一种从发酵液中提取β-胸苷的方法
【专利摘要】本发明公开一种从发酵液中提取β?胸苷的方法，该方法包括以下步骤：（1）发酵液的预热；（2）发酵液的微滤；（3）微滤液的超滤；（4）超滤液的电渗析；（5）渗析液的浓缩；（6）浓缩液的层析；（7）层析液浓缩与结晶。本发明将膜分离技术、电渗析技术、层析分离技术运用于β?胸苷发酵液的提取过程中，除杂效果好，工艺过程简便、环保，自动化程度高。通过本发明的提取工艺，β?胸苷产品液相纯度≥98.5%，外标含量≥98.5，总收率≥70%，实现了从发酵液中提取β?胸苷的工业化应用，具有良好的经济效益与产业化推广前景。
【专利说明】
_种从发酵液中提取β_胸苷的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种从发酵液中提取β-胸苷的方法，属于生物化工技术领域。
【背景技术】
[0002] β_胸苷即2 脱氧胸腺啼啶核苷是合成抗艾滋病药物司他夫定、叠氮胸苷及齐多 夫定的重要前体物质。由于全球艾滋病病人数量逐年增加，对合成抗艾滋病药的原料胸苷 的需求也逐年增加。
[0003] 目前，生产β-胸苷的方法主要有两类。一类是采用化学合成法生产胸苷，由于化学 合成工艺复杂，合成过程需要使用大量的有机溶剂，生产过程存在较大的安全及环保隐患； 一类是采用生物发酵法生产，但相关胸苷提取工艺的研究报道尚少，因此，有必要探索一种 简便、安全、环保、高效的提取工艺，为工业化低成本发酵生产胸苷产品提供帮助。
[0004] 本发明将膜分离技术、电渗析技术、层析分离技术运用于β_胸苷发酵液的提取过 程中。该提取工艺操作简便，产品质量稳定，收率较高。通过本发明提取工艺制备的胸苷产 品，β-胸苷产品液相纯度2 98.5，外标含量2 98.5%，总收率2 70%，实现了从发酵液中提取 β-胸苷的工业化应用，具有良好的经济效益与产业化推广前景。
[0005]
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种从发酵液中提取β-胸苷的方法，该方法包括： (1) 发酵液的预热:β_胸苷发酵液发酵结束后，在发酵罐内经蒸汽加热至60~85°C; (2) 发酵液的微滤:β-胸苷发酵液通过膜孔径为50nm~1000 nm的滤膜，除去发酵液中大 部分的菌体及较大的蛋白及杂质颗粒，操作压力0.1~〇.4MPa，操作温度10~50°C，浓缩倍 数6~12倍，顶洗水量以体积百分比计占进料体积的50~80%; (3) 微滤液的超滤:微滤液通过截留分子量为500~5000的滤膜，除去微滤液中的大部 分蛋白及色素物质，操作压力0.5~2. OMPa，操作温度20~40 °C，浓缩倍数10~20倍，顶洗水 量以体积百分比计占进料体积的10~50%。
[0007] (4)超滤液的电渗析:超滤液通过电渗析器，将超滤液中阴、阳离子型杂质分离。操 作电压22V。
[0008] (5)渗析液的浓缩:用真空浓缩方式对电渗析除离子后的物料进行浓缩，使胸苷的 含量在20g/L~60g/L。浓缩温度控制在40~55°C，真空度达到0 · 08MPa~0 · IMPa。
[0009] (6)浓缩液的层析:将浓缩液采用离子交换树脂或大孔径吸附树脂进行层析，将胸 苷与其它物质进行进一步分离，获得高纯度层析液。
[0010] (7)层析液的浓缩结晶：将上述6个步骤处理后的层析液，经过浓缩、结晶，获得含 量达到98.5%以上的β-胸苷产品。 以上实施方法的（2)、（3)、（4)步骤为发酵液的预处理，目的在于除去发酵液中的菌体、 蛋白、及大部分色素、阴阳离子等。 所述步骤(2)中的滤膜为氧化铝膜、陶瓷膜、PVC膜。
[0011] 所述步骤(3)中的滤膜为卷式超滤膜，可以是醋酸纤维素膜、聚醚砜膜、聚偏氟乙 烯膜、聚酰胺膜。
[0012] 所述步骤(4)中的电渗析三个储槽内溶液分别为:极液槽内为Na2S〇4溶液;浓液槽 内为自来水;清液槽内为超滤液。
[0013] 所述步骤(6)中的大孔吸附树脂为:HZ-803、HZ-337、SD301、XD828。
[0014] 以上实施方法的（6)步骤为发酵液的高纯处理，目的在于进一步除去发酵液中的 蛋白、多肽、核酸、色素、及微量的阴阳离子等。
[0015] 本发明是一种行之有效的发酵液中提取β_胸苷的方法。采用先进的膜分离技术、 电渗析技术、层析技术运用于胸苷发酵液的提取过程中，质量有保障，操作简便，自动化 程度高，有利于提高胸苷的提取收率。通过本发明工艺，胸苷产品液相纯度2 98.5%，外 标含量2 98.5%，总收率2 70%，有利于实现从发酵液中高效提取β-胸苷的工业化生产。
