来源于小麦的抗逆性相关蛋白TaNAC47及其相关生物材料与应用
【专利摘要】本发明公开了来源于小麦的TaNAC47蛋白及其相关生物材料在提高植物抗逆性中的应用。TaNAC47是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。实验证明TaNAC47蛋白及其相关生物材料可以提高植物的抗逆性，在提高植物抗旱、抗盐和抗冻害性方面具有重要作用。本发明公开的TaNAC47蛋白及其生物材料在提高植物抗旱、抗盐和抗冻害性方面具有重要作用。
【专利说明】
来源于小麦的抗逆性相关蛋白TaNAC47及其相关生物材料 与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物工程领域中来源于小麦的TaNAC47蛋白及其相关生物材料与应 用。
【背景技术】
[0002] 作物在其生长发育过程中经常受到干旱、低温和高盐等非生物逆境的胁迫影响。 这些逆境胁迫因子在全球会引起作物减产大约50% (Kr印s J. A.，Wu Y.，Chang H. S.，Zhu T., Wang X. &Harper J. F. (2002). Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic, and cold stress. Plant Physiology 130, 2129 - 214)。近年来，气候异 常，水资源奇缺，可用耕地减少，盐碱地增多，这些不利因素严重威胁我国国家粮食安全。小 麦是我国主要的粮食作物，培育高产抗逆的小麦品种是保证国家粮食安全的重要措施，抗 逆相关基因的挖掘是抗逆分子育种的基石。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗逆性（如抗冻性、抗盐性和抗旱 性）。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了植物抗逆性相关蛋白。
[0005] 本发明所提供的植物抗逆性相关蛋白，名称为TaNAC47,来源于普通小麦 (Triticum aestivum)，是如下a)或b)的蛋白质：
[0006] a)氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白质；
[0007] b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几 个氨基酸残基得到的与植物抗逆性相关的蛋白质。
[0008] 上述植物抗逆性相关蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0009] 其中，序列表中序列2由291个氨基酸残基组成。
[0010] 上述b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0011] 上述b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失 一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。
[0012] 与TaNAC47相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
[0013] 本发明所提供的与TaNAC47相关的生物材料，为下述BI)至B5)中的任一种： [0014] BI)编码TaNAC47所述蛋白质的核酸分子；
[0015] B2)包含BI)所述核酸分子的表达盒；
[0016] B3)包含BI)所述核酸分子的重组载体、或包含B2)所述表达盒的重组载体；
[0017] B4)包含BI)所述核酸分子的重组微生物、或包含B2)所述表达盒的重组微生物、 或包含B3)所述重组载体的重组微生物；
[0018] B5)包含BI)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或包含B2)所述表达盒的转基因 植物细胞系、或包含B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
[0019] 上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子 也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。BI)所述核酸分子具体可为如下1)或2)或3)或4) 所不的基因：
[0020] 1)其编码序列是序列表中序列1的第232-1107位核苷酸的DNA分子或CDNA分 子；
[0021] 2)核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子或cDNA分子；
[0022] 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子或cDNA分子杂交且编码权利要求1 所述蛋白质的DNA分子或cDNA分子；
[0023] 4)与1)或2)限定的DNA分子或cDNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要 求1所述蛋白质的DNA分子或cDNA分子。
[0024] 其中，序列表中序列1由1277个核苷酸组成，其编码序列是序列表中序列1的第 232-1107位核苷酸，编码序列表中序列2所示的蛋白质。
