一种提高植物乳杆菌胞外多糖抗氧化活性的化学改性方法
【专利摘要】本发明在植物乳杆菌胞外多糖的基础上，通过磺化反应提升了其负电荷供给能力，以DPPH自由基、OH?自由基、O2?自由基清除能力评价，所得磺化产物较植物乳杆菌胞外多糖本身具有更优的抗氧化活性。而且此改性方法在各类植物乳杆菌胞外多糖中适用性较宽。在此基础上，针对部分类别的植物乳杆菌胞外多糖磺化反应后抗氧化活性提升不明显的问题，本发明进一步优选了适于该改性方法的原料胞外多糖，该多糖的磺化反应充分、产物均一、结构明确，同时具有突出的抗氧化活性。此外，以制备方法所表征的该多糖原料，其产率、纯度较高，有利于后续的改性反应。本发明方法流程较短、成本较低，操作相对简便，满足规模化生产的工艺要求，极具推广潜力。CCTCCNO:M201417020140428
【专利说明】
一种提高植物乳杆菌胞外多糖抗氧化活性的化学改性方法
技术领域
[0001] 本发明涉及糖类化学技术领域，进一步涉及多糖的化学改性技术，具体涉及一种 提高植物乳杆菌胞外多糖抗氧化活性的化学改性方法。
【背景技术】
[0002] 乳酸菌胞外多糖(Exopolysaccharide，EPS)，泛指乳酸菌代谢过程中分泌到细胞 外的糖类化合物。由于乳酸菌胞外多糖具有良好的流变性、而且能赋予发酵食品良好的口 感和风味，因此可作为食品工业的胶凝剂、稳定剂、保鲜剂和乳化剂等，目前已广泛用于乳 制品、饮料、糕点、糖果、冰激凌等食品的生产。此外，有研究表明EPS具有抗肿瘤、降低胆固 醇、延缓衰老、调节肠道菌群平衡等作用，因此EPS可能是乳酸菌益生作用的物质基础之一。
[0003] 抗氧化活性，是指物质消除人体内氧自由基的能力。有研究表明，体内氧自由基含 量过高将对细胞产生直接、缓慢的损伤，随时间推移将累及器官机能、加速机体衰老，甚至 导致病变。因此在饮食环节如果能摄入具有抗氧化活性的物质，将有助于降低体内氧自由 基含量，起到益生作用。
[0004] 现有技术中，公认具有较强抗氧化活性(0RAC值3000umol TE/g以上）的保健品主 要来自于植物提取物，包括蓝莓提取物、葡萄籽提取物、优质蜂胶、高含量茶多酚的茶叶提 取物、白藜芦醇、辅酶Q10、枸杞提取物、余甘子提取物等。由于植物产品的生产周期较长，种 植、采收等环节较为复杂，因此现有技术中此类产品成本较高。不同于植物产品，微生物的 培养一方面不受地域、空间的限制，另一方面生产效率高、产物容易收获，培养及纯化工艺 也便于标准化，因此如果能开发一种微生物来源的抗氧化活性物质，不仅为消费者提供了 一种新的选择，同时将显著降低生产成本。
[0005] 植物乳杆菌(LactobaciIlus plantarum)，属同型发酵乳酸菌，革兰氏阳性，兼性 好氧。有研究表明该菌种所产胞外多糖具有抗致病菌、调节肠道菌群平衡以及抗氧化等作 用，然而实验发现，此类胞外多糖本身的抗氧化活性普遍偏低，将其作为抗氧化活性类保健 品，效果难以保证。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种提尚植物乳杆菌胞外多糖抗氧 化活性的化学改性方法，以解决现有技术的植物乳杆菌胞外多糖抗氧化活性较低的技术问 题。
[0007] 本发明要解决的另一技术问题是当采用磺化方法改性植物乳杆菌胞外多糖时，不 同类别的植物乳杆菌胞外多糖的磺化效果不均一、部分类别的植物乳杆菌胞外多糖再磺化 后其抗氧化活性提升不明显。
[0008] 本发明要解决的再一技术问题是当采用磺化方法改性植物乳杆菌胞外多糖时，适 于磺化的多糖难以制备。
[0009] 本发明要解决的又一技术问题是当采用磺化方法改性植物乳杆菌胞外多糖时，适 于磺化的多糖纯度较低。
[0010]为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0011] -种提高植物乳杆菌胞外多糖抗氧化活性的化学改性方法，包括以下步骤：
[0012] 1)取所述植物乳杆菌胞外多糖，以无水二甲基甲酰胺溶解；
[0013] 2)15~45min后向其中加入三氧化硫吡啶复合物至终浓度为5~15mg/mL，反应2~ 4h〇
[0014] 作为优选，还包括步骤3):利用截留分子量为8~HKDa的透析袋透析步骤2)所得 产物，取透析袋内容物干燥。在此基础上进一步优选的，透析前先将步骤2)所得产物pH调至 6.5~7.5再透析；更优的，pH值是7.0。在此基础上进一步优选的，所述pH的调节是利用 4mol/L的NaOH溶液实现的。在此基础上进一步优选的，所述干燥是冷冻干燥。在此基础上进 一步优选的，所述透析的持续时间是4~6d;更优的，透析的持续时间是5d。
