一种固定化卤醇脱卤酶及其应用

一种固定化卤醇脱卤酶及其应用
【专利摘要】本发明公开一种固定化重组卤醇脱卤酶及其应用；本发明构建的固定化重组卤醇脱卤酶对卤醇底物转化效率高，底物耐受性强，对底物及其结构类似物具有良好的催化选择性；本发明通过多点共价成功将重组卤醇脱卤酶固定在环氧树脂载体表面；通过低盐吸附和添加甘油作为酶活性中心的保护剂，有效减少了固定化过程中的酶活损失；该固定化方法操作简单，原料成本低，适合大规模操作；固定化酶具有性状均一、酶稳定性高、重复使用性能好等优点；采用该固定化重组卤醇脱卤酶可以用于合成环氧氯丙烷、(R)?4?氰基?3?羟基丁酸乙酯、(S)?2,3?二氯?1?丙醇等，在固定化酶活力没有出现明显下降前可以连续使用50批以上，具有很好的工业应用前景。
【专利说明】-种固定化面醇脱面酶及其应用 -、技术领域
[0001] 本发明设及一种固定化面醇脱面酶制备的方法，设及一种制备高操作稳定的固定 化重组面醇脱面酶的方法，W及利用固定化重组面醇脱面酶催化制备手性环氧氯丙烷及其 他环氧化合物的方法。 二、【背景技术】
[0002] 面醇脱面酶，也叫面醇-面化氨裂解酶，通过分子内亲和取代机制催化芳香族或者 脂肪邻面醇转化为环氧化物和面化氨，是微生物降解有机面化合物的关键酶之一。面醇脱 面酶通过蛋白结构中保守的丝氨酸和底物径基氧原子之间形成氨键，稳定和底物结合，通 过精氨酸降低络氨酸的地a值，络氨酸从底物上的氧原子作为亲核试剂，进攻邻位面素取代 的碳原子，进而释放面原子，形成环氧化物。面醇脱面酶不但可W催化碳-面键的断裂进行 脱面反应，合成环氧化合物，还可W高选择性地催化接受除面离子W外的一系列非自然亲 核试剂，如化^N(V、Cr等介导的环氧化物开环反应，合成一系列光学纯的叠氮化醇、氯取代 醇、硝基醇异硫氯酸取代醇等手性e-取代醇。作为一种具有多种催化功能的酶，面醇脱面酶 被广泛应用在农药化学试剂、医药和高分子化学等重要的工业领域，是最具应用价值的工 业用酶之一。由于游离面醇脱面酶不能重复利用、稳定性差、容易变性而失活，运些使得生 产过程中面醇脱面酶的成本居高不下，另外游离面醇脱面酶还存在后续与产物分离不易， 不利于连续化生产等缺陷，运些因素共同制约了面醇脱面酶在工业上的大量使用。
[0003] 酶的固定化是指通过物理、化学方法，利用载体将酶限制或束缚在一定的区域内， 使其仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比，固定化 酶在保持其高效专一及溫和的酶催化反应特征的同时，又克服了游离酶的不足，呈现胆存 稳定性高，分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控和工艺简便等一系列优点，成为 近年来酶工程领域最为活跃的研究重点之一。传统的酶的固定化方法包括吸附法、包埋法、 交联法和共价结合法，几种方法各有优缺点。在工业化应用中，为了降低固定化酶的成本， 要求制备的固定化酶具有良好的操作稳定性，可W反复多次使用，因此选用共价结合法制 备成结合牢固的固定化酶比其他方法而言具有很大优势。环氧类树脂是一种表面含有环氧 基的合成树脂，该类载体表面的环氧基与酶分子表面的氨基、径基等基团可W在很溫和的 条件下开环共价结合，从而将酶分子固定在载体表面。环氧基和氨基的反应条件溫和，结合 后酶分子一般不会被破坏，经过适当处理后可W得到稳定性良好的固定化酶。一些合成树 脂载体在较长的周期内具有很强的耐微生物和酸碱腐蚀作用及较强的机械性能，通过控制 合成工艺容易合成具有粒度可调的微球状多孔材料，非常符合作为工业化酶制剂的载体。
[0004] 目前，面醇脱面酶固定化研究报道较少，Pavel Dvorak等报道(Pavel Dvorak,et al. Immobilized Synthetic Pathway for Biodegradation of Toxic Recalcitrant 化IIutantI,2,S-Trichloropropane.!Environ.Sci.Technol.,2014,48(12):6859-6866)W 聚乙締醇为载体包埋固定化面醇脱面酶，但操作批次只有10批，稳定性较差，无法达到工业 化生产要求。