[0025] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"可以用肉 眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比 (%)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0026] 上述基因中，所述严格条件可为如下：50°C，在7%十二烷基硫酸钠（SDS)、0. 5M NaPOjP ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2 X SSC，0. 1 % SDS中漂洗；还可为：50°C，在 7% SDS、0. 5M NaPOjP ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，1XSSC，0. 1% SDS 中漂洗； 还可为：50°C，在 7% SDS、0. 5M NaPOjP ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0. 5XSSC， 0. 1% SDS中漂洗；还可为：50°C，在7% SDS、0. 5M NaPOjP ImM EDTA的混合溶液中杂交，在 50°C，0. 1XSSC，0. 1% SDS 中漂洗；还可为：50°C，在 7% SDS、0. 5M NaPOjP ImM EDTA 的混 合溶液中杂交，在65°C，0. 1XSSC，0. 1% SDS中漂洗；也可为：在6XSSC，0. 5% SDS的溶液 中，在65°C下杂交，然后用2XSSC，0. 1% SDS和1XSSC，0. 1% SDS各洗膜一次。
[0027] 上述生物材料中，B2)所述的含有编码TaNAC47的核酸分子的表达盒（TaNAC47基 因表达盒），是指能够在宿主细胞中表达TaNAC47的DNA，该DNA不但可包括启动TaNAC47 基因转录的启动子，还可包括终止TaNAC47转录的终止子。进一步,所述表达盒还可包括 增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异 的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动 子35S :来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶（"LAP"，Chao等人（1999) Plant Physiol 120:979-992);来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关I(PRl)(由水杨酸 和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯）诱导）；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子（PIN2) 或LAP启动子（均可用茉莉酮酸甲酯诱导）；热休克启动子（美国专利5,187,267);四环 素诱导型启动子（美国专利5,057, 422);种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子 pF128 (CN101063139B (中国专利200710099169. 7))，种子贮存蛋白质特异的启动子（例 如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆beta conglycin的启动子（Beachy等人（1985) EMBO J.4 :3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的 所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子 (NOS终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂 氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：〇dell等人（I9S5)Nature313:810 ;Rosenberg等 人（1987) Gene, 56:125 ;Guerineau 等人（1991) Mol. Gen. Genet, 262:141 ;Proudfoot (1991) Cell, 64:671 ;Sanfacon 等人 Genes Dev.，5:141 ;Mogen 等人（1990)Plant Cell, 2:1261 ; Munroe 等人（1990)Gene, 91:151 ;Ballad 等人（1989)Nucleic Acids Res. 17:7891 ;Joshi 等人（1987)Nucleic Acid Res. ,15:9627)。
