N‐乙酰神经氨酸的制备方法及装置的制造方法

文档序号:10505706阅读:821来源:国知局
N‐乙酰神经氨酸的制备方法及装置的制造方法
【专利摘要】本发明涉及一种N‐乙酰神经氨酸的制备方法及装置,其解决了现有全细胞催化法合成N‐乙酰神经氨酸时需严格控制无菌、操作复杂、耗能大、及时监控等缺点的技术问题,其采用超滤法收集菌体作为生物催化剂,然后在完全开放的环境中采用膜分离及简易搅拌装置即可得到N-乙酰神经氨酸产物,本发明可用于N‐乙酰神经氨酸的制备。
【专利说明】
N -乙酰神经氨酸的制备方法及装置
技术领域
[0001] 本发明涉及一种化学衍生物的制备方法及装置,具体说是一种N -乙酰神经氨酸 的制备方法及装置。
【背景技术】
[0002] 唾液酸(Sialic acid,SA)是一类 N -乙酰神经氨酸(N - acetyl - D - neuraminic acid,Neu5Ac)的0 -乙酰基衍生物,广泛存在于微生物及哺乳动物体内,Neu5Ac及其衍生 物在生理学、病理学及免疫识别过程中发挥着重要作用。因此,以唾液酸为主体结构的一系 列药物已经被用于癌症、炎症、流感的治疗。
[0003] 目前,制备N -乙酰神经氨酸的方法主要有天然原料提取、化学合成、酶促合成、生 物转化及微生物发酵等,但是这些方法都存在一定的局限性。唾液酸在天然原料中含量较 低,分离提纯过程相对复杂,导致其回收率低,成本高,产物立体选择性较差,难以进行大规 模工业化生产;化学合成法不仅需要高温、高压等严苛的反应条件、复杂的生产工艺,还涉 及到复杂的基团保护和去保护问题,并且反应过程中生成较多的中间产物及异构体,使产 物后处理极其繁琐,也不能满足工业化生产的要求;微生物发酵法还仅限于小规模试验,且 产物浓度低、生长周期长、伴有副产物。
[0004] 就目前情况而言,生产N -乙酰神经氨酸的发酵过程主要是在通气搅拌式反应器 中进行的,这就要求发酵需要控制严格的无菌条件、合适的发酵控制参数、适当的补料工艺 等一系列的生产工艺过程。近几年,原位分离技术(ISPR)在有机酸发酵过程中的应用引起 了世界范围内的广泛关注。
[0005] 授权公告号为CN 1108375C的中国发明专利中公开了一种重组菌体在膜生物 反应器的连续生产方法,这种方法可在膜生物反应器系统中实行高密度培养大肠杆菌宿 主,连续生产重组噬菌体,进而生产外来稀有的具有高生物活性的蛋白质,但该装置无法多 批次连续生产制备蛋白质产品。
[0006] 《食品与发酵工业》第28卷第7期中公开了一篇文章《聚偏氟乙烯中空纤维微孔 膜在发酵液精制与菌体浓缩中的应用》,其设计了内压膜装置双向流工艺流程,将发酵液流 向周期进行倒向,即发酵液流向按通常的下进上出方式运行一定时间后,通过阀门切换,将 发酵液流向反转为上进下出方式,运行一定时间后再次换向,依此循环进行,中空纤维膜组 件始终同时处于高效的工作与清洗状态,从而保持膜的高分离功效,但该工艺仅适用于发 酵液过滤与精制,不能进行产物的合成。
[0007] 公开号为CN 101182457A的中国发明专利申请中提供了一种纤维床反应器与膜 分离技术联用高密度生产有机酸的装置(FBMS),该装置主要由固定化纤维床反应器、并联 膜组件及膜组件清洗三个单元所构成。该专利申请通过两个膜组件实现了对产物的原位分 离,但该方法仍需要与固定化纤维床反应器联用才能实现有机酸的发酵。
[0008] 公开号为CN 101508949A的中国发明专利申请中提供了一种膜生物反应器连续 发酵黄酒工艺,其装置实现了黄酒生产的反应、分离一体化,但该装置仅实现了同批实验的 连续生产,不能连续多批次生产黄酒。