[0015] 作为优选，步骤2)中所述反应的温度为75~85 °C，反应结束后冷却至20~30 °C;其 中更优的反应温度是80°C，更优的冷却温度是25°C。在此基础上优选的，所述冷却过程是通 过冰水浴方式实现的。
[0016] 作为优选，步骤1)中溶解于无水二甲基甲酰胺中的植物乳杆菌胞外多糖终浓度为 3~7mg/mL〇
[0017] 作为优选，植物乳杆菌胞外多糖溶解于无水二甲基甲酰胺之后、加入三氧化硫吡 啶复合物之前，溶液处于震荡或搅拌状态。
[0018] 作为优选，步骤2)所述反应过程中，溶液处于震荡或搅拌状态。
[0019] 作为优选，所述植物乳杆菌胞外多糖是通过以下方法制备的：
[0020] a)取植物乳杆菌发酵液，固液分离取上清；
[0021] b)向步骤a)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分离取沉淀，以8~HKDa截留分子 量的透析袋透析，取透析袋内容物干燥，即为粗多糖；
[0022] c)以含有40~60mM Tris-HCl、5~15mM MgS〇4 · 7H20的溶液作为粗多糖溶解液，溶 解步骤b)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至终浓度2~3yg/mL，水解；
[0023] d)而后加入蛋白酶Pronase E至终浓度40~60yg/mL，酶解；
[0024] e)而后加入三氯乙酸至终浓度10~15% (w/v)，20~40min后固液分离取上清，透 析，取透析袋内容物即为所述植物乳杆菌胞外多糖。
[0025] 作为优选，步骤a)所述的发酵液是植物乳杆菌厌氧发酵22~26h时的发酵液;更优 的，发酵时间是24h。
[0026] 作为优选，步骤b)中乙醇的加入量是所述上清液体积的1.5~2.5倍;更优的，乙醇 加入量是所述上清液体积的2倍.
[0027]作为优选，步骤c)中粗多糖的终浓度为4~6mg/L;更优的，是5mg/L。
[0028] 作为优选，步骤c)所述水解是在35~39°C条件下持续4~8h;更优的，是在37°C条 件下持续6h。
[0029] 作为优选，步骤d)所述酶解是在35~39°C条件下持续16~20h;更优的，是在37°C 条件下持续18h。
[0030] 作为优选，步骤e)透析前，先调节上清液pH至4~5,再透析;更优的，调节pH至4.5; 最优的，所述调节是利用l〇mol/L的NaOH溶液实现的。
[0031]在以上任一技术方案基础上优选的，步骤a)所述的植物乳杆菌，是保藏编号为 CCTCC M 2014170的植物乳杆菌。此时该多糖用于人体具有确切的安全保证 [0032]在以上任一技术方案基础上优选的，所述的固液分离，是以10000~HOOOrpm的转 速离心15~25min。
[0033]在以上任一技术方案基础上优选的，透析的持续时间是60~84h;更优的，透析的 持续时间是72h。在此基础上进一步优选的，透析的过程中每天更换透析袋外的超纯水2次。
[0034] 作为优选，步骤a)所述的发酵液，是以MRS培养基发酵获得的。
[0035] 作为优选，步骤a)所述的发酵液，是在35~39°C条件下发酵获得的；更优的发酵温 度为37°C。
[0036] 作为优选，步骤b)所述的干燥是冷冻干燥。
[0037]作为优选，步骤c)所述粗多糖溶解液的pH值为7.2~7.8;更优的，其pH为7.5。
[0038]作为优选，步骤e)中三氯乙酸加入后的终浓度为12% (w/v)，加入三氯乙酸后持续 30min再进行固液分离。
[0039]在以上技术方案中，保藏编号为CCTCC M 2014170的生物材料的保藏单位是"中国 典型培养物保藏中心"，其地址为"湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内"，该生 物材料的保藏日期为20 14年4月28日，其分类命名是植物乳杆菌（Lactobaci Ilus plantarum)〇 在以上技术方案中，所述化学改性，是指通过化学反应的方式对物质的分子结构进行 修饰，使所得产物具有特定理化性能的方法。在以上技术方案中，所述三氧化硫吡啶复合物 又称为三氧化硫吡啶络合物，其分子式为C 5H5NO3S，可自市面购得。