[0028] 可用现有的植物表达载体构建含有所述TaNAC47基因表达盒的重组表达载体， 所述植物表达载体包括Gateway系统载体和双元农杆菌载体等，如pD0NR?/Zeo、pBin438、 PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA139卜Xa 或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译 区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷 酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导（Ti)质粒基因（如 胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3'端转录的非翻译区均具有类 似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转 录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编 码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来 源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结 构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、 萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基 因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，赋予对 methatrexate抗性的dhfr基因和赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因），抗化学试剂标记基因 等（如抗除莠剂基因）或提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
[0029] 所述重组微生物具体可为细菌，酵母，藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏 菌属（Escherichia),欧文氏菌（Erwinia),根癌农杆菌属（Agrobacterium)、黄杆菌属 (Flavobacterium),产喊菌属（Alcaligenes),假单胞菌属（Pseudomonas),芽胞杆菌属 (Bacillus)等。所述转基因植物细胞系为非植物繁殖材料。
[0030] 为解决上述技术问题，本发明还提供了 TaNAC47或上述与TaNAC47相关的生物材 料在调控植物抗逆性中的应用，或在制备调控植物抗逆性产品中的应用。
[0031] 上述应用中，所述调控植物抗逆性可为提高植物抗逆性。所述受体植物具体可为 被子植物；进一步，所述被子植物可为双子叶植物或单子叶植物；所述被子植物可为十字 花科植物。所述抗逆性可为抗冻性、抗盐性和抗旱性中的三种、两种或一种。
[0032] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种利用TaNAC47的编码基因培育抗逆性 转基因植物的方法。
[0033] 本发明所提供的培育抗逆性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入TaNAC47 的编码基因得到抗逆性高于所述受体植物的抗逆性转基因植物的步骤。
[0034] 上述方法中，所述受体植物具体可为被子植物；进一步，所述被子植物可为双子叶 植物或单子叶植物；所述被子植物可为十字花科植物。
[0035] 上述方法中，所述TaNAC47的编码基因可为上述1)或2)或3)或4)所示的基因； 上述方法中，其中所述TaNAC47基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的 表达效果：
[0036] 1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体种子植 物所偏爱的密码子，在保持本发明所述TaNAC47基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以 符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好 地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35%、多于45%、多于50%或多于 约 60% ;
[0037] 2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中 已知的有效的序列进行修饰；
[0038] 3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括 组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的 选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性 表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；
[0039] 4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于 CaMV的tml，来源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发 明基因进行连接；
[0040] 5)引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序 列（例如来源于TMV, MCMV和AMV)。
