一种提高酪酸菌发酵生长效率的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高酪酸菌发酵生长效率的方法，属于食品发酵领域。本发明是一种通过降低发酵过程酸性产物的生成来提高酪酸菌发酵生长效率的方法，具体为在酪酸菌开始发酵1 h内无菌、无氧流加苯丙氨酸溶液，苯丙氨酸总浓度为0.0125?0.05 g/L。本发明将苯丙氨酸作为代谢调控分子使用，苯丙氨酸分子的添加使乙酸、丁酸的生成效率显著降低，有效缓解了酸胁迫、提高了酪酸菌的发酵生长效率，产生了极好的技术效果。本发明具有成分明确、材料易购、使用浓度低、补料成本低、操作可控性高、适用于酪酸菌发酵生产的特点。
【专利说明】
一种提高酪酸菌发酵生长效率的方法
技术领域
[0001]本发明属于食品发酵领域，具体涉及一种提高酪酸菌发酵生长效率的方法。
【背景技术】
[0002]酪酸菌(丁酸梭菌，Clostridium butyrium)作为人用或动物新型益生菌具有调整肠道菌群平衡、增强免疫，预防肿瘤发生等重要功能。酪酸菌的营养需求对其生长影响显著，常用的补料氮源是蛋白胨、酵母膏、豆柏、豆粉水解液、鱼粉等，如:对比文献1(采用分批补料发酵法制备酪酸菌活菌制剂的方法，发明专利CN201110287802.1，2011)公开了酪酸菌发酵过程补入10-20%的葡萄糖(碳源)和5-10%的豆粉水解液(氮源)的方法;对比文献2( —种连续发酵法生产酪酸菌制剂的方法，发明专利CN201210135950.6，2012)公开了一种连续发酵生产酪酸菌的方法，其中补入的氮源是6-8%的豆粉水解液等。显然，对比文献I和2均没有涉及酪酸菌在发酵过程中的酸代谢调控的内容。出于酪酸菌对氮源营养需求的考虑以及有机氮源成分对酪酸菌生长代谢影响的复杂性、不确定性和未知性，对比文献I和2采用了，有机氮源(豆粉水解液)来笼统的满足酪酸菌的氮源需求。但是，这些物质成分复杂、用量较大，使得生产成本较高，而且有机氮源的何种成分最优未知。
[0003]酪酸菌发酵生长过程中合成大量的丁酸和乙酸是其代谢自适应进化的结果。但是，乙酸、丁酸的积累也会引起酸胁迫效应，并引起细胞自溶。因此，若能调控细胞酸代谢则可能使细胞活性得以维持，并进一步促进细胞生长。选择合适的代谢调控分子可能会实现上述目的。
[0004]苯丙氨酸是具有生理活性的芳香族氨基酸，是人体和动物不能靠自身自然合成的必需氨基酸之一。在医药行业用于氨基酸类抗癌药物的中间体、生产肾上腺素和甲状腺素的原料，也是有效的抗癌药物的分子载体;在食品行业添加于焙烤食品中以作强化苯丙氨酸的营养作用、改善食品香味，并补充人体所需功能性食品氨基酸平衡。食品级苯丙氨酸在2016年5月 13 日价格为62元/kg(http: //www.2lfood.cn/quote/801146.html)。另夕卜，苯丙氨酸是生产新型保健型甜味剂阿斯巴甜的主要原料。
[0005]但是，没有把苯丙氨酸分子作为代谢因子应用于厌氧微生物一酪酸菌培养过程的新功能的报道，即:苯丙氨酸作为代谢分子调控酪酸菌生长代谢并提高其发酵生长效率的新功能的报道。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于提供一种提高酪酸菌发酵生长效率的新方法，其是一种通过调控酪酸菌酸代谢来提高酪酸菌发酵生长效率的方法。
[0007]本发明目的通过下述技术方案实现。
[0008]—种提高酪酸菌发酵生长效率的方法为在酪酸菌发酵时添加苯丙氨酸。优选为:在酪酸菌发酵I h之内无菌、无氧流加苯丙氨酸溶液，苯丙氨酸总浓度为0.0125-0.05 g/L,即每升发酵液中流加苯丙氨酸的质量为0.0125-0.05 g。更优选的，苯丙氨酸总浓度为0.025 g/Lo
[0009]优选的，所述的提高酪酸菌发酵生长效率的方法，包括如下步骤:
(I)种子扩大培养与合瓶种子细胞的收集
按无菌、无氧操作要求，从酪酸菌菌种冻干管接出细胞至新制备的厌氧管斜面培养基。36-38°C培养12-16 h后，按无菌、无氧操作要求，加入10 mL无菌、无氧水制备厌氧管种子液。
[0010]120 mL厌氧瓶装培养基60 mL，按1-2%的比例(v/v)将酪酸菌(Clostr idiumbutyrium)厌氧管种子液接入厌氧瓶液体培养基中，36_38°C、100 r/min在摇床上培养12-14 h得到厌氧瓶种子液。按无菌、无氧操作要求，将厌氧瓶种子液进行合瓶操作，得到合瓶种子液。
[0011](2)发酵培养