[0005] 通过化学或物理方法可W将面醇脱面酶多点共价固定在水不溶性的环氧树脂载 体上，使得其既能保持了面醇脱面酶的催化特性同时又具备了可回收利用，后续过程中容 易与产物分离、能够实现连续化生产等特性。因此，固定化酶将能极大提升面醇脱面酶在工 业生产中的应用范围。 H、
【发明内容】

[0006] 本发明的目的是针对现有制备固定化面醇脱面酶工艺的不足之处，提供一种制备 固定化面醇脱面酶的方法，W及采用制备的固定化面醇脱面酶制备环氧氯丙烷及手性环氧 化物的方法。该方法具有反应溫度溫和，固定化酶半衰期长，操作稳定性好，成本较低等特 点。
[0007] 本发明的思想在于:首先，对重组面醇脱面酶进行固定化，然后通过固定化酶催化 合成环氧氯丙烷及手性环氧化物。固定化酶作为催化剂，便于酶的回收和重复使用、提高酶 的稳定性、可连续操作及自动化控制、工艺简单，从而大幅度降低生物催化合成环氧氯丙烷 的生产成本，设及酶固定化W及利用固定化酶催化合成高价值化合物的技术领域。
[0008] 实现本发明的目的技术方案是：
[0009] 本发明提供一种固定化重组面醇脱面酶，所述固定化重组面醇脱面酶W市售环氧 基树脂载体，经吸附、多点共价、去环氧基等简单工艺，制备出固定化重组面醇脱面酶产品， 具体的方法步骤如下：
[0010] (1)将含重组面醇脱面酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的发酵液离 屯、，去除上清液，将菌体沉淀用pH = 7.0、0.1M的憐酸钢缓冲液悬浮后进行破碎(优选240W， 超声Is,间隔Is处理20min)、离屯、，取破碎上清液;所述重组面醇脱面酶编码基因的核巧酸 序列为SEQ ID NO. 1所示，所述重组面醇脱面酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；
[0011] (2)取步骤(1)中的破碎上清液为酶源，向酶源中加入抑=7.0、0.1 M的憐酸钢缓冲 液，混匀，形成待固定酶液，将待固定酶液与载体混合，在25°C下揽拌化-2化，取出载体用蒸 馈水冲洗后，放入pH=8.5、0.1M的憐酸钢缓冲液中，再加入甘油，25-30°C下保溫1-3天(优 选30°C下保溫1天），获得保溫后的载体;所述酶源的含酶量W破碎前湿菌体重量计为0.1 g/ ml,所述待固定酶液中酶源的体积终浓度为0.1%~8%;所述载体质量W待固定酶液的体 积用量计为0.01-lg/ml;所述甘油体积终浓度为20% (v/v);所述载体为环氧树脂；
[001^ (3)将步骤(2)保溫后的载体浸入抑=8.5,1.0-3.OM的甘氨酸水溶液中，25°C保溫 2地，最后再用蒸馈水冲洗，得到固定化重组面醇脱面酶。
[0013] 本发明所述载体表面含有的官能团为环氧基，优选但不限于所述载体为环氧树脂 Eupe:堪i曠 .C(购自德国罗姆(Roehm)公司）、环氧树脂Spebeads EC-EP(购自日本S菱化学 公司）、环氧树脂LX-1000EP(购自西安蓝晓科技有限公司）或环氧树脂ES-103B、ES-1和ES-1〇5(购自天津南开和成科技有限公司）。
[0014] 本发明面醇脱面酶固定化的方法中，面醇脱面酶蛋白分子通过多点共价与环氧载 体表面结合，酶蛋白分子与固体载体的相互作用，致使酶催化中屯、构象发生了改变，提高了 面醇脱面酶的立体选择性。
[0015] 本发明面醇脱面酶固定化的方法中，使用的吸附缓冲液为低浓度（IOOmM)的憐酸 盐缓冲液。现有方法所报道的环氧树脂固定化方法中，使用高盐(〉m)溶液或缓冲液，主要 是利用盐溶液对酶蛋白分子的"盐析"作用降低酶分子在溶液中的溶解度，从而促进其在疏 水载体表面的吸附速率，但高盐溶液会致使酶蛋白发生变性，导致较低的酶活回收率，对W 后大规模生产中会造成成本高，设备腐蚀严重等问题。由于面醇脱面酶分子表面有着较多 的疏水性基团，表面疏水性较高，易与载体表面的疏水环氧基团发生分子间作用。面醇脱面 酶在低盐浓度下即可与环氧基载体快速吸附，即表现出较快的吸附速率W及极高的蛋白吸 附率(大于90 % )，活性损失小，酶活回收率高。