[0041] 上述方法中，所述TaNAC47基因通过含有TaNAC47基因表达盒的重组表达载体 (TaNAC47基因表达载体）导入所述受体植物中，所述TaNAC47基因表达盒中，启动TaNAC47 基因转录的启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子。
[0042] 所述TaNAC47基因表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微 注射，电穿孔、农杆菌介导等常规生物技术方法导入植物细胞或组织。
[0043] 上文中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化受体植物得到的第一代 转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育 种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包 括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0044] 本发明的实验证明，-KTC低温处理后，1~3代纯合转TaNAC47基因植株的存活率为 87% ±0. 8%，野生型植株的存活率为41% ;150mM NaCl处理后，1~3代纯合转TaNAC47基 因 L9株系、LlO株系和Lll株系的根长分别是野生型植株根长的1. 4倍、1. 4倍和1. 5倍； 部分野生型植株的叶子呈现白化现象，野生型植株的白化率为34% ±0.6%，1~3代纯合转 TaNAC47基因拟南芥L9株系、LlO株系和Lll株系的所有植株的叶子未出现白化现象，均保 持绿色状态；干旱处理35天后复水的野生型的幼苗全部死亡，而1~ 3代纯合转TaNAC47基因 有一定比例的存活，1代纯合转TaNAC47基因 L9株系、LlO株系和Lll株系的存活率分别 为9. 5% ±0. 4、39% ±0. 8、50% ±0. 4。说明本发明所提供的TaNAC47蛋白是一种与植物 抗逆相关的蛋白，可用于提高植物的抗冻性、抗盐性和抗旱性。
[0045] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【附图说明】
[0046] 图1为TaNAC47基因在4°C处理前（Oh)、处理后1、3、6、12、24和48h后的相对表 达量。内参是小麦Tubulin基因。
[0047] 图2为TaNAC47基因在250mM NaCl溶液处理前（Oh)、处理后1、3、6、12、24和48h 后的相对表达量。内参是小麦Tubulin基因。
[0048] 图3为TaNAC47基因在16. 1%的PEG6000溶液处理前（Oh)、处理后1、3、6、12、24 和48h后的相对表达量。内参是小麦Tubulin基因。
[0049] 图4为TaNAC47基因在200μΜΑΒΑ溶液处理前（Oh)、处理后1、3、6、12、24和48h 后的相对表达量。内参是小麦Tubulin基因。
[0050] 图5为1~3代纯合转TaNAC47基因拟南芥的抗冻性分析:A为低温处理前拟南芥幼 苗的生长状态；B为-KTC低温处理后拟南芥幼苗的生长状态。
[0051] 11':野生型拟南芥幼苗山9、1^10、1^11:三个1'3代纯合转了 &熟047基因拟南芥株系。
[0052] 图6为1~3代纯合转TaNAC47基因拟南芥的抗盐性分析：左图为在不含NaCl的MS 培养基上拟南芥幼苗的生长状态；中图为在含150mM NaCl的MS培养基上垂直培养的拟南 芥幼苗的生长状态；右图为在含200mM NaCl的MS培养基上垂直培养的拟南芥幼苗的生长 状态。
[0053] 11':野生型拟南芥幼苗山9、1^10、1^11:三个1'3代纯合转了&熟047基因拟南芥株系。
[0054] 图7为1~3代纯合转TaNAC47基因拟南芥的抗旱性分析：左图为22°C，12h光照下 培养3周的拟南芥幼苗的生长状态；中图为干旱处理35天后拟南芥幼苗的生长状态；右图 为复水5天后拟南芥幼苗的生长状态。
[0055] 11':野生型拟南芥幼苗山9、1^10、1^11:三个1'3代纯合转了&熟047基因拟南芥株系。
【具体实施方式】
[0056] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。下述实 施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无 特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取 平均值。
[0057] KOD-Plus高保真酶购自Τ0Υ0Β0,产品目录号为K0D-201。入门载体pD0NR?/Zeo 为 invitrogen 公司产品，产品目录号为 12535-035。BP Clonase?II Enzyme Mix 购自 invitrogen 公司，产品目录号为 11789-013。LR Clonase?II Enzyme Mix 购自 invitrogen 公司，产品目录号为11791-019。
