一种紫花苜蓿原生质体的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种紫花苜蓿原生质体的制备方法，涉及生物技术领域，包括选择生长状况良好未开花的紫花苜蓿叶片作为制备原生质体的材料；将制备原生质体的材料进行预处理，得到具有多个叶条的叶片；将所述具有多个叶条的叶片进行酶解处理，得到原生质体酶解液；对所述原生质体酶解液进行纯化处理，得到紫花苜蓿原生质体。本发明制备原生质体成本低、活力高。
【专利说明】
一种紫花苜蓿原生质体的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种紫花苜蓿原生质体的制备方法。
【背景技术】
[0002] 原生质体指去掉细胞壁的裸露活细胞，是进行各种细胞及遗传操作的理想材料， 已广泛地应用于体细胞杂交、遗传转化、种质资源保存、基因瞬间表达、蛋白质互作、信号转 导等方面。因此原生质体技术可为紫花苜蓿的种质资源创新和遗传改良提供新的技术途 径，而实现上述应用的前提是制备高产量和高活力的紫花苜蓿原生质体。
[0003] 目前，紫花苜蓿原生质体的制备一般采用发芽不久的紫花苜蓿幼株的下胚轴，而 且其制备过程需要8h以上，例如王娟等发表在《草地学报》第18卷第2期的"苜蓿愈伤组织原 生质体游离与培养"中，采用了下胚轴作为材料;陶茸等发表在《中国草地学报》第22卷第1 期的"陇东野生紫花苜蓿愈伤组织原生质体游离条件的筛选"中，采用了紫花苜蓿子叶作为 原生质体材料，且其酶解时间为I Oh。
[0004] 可见，现有技术对紫花苜蓿原生质体的材料来源要求较高，且酶解时间过长。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的材料来源要求较高，酶解效率低的技术问题，本发明 提供一种紫花苜蓿原生质体的制备方法，该方法可以高效的提取紫花苜蓿中的原生质体， 对材料要求低。
[0006] 为了实现本发明的目的，本发明提供一种紫花苜蓿原生质体的制备方法，包括：
[0007] 选择生长状况良好未开花的紫花苜蓿叶片作为制备原生质体的材料；
[0008] 将制备原生质体的材料进行预处理，切割成具有多个叶条的叶片；
[0009] 将所述具有多个叶条的叶片进行酶解处理，得到原生质体酶解液；
[0010] 对所述原生质体酶解液进行纯化处理，得到紫花苜蓿原生质体。
[0011] 特别是，所述将制备原生质体的材料进行预处理包括：
[0012] 剪去紫花苜蓿叶片的边缘部分，以除去叶片上较小的细胞；
[0013] 从叶梢处沿着叶中脉平行的方向对所述剪去边缘部分的叶片进行局部剪切，得到 具有多个叶条的叶片。
[0014]尤其是，将所述具有多个叶条的叶片进行酶解处理包括：
[0015] 将所述具有多个叶条的叶片平铺在已配制好的酶解液中，真空抽滤后，使酶解液 充分进入叶片内；
[0016] 将含有叶片的酶解液在黑暗条件下震荡处理，使原生质体释放，得到原生质体粗 酶解液。
[0017] 其中，所述纯化处理包括：
[0018] 向所述原生质体粗酶解液中加入W5溶液进行悬浮，再使用尼龙膜将其进行过滤， 以除去没有降解的细胞和组织，得到滤液；
[0019] 离心处理所述滤液，去除上清液；
[0020] 重复上述步骤1-2次，得到原生质体。
[0021] 特别是，所述酶解液中包括:纤维素酶、果胶酶、离析酶和甘露醇，以及KCUMES溶 液、CaCl2 和 BSA。
[0022] 尤其是，所述酶解液中各成分的最终浓度为： 纤维素酶 1.6-2.4% 果胶酶 0.4-0.6% 离析酶 Q.24-Q.36%
[0023] KCI 20m M MES 20mM CaCh IOmM BSA 0.1%-0.15%.