[0016] 本发明面醇脱面酶固定化的方法，通过控制固定化过程吸附阶段缓冲液的pH条件 来增强酶分子表面与载体的物理吸附过程，W及控制共价固定阶段保护液的抑和溫度诱使 酶分子表面的氨基、簇基与载体表面的环氧基发生多点共价作用。最终得到具有较高的吸 附效率W及优良的操作稳定性的固定化酶。
[0017] 本发明还提供一种所述固定化重组面醇脱面酶在制备环氧化物中的应用，所述的 应用为：W固定化重组面醇脱面酶为催化剂，W面代醇为底物，在pH值为8.0-10.0缓冲液 中，于30-40°C、ISOrpm条件下反应完全后，获得含环氧化物混合液，将混合液分离纯化，获 得所述环氧化物;所述底物终浓度为10-50mmol/L缓冲液(优选40mmol/L)，所述催化剂的添 加终浓度为lO-lOOg/L缓冲液(优选催化剂用量为每升反应体系添加 40g固定化酶）。
[0018] 进一步，优选所述底物为1，3-二氯-2-丙醇、1，3-二漠 -2-丙醇、2-氯-1-苯乙醇或 2,3-二漠 -1-丙醇。
[0019] 本发明还提供一种所述固定化重组面醇脱面酶在制备手性环氧化物中的应用，所 述的应用为：W固定化重组面醇脱面酶为催化剂，W1，3-二氯-2-丙醇为底物，在抑值为8-10甘氨酸-NaOH缓冲液中，于35°C、180rpm条件下反应完全后，获得含手性环氧化物的混合 液，将混合液分离纯化，获得所述手性环氧化物;所述底物终浓度为IO-SOmmo 1/L缓冲液(优 选40mmol/L)，所述催化剂的添加终浓度为50-100g/L缓冲液(优选催化剂用量为每升反应 体系添加 SOg固定化酶）；所述底物为1，3-二氯-2-丙醇、1，3-二漠 -2-丙醇、2-氯-1-苯乙醇、 1，3-二漠 -2-丙醇或2，3-二漠 -2-丙醇。
[0020] 本发明还提供一种所述固定化重组面醇脱面酶在催化面代径基下酸乙醋脱面中 的应用，所述应用为：W固定化重组面醇脱面酶为催化剂，W面代径基下酸乙醋为底物，在 pH值为7-10的缓冲液中，于35°C、180巧m条件下反应完全后，获得含(R)-4-氯基-3-径基下 酸乙醋的混合液，将混合液分离纯化，获得所述(R)-4-氯基-3-径基下酸乙醋;所述面代径 基下酸乙醋为（S)-4-氯-3-径基下酸乙醋，所述底物终浓度为100-400g/L缓冲液（优选 300g/L)，所述催化剂的添加终浓度为50-120g/L缓冲液(优选催化剂用量为每升反应体系 添加 50g固定化酶）。
[0021] 本发明还提供一种所述固定化重组面醇脱面酶在拆分环氧化物制备手性环氧化 物中的应用，所述的应用为：W固定化重组面醇脱面酶为催化剂，W环氧化物为底物，加入 亲核试剂，在pH值为4.0-7.0的缓冲液中，于35°C、ISOrpm条件下反应完全后，获得含手性环 氧化物的混合液，将混合液分离纯化，获得所述手性环氧化物;所述环氧化物为苯基环氧乙 烧或环氧氯丙烷，所述底物终浓度为lO-lOOmmol/L缓冲液(优选40mmol/L)，所述亲核试剂 为化化，NaM)2或NaCN(优选化N02)，所述亲核试剂的加入量为20-200mmol/L缓冲液（优选 50mmol/L)，所述催化剂的添加终浓度为50-100g/L缓冲液(优选催化剂用量为每升反应体 系添加 SOg固定化酶）。
[0022] 本发明还提供一种所述固定化重组面醇脱面酶在拆分2,3-二氯-I-丙醇制备(S)-2,3-二氯-1-丙醇中的应用，所述的应用为：W固定化重组面醇脱面酶为催化剂，W2,3-二 氯-1-丙醇为底物，在pH值为8.0-9.0的缓冲液中，于35°C、ISOrpm条件下反应完全后，获得 含(S)-2,3-二氯-1-丙醇的混合液，将混合液分离纯化，获得所述(S)-2,3-二氯-1-丙醇;所 述底物终浓度为10-40mmol/L缓冲液（优选30mmol/L)，所述催化剂的添加终浓度为50-lOOg/L缓冲液(优选80g/L)。