[0058] 目标载体 pEarleyGate 100(Ishikawa K, Maejima K, Komatsu K, Netsu 0,Keima T,Shiraishi Τ,Okano Υ,Hashimoto Μ, Yamaji Υ,Namba S.Fig mosaic emaravirus ρ4 protein is involved in cell-to-cell movement. Journal of General Virology, 2013, 94:682 - 686)，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本 申请实验。
[0059] GV3101 : : pMP90 (Yasmin A1Debener T. Transient gene expression in rose petals via Agrobacterium infiltration.Plant Cell Tiss Organ Cult. 2010, 102:245-250)，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请 实验。
[0060] 拟南芥（Arabidopsis thaliana) (Columbia-0 亚型）（Kim H，Hyun Y，Park J，Park M，Kim M，Kim H，Lee M，Moon J，Lee I, Kim J. A genetic link between cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsis thaliana.Nature Genetics. 2004, 36:167-171)。公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申 请实验。
[0061] 小麦（Triticum aestivum) (Petersen G，Seberg 0,Yde M，Berthelsen K. Phylogenetics relationships of Triticum and Aegilops and evidence for the origin of the A, B and D genomes of common wheat(Triticum aestivum). Molecular Phylogenetics and Evolution. 2006, 39:70-82)。公众可从中国农业科学院作物科学研究 所获得，以重复本申请实验。
[0062] 中国春小麦（Chinese Spring Wheat) (Anderson 0, Huo N, Gu Y. The gene space in wheat: the complete y-gliadin gene family from the wheat cultivar Chinese spring. Functional and Integrative Genomics. 2013, 13:261-273)。公众可从中国农业 科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。
[0063] 实施例1、小麦TaNAC47蛋白及其编码基因的克隆
[0064] 本发明的发明人为了研究小麦NAC基因在植物抗逆方面的功能，通过生物信息学 的方法,从实验室已经测序的30000条非冗余的小麦全长cDNA序列中筛选出28个编码小 麦NAC蛋白的基因。通过半定量PCR的方法，对该28个小麦NAC基因在逆境条件下的表达 模式进行研究，筛选出受逆境诱导表达的TaNAC47基因。
[0065] TaNAC47基因全长cDNA为1277bp，核苷酸序列如序列表中序列1的第1-1277位核 苷酸所示，其编码序列如序列表中序列1的自5'末端第232-1107位核苷酸所示（876bp)， 编码的蛋白命名为TaNAC47,其氨基酸序列如序列表中序列2所示，由291个氨基酸残基组 成。
[0066] 实施例2、TaNAC47基因在不同逆境胁迫下的转录水平表达模式
[0067] -、TaNAC47基因在低温胁迫下的表达模式
[0068] 对两叶一心期的中国春小麦幼苗进行4°C处理，分别在处理前（Oh)、处理后1、3、 6、12、24和48h提取小麦幼苗叶子组织的RNA，反转录成cDNA，以该cDNA为模板，以上游引 物 1 :5' -CGGCGATACTGCCAAAG-3' 和下游引物 2 :5' -CGGCGACAGGAACGAG-3' 为引物，进行实 时定量PCR分析，得到TaNAC47基因的相对表达量。内参是小麦Tubulin基因。结果如图 1所示，表明TaNAC47基因响应低温胁迫诱导。
[0069] 二、TaNAC47基因在盐胁迫下的表达模式
[0070] 对两叶一心期的中国春小麦幼苗进行250mM NaCl溶液处理，分别在处理前（Oh)、 处理后1、3、6、12、24和48h提取小麦幼苗根组织的RNA，反转录成cDNA，以该cDNA为模板， 以上游引物1和下游引物2为引物，进行实时定量PCR分析，得到TaNAC47基因的相对表达 量。内参是小麦Tubulin基因。结果如图2所示，表明TaNAC47基因响应盐胁迫诱导。
[0071] 三、TaNAC47基因在干旱胁迫下的表达模式
[0072] 对两叶一心期的中国春小麦幼苗进行16. 1%的PEG6000处理，分别在处理前 (Oh)、处理后1、3、6、12、24和48h提取小麦幼苗根组织的RNA，反转录成cDNA,以该cDNA为 模板，以上游引物1和下游引物2为引物，进行实时定量PCR分析，得到TaNAC47基因的相 对表达量。内参是小麦Tubulin基因。结果如图3所示，表明TaNAC47基因响应干旱胁迫 诱导。
