一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒及其制备方法，包括的成分及相应含量为：试剂R1：缓冲液20~180 mmol/L、吐温?20 0.1~1.0 g/L，其溶剂为纯化水，试剂R2：缓冲液20~180 mmol/L、L?亮氨酰?P?硝基苯胺0.1~15.0 mmol/L、复合酶稳定剂0.1~1.0mL/L，其溶剂为纯化水，制备方法和使用方法包括以下步骤：按照组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的亮氨酰氨基肽酶的浓度。本发明具有稳定性好、测定准确度高等优点。
【专利说明】
-种测定亮氨醜氨基化酶的试剂盒及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定亮氨酷氨基肤酶的试 剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 亮氨酷氨基肤酶(LAP)是一种蛋白分解酶，能水解肤链N端并由亮氨酸与其它氨基 酸形成肤键的酶，其广泛分布于肝、膜、肾等组织中，其中肝内含量最高，当肝内外胆渺时， 亮氨酷氨基肤酶活力显著增高，尤其在恶性胆渺时，其活力随病情进展而持续增高，除了肝 脏病变外，亮氨酷氨基肤酶在胆囊、膜腺等组织病变时，亦可出现血清亮氨酷氨基肤酶的升 高，亮氨酷氨基肤酶不像其它肝功的酶，只能检测血液样本，亮氨酷氨基肤酶还可W检测尿 液，在一些病例中，可W检测尿液中亮氨酷氨基肤酶的变化，而不必采血。
[0003] 亮氨酷氨基肤酶亦可W反应早期的肾功能的损害和程度，并为临床鉴别肾小球、 肾小管损伤提供可能的帮助。
[0004] 目前，市场上的对亮氨酷氨基肤酶的检测试剂盒不仅操作复杂，而且测定的准确 度、精密度均比较差，需要进行改进。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的技术操作复杂、准确度和精密度均 比较差的缺陷，而提供一种测定亮氨酷氨基肤酶的试剂盒及其制备方法。
[0006] 本发明解决上述技术问题提供的技术方案是:本发明公开了一种测定亮氨酷氨基 肤酶的试剂盒，包括彼此独立的试剂Rl和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂Rl: 缓冲液 20~180 mmol/L 吐溫-20 0.1 ~1.0 g/L 其溶剂为纯化水。
[0007] 试剂 R2: 缓冲液 20~180 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 0. ^15.0 mmol/L 复合酶稳定剂 0.1~1.0血/L 其溶剂为纯化水。
[000引作为优选，本发明公开了一种测定亮氨酷氨基肤酶的试剂盒，包括彼此独立的试 剂Rl和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂Rl: 缓冲液 100 mmol/L 吐溫-20 0.5 g/L 其溶剂为纯化水。
[0009] 试剂 R2: 缓冲液 100 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 7.5 mmol/L 复合酶稳定剂 0.5mL/L 其溶剂为纯化水。
[0010] 作为优选，所述的试剂Rl中，所述的缓冲液采用憐酸盐缓冲液、=径甲基氨基甲烧 缓冲液、1,4-赃嗦二乙横酸缓冲液、4-径乙基赃嗦丙横酸缓冲液、4-径乙基赃嗦乙横酸缓冲 液、=径甲基甲胺基丙横酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、棚酸缓冲液、3-吗嘟丙横酸缓冲液、3-(N-吗嘟基)-2-径丙基横酸缓冲液、2-吗嘟乙横酸缓冲液、憐酸二氨钢缓冲液中的一种或多 种的组合，所述的试剂R2中，所述的缓冲液采用憐酸盐缓冲液、=径甲基氨基甲烧缓冲液、 1,4-赃嗦二乙横酸缓冲液、4-径乙基赃嗦丙横酸缓冲液、4-径乙基赃嗦乙横酸缓冲液、S径 甲基甲胺基丙横酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、棚酸缓冲液、3-吗嘟丙横酸缓冲液、3-(N-吗嘟 基)-2-径丙基横酸缓冲液、2-吗嘟乙横酸缓冲液、憐酸二氨钢缓冲液中的一种或多种的组 厶 1=1 O
[0011] 作为优选，所述的试剂R2中，所述的复合酶稳定剂采用聚乙二醇、甘油、海藻糖、山 梨醇、牛血清白蛋白中的一种或多种的组合。
[0012] 作为优选，本发明还公开了上述测定亮氨酷氨基肤酶的试剂盒的制备方法和使用 方法，包括W下步骤： (a)按照下列组分含量配制好试剂： 试剂Rl: 缓冲液 20~180 mmol/L 吐溫-20 0.1 ~1.0 g/L 其溶剂为纯化水。
[OOU]试剂 R2: 缓冲液 20~180 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 0. ^15.0 mmol/L 复合酶稳定剂 0.1~1.0血/L 其溶剂为纯化水。
[0014] (b)将待测样本与试剂Rl和试剂R2混合，使其充分反应； (C)用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值； (d)根据吸光度变化值计算出样本中的亮氨酷氨基肤酶的浓度。