[0024] 优选地，所述酶解液中各成分的最终浓度为： 纤维素酶 2% 果胶酶 0,5%
[0025] 离析酶 0.3% KCI 20mM MES 20m M CaCh IOmM
[0026] BSA 0·1%-0_!5%。
[0027]尤其是，所述酶解液使用终浓度为0.3-0.6Μ的甘露醇进行渗透压的调节。
[0028]优选地，所述酶解液使用终浓度为0.4M的甘露醇进行渗透压的调节。
[0029] 特别是，所述MES的pH为5.7。
[0030] 特别是，所述酶解液的配制包括如下步骤：
[0031] 预先配制酶解液，加入纤维素酶、果胶酶、离析酶，再加入KCl、MES溶液，最后使用 浓度为〇. 3-0.6M的甘露醇调节其渗透压，得到混合物；
[0032] 将混合物在55°C下进行水浴加热IOmin，自然冷却至室温后，加入CaCldPBSAJg 合均匀，得到酶解液，4°C保存备用。
[0033]尤其是，渗透压的调节采用终浓度为0.4M的甘露醇。
[0034] 其中，所述酶解液中各成分的最终浓度为：纤维素酶1.6-2.4 %、果胶酶0.4-0.6%、离析酶0.24-0.36%、KC1 20mM、MES 20mM、CaCh 10mM、BSA 0·1%-0· 15%。
[0035] 优选地，所述所述酶解液中各成分的最终浓度为:纤维素酶2%、果胶酶0.5%、离 析酶0.3%、1((：120111]\1、]\^3 20111]\^&(：12 101111、85厶0.1%-0.15%。
[0036] 其中，所述W5溶液为终浓度包括：154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、2mM MES。
[0037] 其中，所述MES的pH为5.7。
[0038] 特别是，所述具有多个叶条的叶片的叶条宽度为0.5-lmm。
[0039] 其中，所述真空抽滤的处理时长为20min。
[0040] 特别是，所述在黑暗条件下震荡处理温度为25°C，处理时间为4-5h，转速为40rpm。 [0041 ] 尤其是，所述离心处理的离心力为100g，处理时间为3min，
[0042] 特别是，所述离心处理过程中，加速及减速时的加速度全部为lm/S2。
[0043] 本发明的优点在于：
[0044] 1、本发明采用的是未开花前的紫花苜蓿叶片作为制备原生质体的材料来源，不再 仅限于现有技术中使用的发芽不久的紫花苜蓿幼株的下胚轴，可见，使用本发明的方法制 备的原生质体材料来源广泛，降低了原料成本。
[0045] 2、由于本发明方法对制备原生质体的材处理时先去除叶边缘部分，后进行了局部 剪切，因此酶解时不会出现叶条粘连的情况，提高了原生质体提取率。
[0046] 3、由于本发明使用了包含2%的纤维素酶、0.5%的果胶酶、0.3%的离析酶制备的 酶解液、渗透压的调节选择0.4M浓度的甘露醇、且黑暗条件下在转速为40rpm的摇床中进行 酶解等技术特征，使得紫花苜蓿的酶解时间由原来的8h缩短至4-5h，时间成本降低了一倍 左右，而且由于配制酶解液的成分少，配制简单，进一步的减低了试剂成本，并且利用本发 明制得的原生质体完整率高，质量好，如图2所示。
【附图说明】
[0047]图1是实施例1材料预处理之后的叶片形态图；
[0048] 图2是实施例2观察到的原生质体状态图。
【具体实施方式】
[0049] 下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0050] 实施例1
[00511 1、酶解液的配制
[0052]进行原生质体提取前，先行配制酶解液母液，终浓度包括2%纤维素酶、0.5%果胶 酶、0.3%离析酶及0.4M甘露醇、20mM KCl、20mM MES，其中，MES的pH为5.7，在55°C条件下水 浴加热IOmin，然后冷却至室温，加入终浓度为IOmM CaCl2和0.1 %-0.15%BSA，4°C下保存 备用。
[0053] 2、材料的准备
[0054]选择生长状况良好、未开花的紫花苜蓿，剪取其叶片作为制备紫花苜蓿原生质体 的材料。
[0055] 3、材料的预处理
[0056]将紫花苜蓿叶片的边缘部分剪去，以除去形态较小、生长状态不佳的细胞，然后从 叶梢处沿着叶中脉平行的方向进行不完全切割，使切割后得到的叶条为一个整体，切割宽 度为0.5-1_，切割后的形态如图1所示。
[0057] 经多次试验论证发现，采用除去叶边缘及局部切割的方式对叶片进行预处理，解 决现有技术中采用对叶片全部切割或对叶片切碎处理后进行酶解处理时发生的粘连现象， 较大幅度的提高了原生质体的提取率。
[0058] 4、材料的酶解处理
[0059] 4.1、按照I Oml酶解液处理10-15片苜蓿叶片的比例，根据叶片数量将切割后的叶 片平铺在相应体积的酶解液中，并利用真空抽滤处理20min，使酶解液进入细胞中，加速叶 片酶解，使细胞发生质壁分离，得到初原生质体酶解液。
[0060] 4.2、将初原生质体酶解液放入摇床中，设置其温度为25°C，在转速为40rpm的条件 下，处理4-5h，为了避免光照刺激原生质体，本处理过程在黑暗条件下进行，原生质体在转 速为40rpm的摇床中进一步释放，得到原生质体酶解液。
[0061] 经多次试验论证发现，采用终浓度包括2%纤维素酶、0.5%果胶酶、0.3%离析酶； 0.4M浓度的甘露醇进行渗透压调节的酶解液处理具有多个叶条的叶片，才使得紫花苜蓿原 生质体在一个较佳的稳态环境中发生质壁分离，不但提高了原生质体的提取效率，而且保 证了原生质体的完整度，因而本发明方法提取的紫花苜蓿原生质体活力高。
[0062]经多次试验论证，采用最终浓度范围为纤维素酶1.6-2.4%、果胶酶0.4-0.6%、离 析酶0.24-0.36%、KC1 20mM、MES 20mM、CaCl2 10mM、BSA 0·1%-0· 15% 内任意比例配制的 酶解液同样可以达到相同的效果，