[0073] 四、TaNAC47基因在ABA胁迫下的表达模式
[0074] 对两叶一心期的中国春小麦幼苗进行200 μ M ABA溶液处理，分别在处理前（Oh)、 处理后1、3、6、12、24和48h提取小麦幼苗根组织的RNA，反转录成cDNA，以该cDNA为模板， 以上游引物1和下游引物2为引物，进行实时定量PCR分析，得到TaNAC47基因的相对表达 量。内参是小麦Tubulin基因。结果如图4所示，表明TaNAC47基因响应ABA诱导诱导。
[0075] 实施例3、转TaNAC47基因植株的获得和抗逆性鉴定
[0076] -、利用Gateway技术构建过表达载体，具体步骤如下：
[0077] 1、目标基因的获得：根据TaNAC47基因的开放阅读框序列设计引物如下：
[0078] 上游引物 3 :5 ' -TAATGGTGATGGCGGCGGCG-3 '
[0079] 下游引物 4 :5 ' -TCAGAAGAAGAATGGGCTGA-3 '
[0080] 然后据Gateway技术构建表达载体的需要，在上游引物3和下游引物4的5'端分 别加入attBl和attB2重组位点（下划线标注attBl和attB2重组位点），分别得到引物如 下：
[0081] 上游引物 5 :5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGTGATGGCGGCGGCG-3，
[0082] 下游引物 6 :5 ' -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAGAAGAAGAATGGGCTGA-3，
[0083] 提取中国春小麦的总RNA，并反转录为cDNA作为模板，用上游引物5和下游引物6 进行PCR扩增，得到attB PCR产物，为保证PCR过程的保真性，使用KOD-PIus高保真酶进 行PCR反应，配置PCR反应体系如下： IOXReaction Buffer 2. 5 KL dNTP mix (2mM) 2.5 μL MgSO4 (25mM) I. 0 μ|
[0084] 上游引物 5 (10 μΜ) 0,75 μ I 下游引物 6 (10 μΜ) 0. 75 μ I cDNA 2, 0 μL KOO-Plus 0·5μ! DVISO 2.5 μL
[0085] CldH2D 补足至 2:5 μL
[0086] PCR扩增程序为：先 95°C预变性 5min ;然后 95°C 30s，55°C 30s，68°C l_2min，共 35 个循环；68°C延伸5min。
[0087] 2、进行BP重组反应，得到BP反应产物。配置如下反应体系：
[0088] attB PCR 产物 100-15:0 ng 入门载体 PDONRltYZeo 3()-50 ng BP ClonaseTMII Enzyme Mix 0.3 μL 柬菌dd Η20 补足至2. :5 (4
[0089] BP 反应程序：25°C，8_l2h。
[0090] 3、入门质粒的获得
[0091] 将2. 5 μ I BP反应产物加入50 μ I T0P10感受态细胞进行转化，冰浴30min，42°C 热击90s，然后迅速置于冰上2min。加入500 μ I LB培养液，37°C，210rpm/min复苏50min， 复苏液均匀涂布于加有博莱霉素（Zeocin)(浓度为40 μ g/ml)的固体LB选择培养基表面， 37°C倒置培养过夜。pD0NR?/Ze〇载体自身带有致死基因，不能在培养基上生存。通过步 骤2的BP重组反应目标基因片段会取代致死基因，最终得到的克隆即为入门克隆（entry clone)，质粒为入门质粒，将入门质粒送测序，测序结果表明该入门质粒含有序列1的自5' 末端第232-1107位核苷酸所示的cDNA分子。
[0092] 4、进行LR重组反应，得到LR反应产物。配置如下反应体系：
[0093] 入门质粒 100-150 ng 目标载体 pE:af IeyGate ΓΟΟ 30-50. ng LR ClonaseTMII Enzyme Mix (), 3 Ml dd H20 补足至 2. 5 μL
[0094] LR 反应程序：25°C，8-12h。
[0095] 5、目标质粒的获得
[0096] 转化过程同步骤3,只是将Zeocin替换为卡那霉素（浓度为50 μ g/ml)。 PEarleyGate 100载体同样带有致死基因，通过LR重组反应致死基因将会被目标基因片段 取代，得到的克隆即为目标克隆（Destiantion clone)，质粒为目标质粒，将该目标质粒命 名为 pEarley-TaNAC47，pEarley_TaNAC47 的测序结果表明 pEarley_TaNAC47 含有序列 1 的 自5'末端第232-1107位核苷酸所示的cDNA分子。pEarley-TaNAC47为TaNAC47基因表 达载体，pEarley-TaNAC47含有TaNAC47基因表达盒，TaNAC47基因表达盒中，启动TaNAC47 基因转录的启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子。
[0097] 二、转TaNAC47基因拟南芥植株的获得
[0098] 1、将 pEarley_TaNAC47 转化根癌农杆菌 GV3101: :pMP90，得到含有 pEarley-TaNAC47 的重组农杆菌 GV3101/pEarley-TaNAC47。