[0040]本发明在植物乳杆菌胞外多糖的基础上，通过磺化反应提高了其负电荷供给能 力，以DPPH自由基、(MT自由基、O2洎由基清除能力评价发现，所得磺化产物较植物乳杆菌胞 外多糖本身具有更优的抗氧化活性。而且此改性方法在各类植物乳杆菌胞外多糖中适用性 较宽，效果确切。在此基础上，针对部分类别的植物乳杆菌胞外多糖磺化反应后抗氧化活性 提升不明显的问题，本发明进一步优选了适于该改性方法的原料胞外多糖，该多糖的磺化 反应充分、产物均一、结构明确，同时具有突出的抗氧化活性。此外，以制备方法所表征的该 多糖原料，其产率、纯度较高，有利于后续的改性反应。本发明方法流程较短、成本较低，操 作相对简便，满足规模化生产的工艺要求，极具推广潜力。
【附图说明】
[0041 ]图1是本发明实施例1中提取、纯化的胞外多糖的红外光谱(FT-IR)图谱。
[0042]图2是本发明实施例1中胞外多糖改性产物的红外光谱(FT-IR)图谱。
[0043]图3是本发明实施例1中，植物乳杆菌胞外多糖及其改性产物的DPPH自由基清除率 检测结果图。
[0044] 图4是本发明实施例1中，植物乳杆菌胞外多糖及其改性产物的0!Γ自由基清除率 检测结果图。
[0045] 图5是本发明实施例1中，植物乳杆菌胞外多糖及其改性产物的02_自由基清除率检 测结果图。
【具体实施方式】
[0046] 以下将对本发明的【具体实施方式】进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在 以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
[0047] 以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情 况下可允许数量有一定的变动。因此，用"大约"、"左右"等语言所修正的数值不限于该准确 数值本身。在一些实施例中，"大约"表示允许其修正的数值在正负百分之十（10%)的范围 内变化，比如，"大约100"表示的可以是90至IjllO之间的任何数值。此外，在"大约第一数值到 第二数值"的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言 可能与测量仪器的精度有关。
[0048] 除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人 员普遍理解的相同含义。
[0049] 以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂;所述实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果 取平均值;以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
[0050] 实施例1
[00511 1.1胞外多糖的提取、纯化
[0052] 植物乳杆菌在MRS培养基中37°C厌氧培养24h，12000Xg离心20min，弃沉淀，上清 用截留分子量为8-14KDa的透析袋透析3天，每天换超纯水2次。冷冻干燥后，用5〇11^1'1^8-HCUlOmM MgS〇4· 7H20(pH 7.5)对粗多糖进行溶解(终浓度为5mg/mL)，采用终浓度为2·5μ g/mL的核酸酶DNAse七7?6-1(05025^8111 &)在37°(：对核酸进行水解611。水解后的粗多糖采 用终浓度为50yg/mL的蛋白酶Pronase E(165921，Roche)在37°C对蛋白质进行酶解18h。蛋 白酶处理后，用终浓度为12%的三氯乙酸处理30min，12000 Xg离心20min获得的上清需调 节pH至4.0~5.0，继续透析3天，每天换水2次，透析袋内容物干燥后即为目标多糖。
[0053]采用红外光谱(FT-IR)分析胞外多糖:把固体样品磨成2μπι以下的粉末，悬浮于易 挥发的溶剂中，然后将此悬液滴于KBr片基上铺平，待溶剂挥发后形成均匀的粉末薄层，再 进一步分析。
[0054]该多糖的红外光谱图如图1所示，其红外吸收光谱具有典型的0-H(34177.12)、C-H (2932.40)和C = 0( 1641)等的伸缩振动吸收特征峰。
[0055] 1.2植物乳杆菌胞外多糖的结构改性
[0056] 取50mg纯化的胞外多糖，用IOmL无水DMF，室温处理30min，并不断摇匀，加 IOOmg三 氧化硫吡啶复合物在80°C持续搅动反应3h，接着冰水中冷却至25°C。用4mol/L的NaOH调节 pH至7.0，采用截留分子量为S-HKDa的透析袋透析5天，最后冷冻干燥。