[0023] 上述应用中，所述的反应各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择。
[0024] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0025] 本发明所述重组基因工程菌最优选W含面醇脱面酶的重组大肠杆菌E.COli BL21 (DE 3)/祀T28b( + )-HH畑为例，所述重组大肠杆菌是将面醇脱面酶基因与PGEM-T载体进行 连接后导入E.coli JM109中，对HHDH/PGEM-T和质粒祀T28b( + )-Nit进行双酶切，连接酶连 接过夜，将连接产物pET28b( + )-HHDH导入宿主E.coli BL2UDE3)中，所得的重组大肠杆菌 E.coli 化21 (DE3)/pET28b( + )-皿DH作为生产菌种（Zhi-Qiang Liu et alAJournal Of Industrial Microbiology&Biotechnology Process Biochemistry 41(2014)1145-1158)eAgrobacterium tumefaciens CCTCC M 87071面醇脱面酶突变体基因（核巧酸序列 为沈Q ID NO. 1所示）。
[00%]本发明中重组面醇脱面酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得发酵液按 如下步骤获得：
[0027] (1)斜面培养:将重组面醇脱面酶编码基因的基因工程菌接种至含终浓度50μg/ml 卡那霉素的斜面培养基，37°C培养12h，获得斜面菌体;斜面培养基终浓度组成为：蛋白腺 1 Og/L，酵母粉5g/L，NaCl 1 Og/L，琼脂20g/L，抑自然，溶剂为水；
[0028] (2)种子培养:挑取斜面菌种接入含终浓度50μg/ml的卡那霉素的种子培养基，装 液量为50mL，37°C、ISOrpm培养8-10小时，获得种子液;种子培养基终浓度组成为：蛋白腺 1 Og/L，酵母粉5g/L，NaCl 1 Og/L，抑自然，溶剂为水；
[0029] (3)发酵培养:按体积浓度2 %的接种量，将种子液接入装有IOOmL含终浓度50iig/ ml的卡那霉素的发酵培养基的500血；角瓶中，37°C、15化pm培养化，然后加入lOg/L乳糖诱 导剂，28°C，150巧m条件下诱导12h，将发酵液离屯、，收集菌体沉淀，将菌体沉淀用抑= 7.0、 0.1 M的憐酸钢缓冲液悬浮后进行破碎、离屯、，然后取破碎上清液，即获得酶源;发酵培养基 终浓度组成为:蛋白腺lOg/L，酵母粉5g/L，NaCl lOg/L，pH自然，溶剂为水；
[0030] 本发明中1，3-二氯-2-丙醇、1，3-二漠 -2-丙醇、2-氯-1-苯乙酸、1，3-二漠 -2-丙醇 或2,3-二漠 -2-丙醇和环氧氯丙烷采用气相色谱仪(美国安捷伦Agilent-7890型）进行检 测。检测条件:色谱柱为HP-5毛细管柱，配备FID检测器;柱溫60°C保持4min，20°C/min升溫 至160°C ;前进样口溫度为230°C ;检测器FI的盘度为250°C ;载气(化)流速为54mL/min。
[0031 ]本发明中（R)-环氧氯丙烷、（S)-环氧氯丙烷、（R)-4-氯基-3-?基下酸乙醋、（S)-4-氯-3-径基下酸乙醋、（R)-苯基环氧乙烧采用气相色谱仪(GC-14C)进行检测。检测条件： 色谱柱为BGB-175毛细管柱；柱溫90°C，进样室溫度220°C，FID检测器220°C，氮气流量为 1.6mL/min，分流比为 40:1。
[0032]底物和产物的光学纯度通过计算对映体过量值（ee)来评价，公式：ee= ks-CR]/ [CS+CR] X 100%，其中，C沸CR为产物S型和R型异构体的浓度。
[0033] 本发明的有益效果主要体现在：