[0063] 例如，酶解液最终成分配比为纤维素酶1.6%、果胶酶0.6%、离析酶0.36%、KC1 20mM、MES 20mM、CaCl2 10mM、BSA 0.1%-0.15%;又例如，酶解液最终成分配比为纤维素酶 2.4%、果胶酶0.4%、离析酶0.24%、KC1 20mM、MES 20mM、CaCl2 10mM、BSA 0·1%-0·15%; 又例如，酶解液最终成分配比为纤维素酶1.6%、果胶酶0.4%、离析酶0.36%、KCl 20mM、 MES 20mM、CaCl2 10mM、BSA 0.1%-0.15%;又例如，酶解液最终成分配比为纤维素酶 2.4%、果胶酶0.6%、离析酶0.24%、KC1 20mM、MES 20mM、CaCl2 10mM、BSA 0·1%-0·15% 等。
[0064] 5、原生质体的纯化
[0065] 向原生质体酶解液中加入与原生质体酶解液等体积的W5溶液进行混合后，再使用 尼龙膜将其过滤至干净的培养皿中，除去没有降解的细胞和组织，得到滤液;使用移液器将 滤液转移到圆底离心管中，设置离心力为l〇〇g，对装有原生质体酶解液的离心管进行离心， 时间为2min，需要特别说明是，离心处理的过程中，离心加速时和离心减速时的加速度均为 WS20
[0066] 重复上述步骤1~2次，得到纯化后的原生质体。
[0067] 需要说明的是，每次离心后，都是用W5溶液悬浮，再进行下一次离心处理。
[0068] 需要说明的是，W5溶液为终浓度包括：154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、2mM MES，其中，MES 的 pH 为 5.7。
[0069] 实施例2原生质体产活力的测定
[0070] 向得到的原生质体中加入W5溶液对原生质体进行重悬，使原生质体的浓度为1~2 X IO5，冰浴30min(也可以在冰上放置24h)，显微镜观察原生质体状态，观察图如图2所示。
[0071] 从图2中可以看出，原生质体呈完整球形状态，破碎率较少，可见，使用本发明方法 不但可以在短时间内获得紫花苜蓿原生质体，而且其活力较高。
[0072]尽管上述对本发明做了详细说明，但不限于此，本技术领域的技术人员可以根据 本发明的原理进行修改，因此，凡按照本发明的原理进行的各种修改都应当理解为落入本 发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种紫花苜蓿原生质体的制备方法，其特征在于，包括： 选择生长状况良好未开花的紫花苜蓿叶片作为制备原生质体的材料； 将制备原生质体的材料进行预处理，得到具有多个叶条的叶片； 将所述具有多个叶条的叶片进行酶解处理，得到原生质体酶解液； 对所述原生质体酶解液进行纯化处理，得到紫花苜蓿原生质体。2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将制备原生质体的材料进行预处理 包括： 剪去紫花苜蓿叶片的边缘部分，以除去叶片上较小的细胞； 从叶梢处沿着叶中脉平行的方向对所述剪去边缘部分的叶片进行局部剪切，得到具有 多个叶条的叶片。3. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将具有多个叶条的叶片进行酶解处 理包括： 将所述具有多个叶条的叶片平铺在已配制好的酶解液中，真空抽滤后，使酶解液充分 进入叶片中； 将含有叶片的酶解液在黑暗条件下震荡处理，使原生质体释放，得到原生质体酶解液。4. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纯化处理包括： 向所述原生质体酶解液中加入W5溶液进行悬浮，再使用尼龙膜将其进行过滤，以除去 没有降解的细胞和组织，得到滤液； 离心处理所述滤液，去除上清液； 重复上述步骤1-2次，得到原生质体。5. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述酶解液的MES溶液pH为5.7。6. 如权利要求3-4所述的制备方法，其特征在于，所述酶解液的配制包括如下步骤： 预先配制酶解液，包括纤维素酶、果胶酶、离析酶，并加入KC1、MES溶液，使用0.3-0.6M 浓度的甘露醇调节其渗透压； 将其水浴加热，自然冷却至室温后，加入CaCl2和BSA，混合均匀，得到酶解液，4°C保存备 用。7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述酶解液中各成分的最终浓度为： 纤维素酶 1.6-2,4% 果胶酶 0.4-0.6% 离析酶 0.24-0.36% KCi 20m Μ MES 20mM CaCb 2〇mM BSA 0·1%-0_15%。8. 如权利要求1-3所述的制备方法，其特征在于，所述具有多个叶条的叶片的叶条宽度 为0·5_lmm〇9. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述在黑暗条件下震荡处理温度为25 °C，处理时间为4_5h，转速为40rpm。10.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述离心处理的过程中，加速时和减速 时的加速度全部为lm/S2。
【文档编号】C12N5/04GK105861414SQ201610424213
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】王赞, 龚攀, 贾聪俊, 王学敏, 高洪文
【申请人】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所