理性修复或替代机体损伤、病变和衰老的组织细胞。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的人源脐带血造血干细胞体外高效扩增方法。
[0007]为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案:
人源脐带血造血干细胞体外高效扩增方法，其包括以下步骤:
(1)采集脐带血:无菌条件下，针吸法抽取足月顺产或剖腹产手术的新生儿脐带血放入离心管内，用肝素抗凝，冷冻保存；
(2)脐带间充质干细胞的体外培养、扩增:①分离单个核细胞:在抽取新生儿脐带血后12 h内，用F1-coll- Hypaque分离液分离单个核细胞(MNC)，并用MDM培养液洗涤3次；
②将上述分离后的单个核细胞滴入Ig/L的I型胶原酶置于37°C振荡器中消化I h，消化后以I 000rr/mjn(离心半径16 cm)离心15min，吸出上层悬浮组分，100目筛网进行滤过，滤过后的液体以I 000 r/mjn(离心半径16 cm)离心5 mjn，弃上清液；
③将上述步骤②得到的消化液接种于MDM完全培养基(含20%的胎牛血清(FBS)、50μ mo I /L 2-巯基乙醇、10%胎牛血清、50 yg./mL抗坏血酸、0.5 mmol/L甘油磷酸)中，调整细胞密度为4.82 X 105/m I,然后于37 °C、饱和湿度条件下在5% 二氧化碳培养箱中培养；
④每3-5天半量换液I次，培养12天细胞生长约80%汇合，并收集更换的废培养液于-80 °C冰箱中保存；
⑤当细胞约80%汇合时，加入Ig/L胰蛋白酶对细胞进行消化15 min,以2X10 5cells/ml接种于培养皿中传代培养，并收集更换的废培养液于_80°C冰箱中保存；
⑥当细胞约80%汇合时，缓慢加入培养液，放入5%二氧化碳培养箱中37°C条件下培养，利用1.25 g/L胰蛋白酶对细胞进行消化20 min,以相差显微镜观察细胞游出的情况，待细胞密度达到80%后按1:2的比例传代，收集第I代细胞；
⑦再加入培养液，在二氧化碳培养箱中继续培养，每3-5天半量换液I次，并收集更换的废培养液于_80°C冰箱中保存；
⑧重复步骤⑤即可；
⑨分离、纯化获得高纯度间充质干细胞，利用FACSCalibur流式细胞仪分析其间充质干细胞纯度；
(3)生物活性因子的制备:将步骤(2)脐带干细胞培养、扩增过程中收集的废液融化、混合、低温分离、超滤和浓缩，
超滤和浓缩的处理方法为:利用3K的超滤膜过滤，体积浓缩1/10，保留生物活性物质，再经截留分子量为50KD中空纤维超滤柱超滤，将超滤后的液体进行浓缩，即可得到含有丰富干细胞生物活性因子的组合物；
(4)裂解液的制备:将体外培养获得的脐带造血干细胞浓度调整为5X106 - 1X107个/毫升密封于冻存管中经超低温液氮反复冻融5 -7次至细胞破碎，再通过低温分离、纯化等现代生物技术手段，便可获得高纯度的干细胞内生物活性物质群或组合物即为脐带干细胞裂解液。
[0008]本发明的有益效果:第一，本发明从脐带造血提取的干细胞进行培养、扩增，收集高产量、高纯度的干细胞，利用超低温等现代技术进行提取、分离、纯化等，从而获得高纯度、高产量和高活性的干细胞生物活性因子或物质;第二，克服了现有技术中利用含动物源成分培养基的不足，因为利用含有动物源成分的培养基进行干细胞培养、扩增，提取的分泌物质中不可避免的含有动物来源的成分甚至含有存在于动物体内的特定病毒等，若应用于临床或保健美容则存在较大的安全隐患；第三，本发明干细胞来源为脐带造血间充质干细胞，增殖分化能力强，易于控制，生物学性状稳定，从而保证了产品质量的稳定;第四，本发明通过对干细胞的物理性裂解破碎，提取了干细胞内的生物活性物质，因为干细胞在增殖分化过程很多生物活性物质并不分泌到细胞外，而这些物质对干细胞的增殖分化等有着重要作用。
【具体实施方式】
[0009]下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0010]实施例1:采集脐带血
无菌条件下，针吸法抽取足月顺产或剖腹产手术的新生儿脐带血放入离心管内，用肝素抗凝，冷冻保存；
实施例2:脐带间充质干细胞的体外培养、扩增
①分离单个核细胞:在抽取新生儿脐带血后12h内，用F1-coll- Hypaque分离液分离单个核细胞(MNC)，并用MDM培养液洗涤3次；
②将上述分离后的单个核细胞滴入Ig/L的I型胶原酶置于37°C振荡器中消化I h，消化后以I 000rr/mjn(离心半径16 cm)离心15min，吸出上层悬浮组分，100目筛网进行滤过，滤过后的液体以I 000 r/mjn(离心半径16 cm)离心5 mjn，弃上清液；
③将上述步骤②得到的消化液接种于MDM完全培养基(含20%的胎牛血清(FBS)、50μ mo I /L 2-巯基乙醇、10%胎牛血清、50 yg./mL抗坏血酸、0.5 mmol/L甘油磷酸)中，调整细胞密度为4.82 X 105/m I,然后于37 °C、饱和湿度条件下在5% 二氧化碳培养箱中培养；