[0034] (1)当前制备环氧化合物或手性e-取代醇的主要生产方法仍然是化学法。面醇脱 面酶通过催化碳-面键的断裂脱面合成环氧化合物，或通过高选择性地催化亲核试剂介导 的环氧化物开环反应，合成一系列光学纯的e-取代醇。酶法拆分具有催化效率高、选择性 强、反应条件溫和等特点，且面醇脱面酶来源广泛，发酵成本低，是制备环氧化物或e-取代 醇的理想催化剂。本发明构建的固定化重组面醇脱面酶对面醇底物转化效率高，底物耐受 性强，对底物及其结构类似物具有良好的催化选择性，可W用于合成环氧氯丙烷、（R)-4-氯 基-3-径基下酸乙醋、（S)-2,3-二氯-1-丙醇等。
[0035] (2)本发明使用环氧基树脂制备固定化重组面醇脱面酶，固定化酶的酶活回收率 较高;热稳定性高，使用范围广，在40°C -50°C下，热稳定性相比游离酶提高了 15-20倍;连续 使用50批后还保持高达90%的转化率，显著延长了重组面醇脱面酶的使用寿命，生产成本 低，有利于可持续发展。
[0036] (3)本发明具有方法操作简单易行、反应条件溫和、设备通用易得、无废"排放、 物料能循环回收利用，资源利用率高等特点，进一步降低成产成本，便于推广应用，是一种 绿色环保、安全无毒的成产方法。
[0037] (4)本发明可广泛应用于制备固定化重组面醇脱面酶，采用本发明方法制备的产 品，可广泛应用于手性化学品制备、医药、化工等行业中。 四、
【附图说明】
[0038] 图1为固定化重组面醇脱面酶和游离酶的最适溫度的比较。
[0039] 图2为固定化重组面醇脱面酶和游离酶的最适抑的比较。
[0040] 图3为固定化重组面醇脱面酶在不同溫度下的热稳定性曲线图。
[0041] 图4为固定化重组面醇脱面酶在填充床中的操作稳定性曲线图。 五、
【具体实施方式】
[0042] 下面结合具体实施例子对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限 于此：
[0043] 实施例1重组面醇脱面酶基因工程菌的构建及发酵
[0044] 1)重组面醇脱面酶基因工程菌的构建:将面醇脱面酶基因 HHDH(核巧酸序列为SEQ ID N0.1所示）与PGEM-T载体进行连接后导入E.coli JM109中，对皿DH/PGEM-T和质粒 pET28b( + )-Nit进行双酶切，连接酶连接过夜，将连接产物祀T28b( + )-HHDH导入宿主E.coli BL21 (DE3)中，筛选获得重组大肠杆菌E. CO 1 i BL21 (DE3) /pET28b (+) -HHDH。
[0045] 2)重组面醇脱面酶基因工程菌的发酵
[0046] (1)斜面培养:将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b( + )-HHDH接种至含终浓 5化g/ml卡那霉素的斜面培养基，37 °C培养12h，获得斜面菌体;斜面培养基终浓度组成为： 蛋白腺lOg/L，酵母粉5g/L，NaCl lOg/L，琼脂20g/L，抑自然，溶剂为水；
[0047] (2)种子培养:挑取斜面菌种接入含终浓度50μg/ml的卡那霉素的种子培养基，装 液量为50mL，37°C、ISOrpm培养8-10小时，获得种子液;种子培养基终浓度组成为：蛋白腺 1 Og/L，酵母粉5g/L，NaCl 1 Og/L，琼脂20g/L，抑自然，溶剂为水；
[004引（3)发酵培养:按体积浓度2 %的接种量，将种子液接入装有IOOmL含终浓度50iig/ ml的卡那霉素的发酵培养基的5001111^立角瓶中，37°C、15化pm诱导培养10-1化，将发酵液离 屯、（90(K)rpm，IOmin)收集沉淀菌体，即为本发明所述的含重组面醇脱面酶编码基因的重组 基因工程菌菌体细胞，-4°C保存备用;发酵培养基终浓度组成为:蛋白腺lOg/L，酵母粉5g/ UNaCl lOg/L，琼脂20g/L，pH自然，溶剂为水。
[0049] 实施例2重组面醇脱面酶粗酶液的制备