[0015] 本发明的检测原理是:样品中的亮氨酷氨基肤酶催化水解底物k亮氨酷-P-硝基 苯胺，生成亮氨酸和对硝基苯胺，用405nm波长检测吸光度的变化率，求出样品中亮氨酷氨 基肤酶的活性。 「mi Al T干斗、下 OXH白 I主 VU/Ly- LS 八 V U/Ly
式中：A Au/min 待测样品平均每分钟的吸光度变化值 A Ae/min 校准液平均每分钟的吸光度变化值 Cs 校准液中亮氨酷氨基肤酶的浓度 与现有技术相比，本发明具有W下有益优点:本发明所述的测定亮氨酷氨基肤酶的试 剂盒通过添加复合酶稳定剂，复合酶稳定剂可W有效的提高k亮氨酷-P-硝基苯胺的稳定 性，运样在测试的过程中，整个反应也就更趋于稳定，因此本发明所述的测定亮氨酷氨基肤 酶的试剂盒的稳定性好、测定准确度高，另外本发明制备方法简单、成本低，另外操作也比 较方便。
【具体实施方式】
[0017] W下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于运些实施例。
[001引实施例1 本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂Rl和试剂R2双液体组分，其中 试剂Rl: S径甲基氨基甲烧缓冲液 100 mmol/L 吐溫-20 0.5 g/L 其溶剂为纯化水。
[0019] 试剂R2: 2-吗嘟乙横酸缓冲液 100 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 7.5 mmol/L 海藻糖 0.5mL/L 其溶剂为纯化水。
[0020] 实施例2 本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂Rl和试剂R2双液体组分，其中 试剂Rl: 甘氨酸缓冲液 20mmol/L 吐溫-20 1.0 g/L 其溶剂为纯化水。
[00別]试剂R2: 4-径乙基赃嗦乙横酸缓冲液 180 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 15.0 mmol/L 甘油 0.1血/L 其溶剂为纯化水。
[0022]实施例3 试剂盒的制备和使用方法 1、按照下列组分含量配制好试剂： 试剂Rl: S径甲基氨基甲烧缓冲液100 mmol/L 吐溫-20 0.5 g/L 其溶剂为纯化水。
[002；3]试剂 R2: 2-吗嘟乙横酸缓冲液 100 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 7.5 mmol/L 海藻糖 0.5mL/L 其溶剂为纯化水。
[0024] 2、全自动生化分析仪参数设置 (a) 检测溫度:37°C; (b) 检测波长:主波长405皿、副波长505皿； (C)反应时间：8min，其中，解育时间5min，加入试剂R2后立即测定读取吸光度Al, 3min后读取吸光度A2,计算吸光度变化AA = A2-A1 ; (d)反应方向：正反应。
[00巧]3、检测步骤 (a) 取2(K)山试剂Rl与12.5山待测样本混匀； (b) 将混匀后的溶液在37°C的条件下解育5min; (C)加入50iil试剂R2,立即测定读取吸光度Al，3min后读取吸光度A2,计算吸光度变化 AA = A2-A1； 'J、访旧
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[00%] 实施例4 试剂盒的制备和使用方法 1、按照下列组分含量配制好试剂： 试剂Rl: 甘氨酸缓冲液 20mmol/L 吐溫-20 1.0 g/L 其溶剂为纯化水。
[0027]试剂 R2: 4-径乙基赃嗦乙横酸缓冲液 180 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 15.0 mmol/L 甘油 0.1血/L 其溶剂为纯化水。
[0028] 2、全自动生化分析仪参数设置 (a) 检测溫度:37°C; (b) 检测波长:主波长405皿、副波长505皿； (C)反应时间：8min，其中，解育时间5min，加入试剂R2后立即测定读取吸光度Al, 3min后读取吸光度A2,计算吸光度变化AA = A2-A1 ; (d)反应方向：正反应。
[0029] 3、检测步骤 (a) 取2(K)山试剂Rl与12.5山待测样本混匀； (b) 将混匀后的溶液在37°C的条件下解育5min; (C)加入50iil试剂R2,立即测定读取吸光度Al，3min后读取吸光度A2,计算吸光度变化 AA = A2-A1； (d)巧据
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[0030] 表1为实施例1所制得的测定亮氨酷氨基肤酶的试剂盒W及实施例2所制得的测定 亮氨酷氨基肤酶的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的亮氨酷氨基肤 酶的浓度为14U/L，测定结果见表1: 泰1
由表1可知，本发明所制得的测定亮氨酷氨基肤酶的试剂盒对质控品1的测定结果偏差 较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
[0031] 表2为实施例1所制得的测定亮氨酷氨基肤酶的试剂盒W及实施例2所制得的测定亮氨 酷氨基肤酶的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的亮氨酷氨基肤酶的 浓度为21U/L，测定结果见表2: 表2