[0099] 2、拟南芥侵染及转基因植株筛选及鉴定
[0100] 2. 1、拟南芥的培养与侵染：将拟南芥（Arabidopsis thaliana) (Columbia-0 亚 型）种子用灭菌水（含有体积百分含量为10%次氯酸钠以及10%吐温-20的水溶液）摇 动消毒15min，在超净工作台中用灭菌水清洗上述消毒的种子至少5次。将清洗完的种子均 匀播种在MS培养基上。MS平板于4°C春化3天，然后置于22°C光照培养箱培养一周。待 小苗长出四片真叶后移栽至营养钵中培养，保湿2-3天。拟南芥的生长对温度比较敏感， 20-22°C为比较适宜的培养温度。当拟南芥植株生长至大部分花蕾处于即将开花状态时，用 重组农杆菌GV3101/pEarley-TaNAC47进行农杆菌侵染。将侵染过的拟南芥平放于托盘中， 黑暗保湿培养24h，然后放于正常培养条件下培养。拟南芥侵染1周后根据拟南芥的生长状 态可再次侵染以提高转化效率，收集转染植株的种子，得到T。代转pEarley-TaNAC47拟南 芥种子。
[0101] 2. 2、阳性转TaNAC47基因拟南芥的初步筛选：将2. 1的T。代转pEarley-TaNAC47 拟南芥种子，于37°C烘箱中烘干(6-8天），然后4°C春化3天。将种子直接撒播在营养钵中， 22°C保湿培养1周。待小苗长出4片真叶后，通过喷洒除草剂（basta)进行阳性转TaNAC47 基因拟南芥筛选，非阳性转TaNAC47基因拟南芥在喷洒3天后开始出现萎蔫并停止生长，2 周后基本死亡。为了将非阳性转TaNAC47基因拟南芥苗彻底除净，连续喷洒2-3次，每次间 隔2-3天，得到初筛阳性T。代转pEarley-TaNAC47拟南芥植株。
[0102] 2. 3、阳性转TaNAC47基因拟南芥的鉴定：CTAB法提取2. 2的初筛阳性T。代转 pEarley-TaNAC47拟南芥植株叶片的基因组DNA，以其为模板，以基因特异性正向引物7 : 5' -TGGATCATGCACGAGTA-3' 和基因特异性反向引物 8 :5' -GCACCTCCTCCTTTGG-3' 进行 PCR 扩增，得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，能得到300bp的目的条带 的初筛阳性T。代转pEarley-TaNAC47拟南芥植株即为T。阳性转TaNAC47基因拟南芥。野 生型拟南芥进行上述鉴定实验无目的条带。
[0103] 用上述方法进行鉴定T。阳性转TaNAC47基因拟南芥的后代，直至获得T 3代纯合转 TaNAC47基因拟南芥的种子。
[0104] 三、转TaNAC47基因拟南芥的抗逆性鉴定
[0105] 1、抗冻性分析
[0106] 将拟南芥（Arabidopsis thaliana) (Columbia-0亚型）（下文简称野生型拟南芥 (WT))和三个1~3代纯合转TaNAC47基因拟南芥株系（L9、L10、L11)的种子在22°C，12h光 照下进行培养，得到3周幼苗，然后将各幼苗在-KTC处理3h进行低温处理，再置于22°C恢 复培养4天，观察植株表型并统计植株死亡率。实验重复三次，每次重复每个株系10株。
[0107] 低温处理前后的各幼苗的生长状态如图5所示，结果表明野生型植株的存活率为 41 %，1~3代纯合转TaNAC47基因拟南芥植株的存活率为87% ±0. 8%，说明与野生型拟南芥 相比，1~3代纯合转TaNAC47基因拟南芥的抗冻性明显提高。
[0108] 2、抗盐性分析
[0109] 将野生型拟南芥（WT)株系和三个1~3代纯合转TaNAC47基因拟南芥株系（L9、L10、 LI 1)的种子在22°C，12h光照下进行垂直培养，得到5天幼苗，将根长一致的各幼苗转移到 含150mM NaCl和200mM NaCl的MS培养基上垂直培养进行盐胁迫处理，以在不含NaCl的 MS培养基上垂直培养得到的根长一致的幼苗为对照，盐胁迫处理5天后观察植株表型并统 计植株根长和植株白化率（盐胁迫处理后有白化叶片的植株株数与盐胁迫处理前植株株 数之比）。实验重复三次，每次重复每个株系8株。
[0110] 各幼苗的状态如图6所示。该图表明150mM NaCl处理后，1~3代纯合转TaNAC47基 因拟南芥株系的根长比野生型植株的长，野生型拟南芥的根长明显受到抑制，1代纯合转 TaNAC47基因拟南芥L9株系、LlO株系和Lll株系的根长分别是野生型拟南芥根长的1. 4 倍、1. 4倍和1. 5倍；部分野生型拟南芥植株的叶子呈现白化现象，野生型拟南芥植株的白 化率为34% ±0. 6%，1~3代纯合转TaNAC47基因拟南芥L9株系、LlO株系和Lll株系的所 有植株的叶子未出现白化现象，均保持绿色状态。200mM NaCl处理的实验结果是，T3代纯 合转TaNAC47基因拟南芥L9株系、LlO株系和Lll株系的根长比野生型拟南芥植株的根长 长，1代纯合转TaNAC47基因拟南芥L9株系、LlO株系和Lll株系的根长分别是野生型拟 南芥植株根长的1. 26倍、1. 32倍和1. 29倍；全部野生型拟南芥植株叶子都呈现白化现象， 野生型拟南芥植株的白化率为96% ±0. 5%，而1~3代纯合转TaNAC47基因拟南芥的叶子基 本都保持绿色状态。
[0111] 3、抗旱性分析