[0009] 授权公告号为CN 1172003C的中国发明专利中提供了一种在好氧条件下培养基 因工程菌制造 Neu5Ac的方法,该方法实质上还是对基因工程菌进行发酵制备Neu5Ac,因 此仍然需要严格的无菌条件及复杂的发酵工艺;授权公告号为CN 101603023B的发明专利 提供了一种发酵温控共表达外源基因重组大肠杆菌制备Neu5Ac的方法,虽然该方法采用 温度诱导法替代了添加有毒性的IPTG诱导物,但该方法还是仍需要严格控制发酵过程的 无菌条件、温度、诱导时间等条件;授权公告号为CN 1239695C的发明专利中提供了一种利 用施式假单胞藻SDM完整细胞与表达有N -乙酰神经氨酸醛缩酶的重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/pET15b -nanA为催化剂,以乳酸钠和化学异构得到的N -乙酰甘露糖胺为底物, 合成Neu5Ac的生产工艺,但是该方法需要用碱法异构化及两种细胞的参与,操作工艺十分 复杂。
[0010] 综上所述,采用全细胞催化法制备N -乙酰神经氨酸是工业化合成N -乙酰神经氨 酸的发展方向,但是目前全细胞催化法合成N -乙酰神经氨酸的工艺及设备还是采用传统 的发酵法及传统的通气搅拌反应器。发酵法还存在一定的缺陷:(1)在整个生产过程中要 求严格的无菌条件,维持纯种培养,避免杂菌的入侵;(2)生产过程受罐温、搅拌转速、搅拌 功率、空气流量、罐压、液位、补料、加糖、 PH、溶氧、培养基等条件及参数的影响;(3)发酵过 程参数监测要及时,并规范化控制生物过程,要求严格,操作复杂。目前,广泛应用的膜生物 反应器尚不能适用于全细胞催化技术中,其不足之处在于:(1)需要与其他生物反应器相 耦联,才能实现产物的制备或分离、精制;(2)发酵菌体仅能实现一次产物合成,不能连续 生产。

【发明内容】

[0011] 本发明的就了为了解决现有全细胞催化法合成N-乙酰神经氨酸时需严格控制 无菌、操作复杂、耗能大、及时监控等缺点的技术问题,提供一种无需严格控制无菌、操作简 单、耗能小、无需及时监控的N -乙酰神经氨酸的制备方法及装置。
[0012] 本发明提供一种N -乙酰神经氨酸的制备装置,其设有转化液配料罐、反应罐、膜 分离装置和产物收集罐,转化液配料罐和反应罐中分别设有第一搅拌器和第二搅拌器;膜 分离装置设有进液口、第一出口和第二出口;进液口连接有耐压管,耐压管分为两个支路分 别伸入进转化液配料罐和反应罐中;第一出口和第二出口也分别通过耐压管与反应罐和产 物收集罐相通;在靠近进液口上游的耐压管通路上设有电动栗;在电动栗的上游、转化液 配料罐和反应罐分别通向膜分离装置的耐压管支路上分别设有第一截止阀和第二截止阀; 在第一出口下游的耐压管上设有节流阀;反应罐的外部设有夹套。
[0013] 优选地,膜分离装置还设有第三出口,第三出口为排泄口。
[0014] 优选地,膜分离装置采用中空纤维膜,其孔径大小为0. 05~0. 1mm,截留分子量范 围为 6000Da ~60000Da。
[0015] 本发明还提供一种使用上述N -乙酰神经氨酸的制备装置制备N -乙酰神经氨酸 方法,其包含以下步骤:
[0016] (1)配置转化液
[0017] 在完全开放的环境中,将转化底物称量后放入转化液配料罐中,添加水至指定量, 开启第一搅拌器,使转化液混合均匀后停止;
[0018] ⑵收集菌体
[0019] 将菌液放入反应罐中,启动电动栗,并打开第二截止阀及节流阀,采用超滤法经膜 分离装置浓缩菌体并使其回流至反应罐中,剩余小分子溶液进入产物收集罐中并弃掉;然 后关闭第二截止阀和节流阀并打开第一截止阀,利用转化液冲洗中空纤维膜将菌体完全收 集到反应罐中;
[0020] (3)转化反应
[0021] 停止电动栗并关闭截止阀,控制夹套的温度并打开第二搅拌器,开始进行转化反 应;反应一段时间后,启动电动栗并打开第二截止阀及节流阀,收集产物溶液至产物收集罐 中,菌体浓缩后回到反应罐中;