④每3-5天半量换液I次，培养12天细胞生长约80%汇合，并收集更换的废培养液于-80 °C冰箱中保存；
⑤当细胞约80%汇合时，加入Ig/L胰蛋白酶对细胞进行消化15 min,以2X10 5cells/ml接种于培养皿中传代培养，并收集更换的废培养液于_80°C冰箱中保存；
⑥当细胞约80%汇合时，缓慢加入培养液，放入5%二氧化碳培养箱中37°C条件下培养，利用1.25 g/L胰蛋白酶对细胞进行消化20 min,以相差显微镜观察细胞游出的情况，待细胞密度达到80%后按1:2的比例传代，收集第I代细胞；
⑦再加入培养液，在二氧化碳培养箱中继续培养，每3-5天半量换液I次，并收集更换的废培养液于_80°C冰箱中保存；
⑧重复步骤⑤即可；
⑨分离、纯化获得高纯度间充质干细胞，利用FACSCalibur流式细胞仪分析其间充质干细胞纯度；
实施例3:生物活性因子的制备
将步骤(2)脐带干细胞培养、扩增过程中收集的废液融化、混合、低温分离、超滤和浓缩，超滤和浓缩的处理方法为:利用3K的超滤膜过滤，体积浓缩1/10，保留生物活性物质，再经截留分子量为50KD中空纤维超滤柱超滤，将超滤后的液体进行浓缩，即可得到含有丰富干细胞生物活性因子的组合物；
实施例4:裂解液的制备
将体外培养获得的脐带造血干细胞浓度调整为5X10 6 - 1X10 7个/毫升密封于冻存管中经超低温液氮反复冻融5 -7次至细胞破碎，再通过低温分离、纯化等现代生物技术手段，便可获得高纯度的干细胞内生物活性物质群或组合物即为脐带干细胞裂解液。
[0011 ] 实施例5:脐带造血干细胞分泌生物活性因子和裂解液的活性验证
将干细胞生物活性因子或裂解液按15微克/毫升浓度加入到培养基中，并以此种浓度的培养基培养正常传代至第8代的脐带或胎盘间充质干细胞(此代细胞的增殖能力减弱，活性降低)，显微镜下观察细胞的生长状态，并于第3天收集细胞，与对照组相比，添加干细胞生物活性因子或裂解液的组别，间充质干细胞增殖能力显著增强。
[0012]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.人源脐带血造血干细胞体外高效扩增方法，其特征在于:其包括以下步骤: (1)采集脐带血:无菌条件下，针吸法抽取足月顺产或剖腹产手术的新生儿脐带血放入离心管内，用肝素抗凝，冷冻保存； (2)脐带间充质干细胞的体外培养、扩增: ①分离单个核细胞:在抽取新生儿脐带血后12h内，用F1-coll- Hypaque分离液分离单个核细胞(MNC)，并用MDM培养液洗涤3次； ②将上述分离后的单个核细胞滴入Ig/L的I型胶原酶置于37°C振荡器中消化I h，消化后以I 000rr/mjn(离心半径16 cm)离心15min，吸出上层悬浮组分，100目筛网进行滤过，滤过后的液体以I 000 r/mjn(离心半径16 cm)离心5 mjn，弃上清液； ③将上述步骤②得到的消化液接种于MDM完全培养基(含20%的胎牛血清(FBS)、50μ mo I /L 2-巯基乙醇、10%胎牛血清、50 yg./mL抗坏血酸、0.5 mmol/L甘油磷酸)中，调整细胞密度为4.82 X 105/m I,然后于37 °C、饱和湿度条件下在5% 二氧化碳培养箱中培养； ④每3-5天半量换液I次，培养12天细胞生长约80%汇合，并收集更换的废培养液于-80 °C冰箱中保存； ⑤当细胞约80%汇合时，加入Ig/L胰蛋白酶对细胞进行消化15 min，以2X10 5cells/ml接种于培养皿中传代培养，并收集更换的废培养液于_80°C冰箱中保存； ⑥当细胞约80%汇合时，缓慢加入培养液，放入5%二氧化碳培养箱中37°C条件下培养，利用1.25 g/L胰蛋白酶对细胞进行消化20 min,以相差显微镜观察细胞游出的情况，待细胞密度达到80%后按1:2的比例传代，收集第I代细胞； ⑦再加入培养液，在二氧化碳培养箱中继续培养，每3-5天半量换液I次，并收集更换的废培养液于_80°C冰箱中保存； ⑧重复步骤⑤即可； ⑨分离、纯化获得高纯度间充质干细胞，利用FACSCalibur流式细胞仪分析其间充质干细胞纯度； (3)生物活性因子的制备:将步骤(2)脐带干细胞培养、扩增过程中收集的废液融化、混合、低温分离、超滤和浓缩， 超滤和浓缩的处理方法为:利用3K的超滤膜过滤，体积浓缩1/10，保留生物活性物质，再经截留分子量为50KD中空纤维超滤柱超滤，将超滤后的液体进行浓缩，即可得到含有丰富干细胞生物活性因子的组合物； (4)裂解液的制备:将体外培养获得的脐带造血干细胞浓度调整为5X106 - 1X10 7个/毫升密封于冻存管中经超低温液氮反复冻融5 -7次至细胞破碎，再通过低温分离、纯化等现代生物技术手段，便可获得高纯度的干细胞内生物活性物质群或组合物即为脐带干细胞裂解液。
【文档编号】C12N5/0775GK105861432SQ201610376245
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】张正亮, 刘大海
【申请人】安徽惠恩生物科技股份有限公司