[0016]
【具体实施方式】
[0017] 以下实施实例用于说明本发明，但不构成对本发明的任何限制。
[0018] 实施例1 将100U3-胸苷发酵液用蒸汽加热至65°C;通过膜孔径为1000 nm的微滤膜，入膜压力 0.2MPa，出膜压力0.1 MPa，操作温度25°C，将发酵液浓缩8倍后，加入顶洗水量60L。滤清液通 过膜截留分子量3000的超滤膜，操作压力1.4MPa，操作温度30~35°C，将微滤液浓缩12倍 后，加入透析水量30L。超滤液以600L/h的流速通过电渗析设备分离阴阳离子，当滤液电导 glOOus/cm时，收集滤液进行真空浓缩。将滤液浓缩至β-胸苷含量达到30g/L后，进入层析 柱分离、收集层析液，真空浓缩结晶，共获得胸苷产品694.65g。经高压液相色谱检测β-胸 苷产品的液相纯度为98.82%，外标含量达到98.6%。
[0019] 实施例2 将β-胸苷发酵液IOOL在发酵罐内经蒸汽加热至65°C;通过膜孔径为500nm的微滤膜，入 膜压力0 · 2MPa，出膜压力0 · IMPa，操作温度25°C，将发酵液浓缩9倍后，加入顶洗水量70L。滤 清液通过膜截留分子量1000的超滤膜，操作压力1.4MPa，操作温度30~35°C，将离交液浓缩 15倍后，加入透析水量40L。超滤液以500L/h的流速通过电渗析设备分离阴阳离子，当滤液 电导< lOOus/cm时，收集滤液进行真空浓缩将滤液浓缩至β-胸苷含量达到35g/L后，进入层 析分离、收集层析液，真空浓缩结晶，共获得胸苷产品751.77g。经高压液相色谱检测β-胸 苷产品的液相纯度为99.52%，外标含量达到99.2%。
[0020] 实施例3 将β-胸苷发酵液IOOL在发酵罐内经蒸汽加热至65°C;通过膜孔径为200nm的微滤膜，入 膜压力0 · 2MPa，出膜压力0 · IMPa，操作温度25°C，将发酵液浓缩6倍后，加入顶洗水量60L。滤 清液通过膜截留分子量2000的超滤膜，操作压力1.4MPa，操作温度30~35°C，将离交液浓缩 10倍后，加入透析水量35L。超滤液以500L/h的流速通过电渗析设备分离阴阳离子，当滤液 电导< 100us/cm时，收集滤液进行真空浓缩将滤液浓缩至β-胸苷含量达到40g/L后，进入层 析分离、收集层析液，真空浓缩结晶，共获得胸苷产品710.02g。经高压液相色谱检测β-胸 苷产品的液相纯度为99.05%，外标含量达到98.9%。
【主权项】
1. 一种从发酵液中提取β-胸苷的方法，其特征是该方法包括以下步骤： (1) 发酵液的预热:β-胸苷发酵液发酵结束后，在发酵罐内经蒸汽加热至60~85 °C; (2) 发酵液的微滤:β-胸苷发酵液通过膜孔径为50nm~lOOOnm的滤膜，除去发酵液中的 菌体及较大的蛋白及杂质颗粒，操作压力0.1~〇.4MPa，操作温度10~50 °C，浓缩倍数6~12 倍，顶洗水量以体积百分比计占进料体积的50~80%; (3) 微滤液的超滤:微滤液通过截留分子量为500~20000的滤膜，除去微滤液中的大部 分蛋白及色素物质，操作压力0.5~2. OMPa，操作温度20~40 °C，浓缩倍数10~20倍，顶洗水 量以体积百分比计占进料体积的10~50%; (4) 超滤液的电渗析:超滤液通过电渗析器，将超滤液中阴、阳离子型杂质分离;操作电 压 22V; (5) 渗析液的浓缩:用真空浓缩方式对电渗析除离子后的物料进行浓缩，使胸苷的含量 在20g/L~60g/L;浓缩温度控制在40~55°C，真空度达到0 · 08MPa~0 · IMPa; (6) 浓缩液的层析:将浓缩液采用离子交换树脂或大孔径吸附树脂进行层析，将胸苷与 其它物质进行进一步分离，获得高纯度层析液； (7) 层析液的浓缩结晶：将上述6个步骤处理后的层析液，经过浓缩、结晶，获得含量达 到98.5%以上的β-胸苷产品； 所述步骤(2 )中的滤膜为氧化铝膜、陶瓷膜、PVC膜； 所述步骤(3)中的滤膜为卷式超滤膜，可以是醋酸纤维素膜、聚醚砜膜、聚偏氟乙烯膜、 聚酰胺膜； 所述步骤(4 )中的电渗析三个储槽内溶液分别为:极液槽内为Na2S〇4溶液;浓液槽内为 自来水;清液槽内为超滤液； 所述步骤(6)中的大孔吸附树脂为:HZ-803、HZ-337、SD301、XD828。
【文档编号】C07H19/073GK105859809SQ201610215758
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月9日
【发明人】赵大显, 郑雄敏, 汪洪, 袁建赣
【申请人】南昌大学