[0057] 采用红外光谱(FT-IR)分析获得的胞外多糖衍生物:把固体样品磨成2μπι以下的粉 末，悬浮于易挥发的溶剂中，然后将此悬液滴于KBr片基上铺平，待溶剂挥发后形成均匀的 粉末薄层，再进一步分析。
[0058] 改性产物的红外光谱图如图2所示，其红外吸收光谱除了含有胞外多糖的伸缩振 动吸收特征峰外，还含有一个强烈的〇 = S = 0伸缩振动吸收特征峰，表明该改性产物属于上 述胞外多糖的磺化产物。此外，该图谱在1243.65CHT1处具有硫酸盐基团特殊吸收峰，该基团 能够在碳原子上提供更多的负电荷，有利于自由基转化成不活跃成分。
[0059] 1.3改性产物对DPPH( I，1-二苯基-2-三硝基苯肼)清除能力的测定
[0060] 取0 · 5mL的浓度为0、0 · 5、1 ·0、1 · 5、2 · 0和2 · 5mg/mL胞外多糖加入至15mL的离心管 中。每管加3.51^0.2腹〇1/1的0??招容液（用95%的无水乙醇进行溶解），在室温反应301^11， 测定517nm处的吸光值。DPPH清除率的计算公式如式（1)所示：
[0061] (1)
[0062] 式（1)中Ao为空白组，Ai为实验组，Aj为对照组。
[0063]图3示出了植物乳杆菌胞外多糖及其改性产物对DPPH自由基清除率的检测结果， 由图3可以发现，胞外多糖磺化产物的DPPH自由基清除能力明显高于胞外多糖本身，在浓度 为1.0、1.5和2.0mg/mL的条件下，具有显著差异。
[0064] 1.4改性产物对羟基自由基清除能力的测定
[0065] 取0 · 5mL的浓度为0、0 · 5丄0丄5、2· 0和2 · 5mg/mL胞外多糖加入至取6个15mL的离
心管，每管加入l.OmL PBS缓冲液(pH7.4,0.02mol/mL)，接着加入0.5mL 2.5mmol/mL的 1， 10-邻二氮菲、0.5mL 2.5mmol/mL的硫酸亚铁和0.5mL 20mmol/mL的双氧水，最后分别加入 0·5mL的浓度为0、0·5、1·0、1·5、2·0和2· 5mg/mL胞外多糖。37°C反应1小时，测定536nm处的 吸光值。0?Γ的清除率的计筧公式如式（2)所示：
[0066] (2)
[0067] 式(2)中Ao为空白组，Ai为实验组，Aj为对照组。
[0068] 图4示出了植物乳杆菌胞外多糖及其改性产物对(MT自由基清除率的检测结果，由 图4可以发现，当浓度小于2.Omg/mL时，改性产物对0!Γ自由基清除能力显著优于植物乳杆 菌胞外多糖本身，而且即使在〇. 5mg/mL的低浓度条件下，改性产物也表现出了确切的(MT自 由基去除能力。
[0069] 1.5改性产物对超氧阴离子清除能力的测定
[0070] 取0· ImL的浓度为0、0·5丄0丄5、2·0和2·5mg/mL胞外多糖加入至取6个15mL的离 心管，再分别加340yL Tri s-HCl缓冲液(50mmol/L，pH8.2)和50yL 25mmo 1/L邻苯三酚在室 温反应4min，随后用IOyL 8.0nmol/L的盐酸终止反应，测定320nm处的吸光值。f的清除率 的计算公式如式(3)所示：
[0071] (3)
[0072] 式⑶中Ao为空白组，Ai为实验组，Aj为对照组。
[0073] 图5示出了植物乳杆菌胞外多糖及其改性产物对Ο2+自由基清除率的检测结果，由 图5可以发现，各浓度条件下，改性产物的O 2^自由基清除率均优于植物乳杆菌胞外多糖本 身。
[0074] 实施例2
[0075] -种提高植物乳杆菌胞外多糖抗氧化活性的化学改性方法，包括以下步骤：
[0076] 1)取所述植物乳杆菌胞外多糖，以无水二甲基甲酰胺溶解；
[0077] 2)15min后向其中加入三氧化硫吡啶复合物至终浓度为5mg/mL，反应2h。
[0078]在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0079]还包括步骤3):利用截留分子量为SKDa的透析袋透析步骤2)所得产物，取透析袋 内容物干燥。透析前先将步骤2)所得产物pH调至6.5再透析。
[0080] 步骤2)中所述反应的温度为75°C，反应结束后冷却至20°C。
[0081] 步骤1)中溶解于无水二甲基甲酰胺中的植物乳杆菌胞外多糖终浓度为3mg/mL。
[0082] 所述植物乳杆菌胞外多糖是通过以下方法制备的：