装有培养基的发酵罐(100 L)灭菌、氮气置换除氧后，将合瓶种子液以1-2%的接种量(v/V)火焰保护接入发酵罐，按如下条件进行发酵培养:发酵温度36-38°C，转速100 r/min,氮气流量控制为0.1 vvm，罐压控制为0.03-0.04 MPa，厌氧保护I h后，停止通氮气。发酵培养12-14 h后，放罐。发酵开始I h之内无菌、无氧匀速流加补入苯丙氨酸酸溶液，使苯丙氨酸总浓度为0.0125-0.05 g/L;优选的，苯丙氨酸总浓度为0.025 g/L。
[0012]所述的培养基的制备优选为:葡萄糖20g/L，蛋白胨25 g/L，酵母粉5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，七水硫酸镁0.5 g/L，轻质碳酸|丐1 g/L，一水硫酸猛0.02 g/L，pH7.3;厌氧管斜面培养基需另外加入琼脂，琼脂浓度20 g/L;pH 7.3。除氧后经0.1 MPa蒸气灭菌20 min备用。
[0013]本发明不将苯丙氨酸作为医药行业的中间体、分子载体来使用；也不把苯丙氨酸作为食品行业的强化营养剂和食品香味改善剂来使用;也不将苯丙氨酸作为生产保健型甜味剂阿斯巴甜的主要原料原料来使用，而是作为酪酸菌生长代谢的调控分子来使用。
[0014]与现有技术相比本发明具有如下优点和显著的进步:相比于对比文献I(补加δ-?Ο。/。 的豆粉水解液 ，总氮源达到了50-100 g/L)、对比文献2(补加6-8%的豆粉水解液，总氮源达到了60-80 g/L)补料所使用的复杂成分的豆粉水解液和很高的浓度，本发明具有成分明确、原料易购、使用浓度很低(优选浓度只有0.025 g/L)，几乎不额外增加生产成本(以批培养50 m3发酵计料，仅使用1.25 kg，每批发酵仅增加成本77.5元，约为补加豆粉水解液成本的1.5-2%)、操作可控性高、适用于发酵生产的特点。
[0015]苯丙氨酸分子的添加促进了酪酸菌的发酵生长，而且，还产生了出人意料的效果:苯丙氨酸分子的添加使生成的乙酸、丁酸显著降低，放罐时分别降低了 16.2-41.2%和1.5-8%，有效缓解了酸胁迫、提高了酪酸菌的生长效率。放罐时酪酸菌活细胞数提高了 59.5-75.5%，产生了极好的技术效果。这是与现有技术最明显的不同。
【具体实施方式】
[0016]下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0017]实施例1
(I)培养基的制备
葡萄糖20 g/L，蛋白胨25 g/L，酵母粉5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，七水硫酸镁0.5 g/L，轻质碳酸钙I 8/1，一水硫酸锰0.02 g/L，pH7.3;厌氧管斜面培养基需另外加入琼脂，琼脂浓度20 g/L；pH 7.3。除氧后经0.1 MPa蒸气灭菌20 min备用。
[0018](2)种子扩大培养与合瓶种子细胞的收集
按无菌、无氧操作要求，从酪酸菌菌种冻干管接出细胞至新制备的厌氧管斜面培养基。37°C培养12 h后，按无菌、无氧操作要求，加入10 mL无菌、无氧水制备厌氧管种子液。
[0019]I 20 mL厌氧瓶装培养基60 mL，按1%的比例(v/v)将酪酸菌(Clostridiumbutyrium)厌氧管种子液接入厌氧瓶液体培养基中，37°C、100 r/min在摇床上培养12 h得到厌氧瓶种子液。按无菌、无氧操作要求，将厌氧瓶种子液进行合瓶操作，得到合瓶种子液。
[0020](3)发酵培养
装有培养基的发酵罐(100 L)灭菌、氮气置换除氧后，将合瓶种子液以1%的接种量(V/V)火焰保护接入发酵罐，按如下条件进行发酵培养:发酵温度37°C，转速100 r/min，氮气流量控制为0.1 vvm，罐压控制为0.03-0.04 MPa，厌氧保护I h后，停止通氮气。发酵培养14 h后，放触。
[0021]按上述方式厌氧发酵14h，细胞数(以Hungate滚管计数法进行菌落CFU计数)为2.17X108 CFU/mL，发酵液中的乙酸浓度为753 mg/L、丁酸浓度为2.13 g/L。
[0022]实施例2
(I)培养基的制备:同实施例1。
[0023](2)种子液扩大培养与合瓶种子细胞的收集:同实施例1。
[0024](3)发酵培养:除补加调控因子外，发酵培养其余条件同实施例1。
[0025]调控因子补加:发酵开始Ih内无菌、无氧匀速流加苯丙氨酸溶液(浓度为2.5 g/L)，使苯丙氨酸总浓度为0.0125 g/L ο