出巧ZKi畑，夺乂明所明巧的观U疋巧安L脚:安L萃趴贈的W化I品:刈胸巧而ZtfJ观U疋巧宋1炯左 较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
[0032] 表3为实施例3所制得的测定亮氨酷氨基肤酶的试剂盒对同一待测样本进行的多 次反复测定W及实施例4所制得的测定亮氨酷氨基肤酶的试剂盒对同一待测样本进行的多 次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下： 表3
由表3可知本发明所制得的测定亮氨酷氨基肤酶的试剂盒的精密度比较好，而且由表1 可知，实施例3为最优的选择。
[0033]上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人±皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所掲示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒，其特征在于:包括彼此独立的试剂R1和试剂R2 双液体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂R1: 缓冲液 20~180 mmol/L 吐温-20 0.1-1.0 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 20~180 mmol/L L_亮氨酰-P-硝基苯胺 0.1~15.0 mmol/L 复合酶稳定剂 0.1~1. OmL/L 其溶剂为纯化水。2. 根据权利要求1所述的一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒，其特征在于:包括彼此独 立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂R1: 缓冲液 100 mmol/L 吐温-20 0.5 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 100 mmol/L L_亮氨酰-P-硝基苯胺 7.5 mmol/L 复合酶稳定剂 0.5mL/L 其溶剂为纯化水。3. 根据权利要求1或2所述的一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒，其特征在于:所述的 试剂R1中，所述的缓冲液采用磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、1，4_哌嗪二乙磺酸 缓冲液、4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸 缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟丙基磺酸缓 冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、磷酸二氢钠缓冲液中的一种或多种的组合，所述的试剂R2中， 所述的缓冲液采用磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、1，4_哌嗪二乙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液、甘 氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟丙基磺酸缓冲液、2-吗 啉乙磺酸缓冲液、磷酸二氢钠缓冲液中的一种或多种的组合。4. 根据权利要求1或2所述的一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒，其特征在于:所述的 试剂R2中，所述的复合酶稳定剂采用聚乙二醇、甘油、海藻糖、山梨醇、牛血清白蛋白中的一 种或多种的组合。5. 根据权利要求1或2所述的一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒的制备方法和使用方 法，其特征在于:包括以下步骤： (a)按照下列组分含量配制好试剂： 试剂R1: 缓冲液 20~180 mmol/L 吐温-20 0.1-1.0 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 20~180 mmol/L L_亮氨酰-P-硝基苯胺 0.1~15.0 mmol/L 复合酶稳定剂 0.1~1. OmL/L 其溶剂为纯化水 (b) 将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应； (c) 用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值； (d )根据吸光度变化值计算出样本中的亮氨酰氨基肽酶的浓度。
【文档编号】C12Q1/37GK105838775SQ201610279879
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】蔡晓辉, 庄庆华, 吴铮, 徐运
【申请人】安徽伊普诺康生物技术股份有限公司