[0083] a)取植物乳杆菌发酵液，固液分离取上清；
[0084] b)向步骤a)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分离取沉淀，以SKDa截留分子量的 透析袋透析，取透析袋内容物干燥，即为粗多糖；
[0085] c)以含有40mM Tris-HCl、5mM MgSO4 · 7H20的溶液作为粗多糖溶解液，溶解步骤b) 所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至终浓度2yg/mL，水解；
[0086] d)而后加入蛋白酶Pronase E至终浓度40yg/mL，酶解；
[0087] e)而后加入三氯乙酸至终浓度10%(w/v)，20min后固液分离取上清，透析，取透析 袋内容物即为所述植物乳杆菌胞外多糖。
[0088]步骤b)中乙醇的加入量是所述上清液体积的1.5倍。
[0089]步骤c)中粗多糖的终浓度为4mg/L。
[0090] 步骤e)透析前，先调节上清液pH至4，再透析。
[0091]步骤a)所述的植物乳杆菌，是保藏编号为CCTCC M 2014170的植物乳杆菌。
[0092] 实施例3
[0093] -种提高植物乳杆菌胞外多糖抗氧化活性的化学改性方法，包括以下步骤：
[0094] 1)取所述植物乳杆菌胞外多糖，以无水二甲基甲酰胺溶解；
[0095] 2) 45min后向其中加入三氧化硫吡啶复合物至终浓度为15mg/mL，反应4h。
[0096]在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0097]还包括步骤3):利用截留分子量为HKDa的透析袋透析步骤2)所得产物，取透析袋 内容物干燥。透析前先将步骤2)所得产物pH调至7.5再透析。
[0098]步骤2)中所述反应的温度为85°C，反应结束后冷却至30°C。
[0099] 步骤1)中溶解于无水二甲基甲酰胺中的植物乳杆菌胞外多糖终浓度为7mg/mL。
[0100] 所述植物乳杆菌胞外多糖是通过以下方法制备的：
[0101] a)取植物乳杆菌发酵液，固液分离取上清；
[0102] b)向步骤a)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分离取沉淀，以HKDa截留分子量 的透析袋透析，取透析袋内容物干燥，即为粗多糖；
[0103] C)以含有60mM TriS-HCl、15mM MgS〇4 · 7H20的溶液作为粗多糖溶解液，溶解步骤 b)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至终浓度3yg/mL，水解；
[0104] d)而后加入蛋白酶Pronase E至终浓度60yg/mL，酶解；
[0105] e)而后加入三氯乙酸至终浓度15%(w/v)，40min后固液分离取上清，透析，取透析 袋内容物即为所述植物乳杆菌胞外多糖。
[0106] 步骤b)中乙醇的加入量是所述上清液体积的2.5倍。
[0107] 步骤C)中粗多糖的终浓度为6mg/L。
[0108] 步骤e)透析前，先调节上清液pH至5，再透析。
[0109]步骤a)所述的植物乳杆菌，是保藏编号为CCTCC M 2014170的植物乳杆菌。
[0110] 实施例4
[0111] -种提高植物乳杆菌胞外多糖抗氧化活性的化学改性方法，包括以下步骤：
[0112] 1)取所述植物乳杆菌胞外多糖，以无水二甲基甲酰胺溶解；
[0?13 ] 2) 30min后向其中加入三氧化硫吡啶复合物至终浓度为I Omg/mL，反应3h。
[0114] 在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0115] 还包括步骤3):利用截留分子量为IlKDa的透析袋透析步骤2)所得产物，取透析袋 内容物干燥。
[0116] 步骤2)中所述反应的温度为80°C，反应结束后冷却至25°C。
[0117] 所述植物乳杆菌胞外多糖是通过以下方法制备的：
[0118] a)取植物乳杆菌发酵液，固液分离取上清；
[0119] b)向步骤a)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分离取沉淀，以12KDa截留分子量 的透析袋透析，取透析袋内容物干燥，即为粗多糖；