[0112] 将野生型拟南芥（WT)和三个1~3代纯合转TaNAC47基因拟南芥株系（L9、L10、L11) 的种子在22°C，12h光照下进行培养，得到3周幼苗，将该3周幼苗进行干旱处理而后复水。 具体为3周幼苗干旱处理前浇足营养液，之后一直不浇任何液体（包括营养液和水），35天 后，再浇营养液，5天后观察植株表型并统计植株存活率。实验重复三次，每次重复每个株 系10株。干旱处理前后以及复水后的各幼苗的状态如图7所示。图7表明，复水后野生型 拟南芥的幼苗在干旱处理后全部死亡，而1代纯合转TaNAC47基因拟南芥有一定比例的存 活，1代纯合转TaNAC47基因拟南芥L9株系、LlO株系和Lll株系的存活率分别为9. 5% ±0. 4%、39% ±0. 8%、50% ±0. 4%。进一步表明1~3代纯合转TaNAC47基因拟南芥的抗 旱性明显提高。
【主权项】
1. 蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质： a) 氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白质； b) 将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的与植物抗逆性相关的蛋白质。2. 与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种： B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子； B2)包含B1)所述核酸分子的表达盒； B3)包含B1)所述核酸分子的重组载体、或包含B2)所述表达盒的重组载体； B4)包含B1)所述核酸分子的重组微生物、或包含B2)所述表达盒的重组微生物、或包 含B3)所述重组载体的重组微生物； B5)包含B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或包含B2)所述表达盒的转基因植物 细胞系、或包含B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。3. 根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下1)或 2)或3)或4)所示的基因： 1) 其编码序列是序列表中序列1的第232-1107位核苷酸的DNA分子或cDNA分子； 2) 核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子或cDNA分子； 3) 在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子或cDNA分子杂交且编码权利要求1所述 蛋白质的DNA分子或cDNA分子； 4) 与1)或2)限定的DNA分子或cDNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1 所述蛋白质的DNA分子或cDNA分子。 4. C或D的应用： C、 权利要求1所述蛋白质在调控植物抗逆性中的应用或在制备调控植物抗逆性产品 中的应用； D、 权利要求2或3所述相关生物材料在调控植物抗逆性中的应用或在制备调控植物抗 逆性产品中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为抗冻性、抗盐性和抗旱性中 的三种、两种或一种。6. 根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述植物为十字花科植物。7. 培育抗逆性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入权利要求1所述蛋白质的编 码基因得到抗逆性高于所述受体植物的抗逆性转基因植物的步骤。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述受体植物为十字花科植物。9. 根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：权利要求1所述蛋白质的编码基因 为如下1)或2)或3)或4)所示的基因： 1) 其编码序列是序列表中序列1的第232-1107位核苷酸的DNA分子或cDNA分子； 2) 核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子或cDNA分子； 3) 在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子或cDNA分子杂交且编码权利要求1所述 蛋白质的DNA分子或cDNA分子； 4) 与1)或2)限定的DNA分子或cDNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1 所述蛋白质的DNA分子或cDNA分子。10.根据权利要求7或8或9所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为抗冻性、抗盐性 和抗旱性中的三种、两种或一种。
【文档编号】A01H5/00GK105859858SQ201510031847
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月22日
【发明人】孔秀英, 张丽娜, 夏川, 张立超, 赵光耀, 贾继增
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所