[0026]按上述方式厌氧发酵14h，细胞数(以Hungate滚管计数法进行菌落CFU计数)为3.71 X 18 CFU/mL，比实施例1提高了 71%;发酵液中乙酸浓度为631 mg/L，比实施例1降低了 16.2%;发酵液中丁酸为2.1 g/L，比实施例1降低了 1.5%。
[0027]实施例3
(I)培养基的制备:同实施例1。
[0028](2)种子液扩大培养与合瓶种子细胞的收集:同实施例1。
[0029](3)发酵培养:除补加调控因子外，发酵培养其余条件同实施例1。
[0030]调控因子补加:发酵开始Ih内无菌、无氧匀速流加苯丙氨酸溶液(浓度为2.5 g/L)，使苯丙氨酸总浓度为0.025 g/L ο
[0031]按上述方式厌氧发酵14h，细胞数(以Hungate滚管计数法进行菌落CFU计数)为3.99 X 18 CFU/mL，比实施例1提高了 75.5%;发酵液中乙酸浓度为443 mg/L，比实施例1降低了41.2%;发酵液中丁酸为1.96 g/L，比实施例1降低了8%。
[0032]实施例4
(I)培养基的制备:同实施例1。
[0033](2)种子液扩大培养与合瓶种子细胞的收集:同实施例1。
[0034](3)发酵培养:除补加调控因子外，发酵培养其余条件同实施例1。
[0035]调控因子补加:发酵开始Ih内无菌、无氧匀速流加苯丙氨酸溶液(浓度为2.5 g/L)，使苯丙氨酸总浓度为0.05 g/L ο
[0036]按上述方式厌氧发酵14h，细胞数(以Hungate滚管计数法进行菌落CFU计数)为3.46 X 18 CFU/mL，比实施例1提高了 59.5%;发酵液中乙酸浓度为575 mg/L，比实施例1降低了23.6%；发酵液中丁酸为1.97 g/L，比实施例1降低了7.6%。
[0037]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种提高酪酸菌发酵生长效率的方法，其特征在于:所述的方法为:在酪酸菌发酵时添加苯丙氨酸。2.根据权利要求1所述的提高酪酸菌发酵生长效率的方法，其特征在于:在酪酸菌发酵开始Ih内无菌、无氧流加苯丙氨酸溶液，苯丙氨酸总浓度为0.0125-0.05g/Lo3.根据权利要求2所述的提高酪酸菌发酵生长效率的方法，其特征在于:苯丙氨酸总浓度为0.025g/L。4.根据权利要求1所述的提高酪酸菌发酵生长效率的方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)种子扩大培养与合瓶种子细胞的收集 按无菌、无氧操作要求，从酪酸菌菌种冻干管接出细胞至厌氧管斜面培养基;36-38°C培养12-16h后，按无菌、无氧操作要求，加入1mL无菌、无氧水制备厌氧管种子液； 120mL厌氧瓶装培养基60mL，按1-2%的比例将酪酸菌厌氧管种子液接入厌氧瓶液体培养基中，36-38°C、100r/min在摇床上培养12-14h得到厌氧瓶种子液;按无菌、无氧操作要求，将厌氧瓶种子液进行合瓶操作，得到合瓶种子液； (2)发酵培养 装有培养基的发酵罐灭菌、氮气置换除氧后，将合瓶种子液以1-2%的接种量火焰保护接入发酵罐，按如下条件进行发酵培养:发酵温度36-38°C，转速lOOr/min，氮气流量控制为0.lvvm，罐压控制为0.03-0.04MPa，厌氧保护Ih后，停止通氮气；发酵培养12-14h后，放罐；发酵开始Ih之内无菌、无氧匀速流加补入苯丙氨酸酸溶液，使苯丙氨酸总浓度为0.0125-0.05g/Lo5.根据权利要求4所述的提高酪酸菌发酵生长效率的方法，其特征在于:培养基的制备为葡萄糖20g/L，蛋白胨30g/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，轻质碳酸钙1〖凡，一水硫酸锰0.028/1，？!17.3;厌氧管斜面培养基需另外加入琼脂，琼脂浓度208/L；pH 7.3;除氧后经0.1MPa蒸气灭菌20min备用。6.根据权利要求1所述的提高酪酸菌发酵生长效率的方法，其特征在于:所述的发酵罐为10L发酵罐。7.根据权利要求1所述的提高酪酸菌发酵生长效率的方法，其特征在于:流加补入的苯丙氨酸总浓度为0.025g/L。
【文档编号】C12N1/20GK105861411SQ201610357855
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】王志, 陈雄, 李冬生
【申请人】湖北工业大学