[0120] c)以含有50mM Tris-HCl、IOmM MgSO4 · 7H20的溶液作为粗多糖溶解液，溶解步骤 b)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至终浓度2.5yg/mL，水解；
[0121] d)而后加入蛋白酶Pronase E至终浓度50yg/mL，酶解；
[0122] e)而后加入三氯乙酸至终浓度12%(w/v)，30min后固液分离取上清，透析，取透析 袋内容物即为所述植物乳杆菌胞外多糖。
[0123] 步骤b)中乙醇的加入量是所述上清液体积的2倍。
[0124] 步骤e)透析前，先调节上清液pH至4.5，再透析。
[0125] 实施例5
[0126] -种提高植物乳杆菌胞外多糖抗氧化活性的化学改性方法，包括以下步骤：
[0127] 1)取所述植物乳杆菌胞外多糖，以无水二甲基甲酰胺溶解；
[0128] 2) 40min后向其中加入三氧化硫吡啶复合物至终浓度为12mg/mL，反应3.5h。
[0129] 在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0130] 还包括步骤3):利用截留分子量为8~HKDa的透析袋透析步骤2)所得产物，取透 析袋内容物干燥。透析前先将步骤2)所得产物pH调至7.2再透析。
[0131] 实施例6
[0132] -种提高植物乳杆菌胞外多糖抗氧化活性的化学改性方法，包括以下步骤：
[0133] 1)取所述植物乳杆菌胞外多糖，以无水二甲基甲酰胺溶解；
[0134] 2) 20min后向其中加入三氧化硫吡啶复合物至终浓度为8mg/mL，反应2.5h。
[0135] 以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种提高植物乳杆菌胞外多糖抗氧化活性的化学改性方法，其特征在于包括以下步 骤： 1) 取所述植物乳杆菌胞外多糖，以无水二甲基甲酰胺溶解； 2) 15~45min后向其中加入三氧化硫吡啶复合物至终浓度为5~15mg/mL，反应2~4h。2. 根据权利要求1所述的化学改性方法，其特征在于还包括步骤3):利用截留分子量为 8~14KDa的透析袋透析步骤2)所得产物，取透析袋内容物干燥。3. 根据权利要求2所述的化学改性方法，其特征在于透析前先将步骤2)所得产物pH调 至6.5~7.5再透析。4. 根据权利要求1所述的化学改性方法，其特征在于步骤2)中所述反应的温度为75~ 85°C，反应结束后冷却至20~30°C。5. 根据权利要求1所述的化学改性方法，其特征在于步骤1)中溶解于无水二甲基甲酰 胺中的植物乳杆菌胞外多糖终浓度为3~7mg/mL。6. 根据权利要求1~5任一项所述的化学改性方法，其特征在于所述植物乳杆菌胞外多 糖是通过以下方法制备的： a) 取植物乳杆菌发酵液，固液分离取上清； b) 向步骤a)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分离取沉淀，以8~14KDa截留分子量的 透析袋透析，取透析袋内容物干燥，即为粗多糖； c) 以含有40~60mM Tris-HCl、5~15mM MgS〇4 · 7H20的溶液作为粗多糖溶解液，溶解步 骤b)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至终浓度2~3yg/mL，水解； d) 而后加入蛋白酶Pronase E至终浓度40~60yg/mL，酶解； e) 而后加入三氯乙酸至终浓度10~15% (w/v)，20~40min后固液分离取上清，透析，取 透析袋内容物即为所述植物乳杆菌胞外多糖。7. 根据权利要求6所述的化学改性方法，其特征在于步骤b)中乙醇的加入量是所述上 清液体积的1.5~2.5倍。8. 根据权利要求6所述的化学改性方法，其特征在于步骤c)中粗多糖的终浓度为4~ 6mg/L〇9. 根据权利要求6所述的化学改性方法，其特征在于步骤e)透析前，先调节上清液pH至 4~5,再透析。10. 根据权利要求6所述的化学改性方法，其特征在于步骤a)所述的植物乳杆菌，是保 藏编号为CCTCC Μ 2014170的植物乳杆菌。
【文档编号】C08B37/00GK105859898SQ201610202526
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月5日
【发明人】魏华, 张志鸿, 万翠香, 许恒毅, 徐锋, 冯丽霞
【申请人】南昌大学