[0022] (4)循环转化
[0023] 关闭第二截止阀和节流阀的同时打开第一截止阀,继续进行下一个循环的转化反 应。
[0024] 优选地,步骤(3)中控制夹套的温度为33~37°C,转化反应时间为8~12h。
[0025] 与传统的发酵法及改进的全细胞催化法相比,本发明具有如下优点:
[0026] (1)整个生产过程中不要求无菌操作,转化底物不要求进行高温灭菌,避免了对转 化培养基成分的破坏;
[0027] (2)整个生产过程中只需要通过夹套控制罐温,无需控制转化过程中的搅拌转速、 搅拌功率、空气流量、罐压、液位等参数,能耗较低;
[0028] (3)通过调节节流阀及截止阀即可实现整个生产过程的连续性,操作过程简单易 行;
[0029] (4)可实现菌体的循环利用,可进行连续、多次(7~8次)的生物转化反应,成本 低,效率高;
[0030] (5)通过调节节流阀即可达到菌液分离的目的,而无需其他繁琐步骤,菌体的分离 与收集极其简便。
【附图说明】
[0031] 图1是本发明N -乙酰神经氨酸的制备装置的结构示意图。
[0032] 图中符号说明
[0033] 1.转化液配料罐;2.反应罐;3.夹套;4.产物收集罐;5.第一搅拌器;6.第二搅 拌器;7.第一截止阀;8.第二截止阀;9.电动栗;10.节流阀;11.膜分离装置;12.进液口; 13.第一出口;14.第二出口;15.第三出口。
【具体实施方式】
[0034] 如图1所示,本发明N -乙酰神经氨酸的制备装置设有转化液配料罐1、反应罐2、 膜分离装置11和产物收集罐4,转化液配料罐1和反应罐2中分别设有第一搅拌器5和第 二搅拌器6。
[0035] 膜分离装置11设有进液口 12、第一出口 13、第二出口 14和第三出口 15。进液口 12连接有耐压管,耐压管的另一端分为两个支路分别伸入进转化液配料罐1和反应罐2中; 第一出口 13也连接有耐压管,耐压管的另一端伸入进反应罐2中;第二出口 14同样也连接 有耐压管,耐压管的另一端进入进产物收集罐4中;第三出口 15为排泄口。
[0036] 在靠近进液口 12上游的耐压管通路上设有电动栗9 ;在电动栗9的上游、转化液 配料罐1中的转化液和反应罐2中的反应液分别进入膜分离装置11的耐压管支路上分别 设有第一截止阀7和第二截止阀8 ;在第一出口 13下游的耐压管道上设有节流阀10 ;反应 罐2的外部设有夹套3。
[0037] 下面对本发明利用上述装置制备N -乙酰神经氨酸的方法进行详细说明。
[0038] 实施例1
[0039] (1)配置转化液
[0040] 在完全开放的环境中,将各种转化底物称量后放入转化液配料罐1中,添加水至 指定量,开启第一搅拌器5,使转化液混合均匀后停止。
[0041] (2)收集菌体
[0042] 将自诱导菌液放入反应罐2中,启动电动栗9,并打开第二截止阀8 (此时第一截止 阀7为关闭状态)及节流阀10,采用超滤法经膜分离装置11浓缩菌体并使其回流至反应罐 2中,剩余小分子溶液进入产物收集罐4中并弃掉;然后关闭第二截止阀8和节流阀10并 打开第一截止阀7,利用转化液冲洗中空纤维膜将菌体完全收集到反应罐中。
[0043] (3)转化反应
[0044] 停止电动栗9并关闭截止阀7,控制夹套3的温度为37°C并打开第二搅拌器6,开 始进行转化反应;反应8h后,启动电动栗9并打开第二截止阀8及节流阀10,收集产物溶 液至产物收集罐4中,菌体浓缩后回到反应罐2中。
[0045] (5)循环转化
[0046] 关闭第二截止阀8和节流阀10的同时打开第一截止阀7,继续进行下一个循环的 转化反应。
[0047] 经7次连续转化,唾液酸的产量如下:
[0049] 实施例2
[0050] 步骤(3)中控制夹套3的温度为33°C,转化反应时间为10h,其余步骤与条件均与 实施例1相同。
[0051 ] 经9次连续转化,唾液酸的产量如下:
[0052]
[0053] 实施例3
[0054] 步骤(3)中控制夹套3的温度为35°C,转化反应时间为12h,其余步骤与条件均与 实施例1相同。
[0055] 经9次连续转化,唾液酸的产量如下:
[0057] 上述三个实施例中膜分离装置11所采用的中空纤维膜的孔径大小为0.05~ 0. 1mm,截留分子量范围为6000Da~60000Da ;电动栗9可使用齿轮栗、离心栗、轴流栗、螺 杆栗等多种输水栗来抽吸、输送转化液。
[0058] 根据上述说明书的揭示和教导,上述实例为本发明较佳的实施方式。因此,本发 明并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明实质与原理下所作的改变、组合、修 饰,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种N -乙酰神经氨酸的制备装置,其特征是设有转化液配料罐、反应罐、膜分离装 置和产物收集罐,所述转化液配料罐和所述反应罐中分别设有第一搅拌器和第二搅拌器; 所述膜分离装置设有进液口、第一出口和第二出口;所述进液口连接有耐压管,所述耐 压管分为两个支路分别伸入进所述转化液配料罐和所述反应罐中;所述第一出口和第二出 口也分别通过耐压管与所述反应罐和所述产物收集罐相通; 在靠近所述进液口上游的耐压管通路上设有电动栗;在所述电动栗的上游、所述转化 液配料罐和所述反应罐分别通向所述膜分离装置的耐压管支路上分别设有第一截止阀和 第二截止阀;在所述第一出口下游的耐压管上设有节流阀;所述反应罐的外部设有夹套。2. 根据权利要求1所述的N -乙酰神经氨酸的制备装置,其特征在于所述膜分离装置 还设有第三出口,所述第三出口为排泄口。3. 根据权利要求2所述的N -乙酰神经氨酸的制备装置,其特征在于所述膜分离装置 采用中空纤维膜,其孔径大小为0. 05~0. 1mm,截留分子量范围为6000Da~60000Da。4. 一种用如权利要求1所述的N -乙酰神经氨酸的制备装置制备N -乙酰神经氨酸方 法,其特征在于包含以下步骤: (1) 配置转化液 在完全开放的环境中,将转化底物称量后放入转化液配料罐中,添加水至指定量,开启 第一搅拌器,使转化液混合均匀后停止; (2) 收集菌体 将菌液放入反应罐中,启动电动栗,并打开第二截止阀及节流阀,采用超滤法经膜分离 装置浓缩菌体并使其回流至反应罐中,剩余小分子溶液进入产物收集罐中并弃掉;然后关 闭第二截止阀和节流阀并打开第一截止阀,利用转化液冲洗中空纤维膜将菌体完全收集到 反应罐中; (3) 转化反应 停止电动栗并关闭截止阀,控制夹套的温度并打开第二搅拌器,开始进行转化反应;反 应一段时间后,启动电动栗并打开第二截止阀及节流阀,收集产物溶液至产物收集罐中,菌 体浓缩后回到反应罐中; (4) 循环转化 关闭第二截止阀和节流阀的同时打开第一截止阀,继续进行下一个循环的转化反应。5. 根据权利要求4所述的制备N-乙酰神经氨酸方法,其特征在于所述步骤(3)中控 制夹套的温度为33~37°C,转化反应时间为8~12h。
【文档编号】C12M1/02GK105861288SQ201510035463
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月23日
【发明人】晏礼明, 陶勇, 张丛丛, 陈笑, 温雅, 陈彩霞
【申请人】中国科学院微生物研究所
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