[0050] 将实施例1中获得的重组面醇脱面酶菌体经清水清洗后，用一定量的pH = 7.0、 0.1 M憐酸钢缓冲液溶解，配制成浓度为1 g/1 OmL的菌悬液，在冰水浴中超声波（240W，超声 1S，间隔1S)处理20min破碎细胞，破碎液在4°C下9000巧m，离屯、IOmin，上清液即为粗酶液， 含酶量W破碎前湿菌体重量计为0.1 g/ml。然后取上清液1ml，通过BCA蛋白含量检测试剂盒 (南京凯基生物科技发展有限公司）测定粗酶液蛋白含量约为lOmg/mL。
[0051] 实施例3重组面醇脱面酶的固定化
[0化2] 3.1载体的选择
[0053] 先进行初步试验筛选出有潜力的载体，再对选择出的载体进行详细的固定化条件 研究。
[0054] 不同生产厂家生产的环氧基树脂有着不同的含水量、载体表面的孔径分布、环氧 密度等参数，因而在对酶的固定化时会对最终的结果造成一定的差异。考虑到国内外环氧 树脂的价格差异，选择较为便宜的国内西安蓝晓科技公司的LX-1000 EP(C)、南开科技公司 的ES-1、ES-105、ES-103B四种环氧树脂作为备选的固定化载体。
[0055] 取实施例2所获得的粗酶液IOmL加入到200mL，抑=7.0、0.1 M的憐酸钢缓冲液中， 混匀形成待固定酶液;将待固定酶液与20g载体混合，25°C下揽拌lOh，取出载体用蒸馈水冲 洗后放入200ml、抑=8.5、0.1 M的憐酸氨钢缓冲液中，再加入40ml甘油（甘油加入量W憐酸 氨钢缓冲液体积计为20%)，30°C下保溫24h;取出保溫后的载体用蒸馈水冲洗后浸入 200ml、抑=8.5，3. OM的甘氨酸水溶液中，25°C保溫2地，最后再用蒸馈水冲洗，得到固定化 重组面醇脱面酶。
[0056] 取样测定固定化酶活力。得到的结果为：Wlx-1000 EP(C) ,ES-I，ES-105，ES-103B 为载体的固定化酶酶活分别为365.28U/g，92.24U/g，314.5抓/g，456.6U/g。
[0057] 固定化酶和游离酶的酶活测定:取0.2g实施例3获得的固定化重组面醇脱面酶或 0.15mL实施例2获得的重组面醇脱面酶粗酶液，Wo. 4mmol的1，3-二氯-2-丙醇为底物，W抑 =8.5的棚酸钢缓冲液为反应介质构成IOmL反应体系，在35 °C、18化pm的水浴摇床中反应 2min，取0.4血反应液置于已加入10化IM肥1水溶液的EP管中终止反应，再加入0.8血乙酸 乙醋进行萃取，在1200化pm、4°C的条件下离屯、lOmin，取上清有机相，用气相检测。
[0058] 1,3-二氯-2-丙醇和环氧氯丙烷的气相检测方法:使用的气相色谱仪为美国安捷 伦Agi 1 ent-7890型，配备FID检测器。色谱分析条件:色谱柱为HP-5毛细管柱;柱溫60°C保持 4min，20°C/min升溫至160°C ;前进样口溫度为230°C ;检测器FID溫度为250°C ;载气(N2)流 速为 54mL/min。
[0059] 酶活定义:35°C，p册.5条件下，每分钟催化1,3-二氯-2丙醇生成1皿Ol的环氧氯丙 烧所需的酶量，即为1个酶活力单位，用U表示;在上述测定条件下，重组面醇脱面酶粗酶液 的活力为158.54U/mL。
[0060] 3.2酶的添加量对蛋白固定率、酶回收率W及酶活的影响
[0061 ] 取实例2所获得的粗酶液(0.5ml、Iml、2ml、5ml、IOml和15ml，对应的含酶量为5mg、 10111邑、20111旨、50111旨、100111旨和150111旨）加入到2001111，抑=7.0的0.謹的憐酸钢缓冲液中，均匀混 合形成固定酶液;将待固定酶液与20g载体混合，25°C下揽拌lOh，然后取上清液1ml，通过 BCA蛋白含量检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司）测定其上清液的蛋白含量。取 出载体用蒸馈水冲洗后放入200ml、抑=8.5的0.1 M的憐酸钢缓冲液中，再加入40ml甘油(甘 油加入量W憐酸钢缓冲液体积计为20%)，30°C下保溫24h;取出保溫后的载体用蒸馈水冲 洗后浸入200ml、抑=8.5，3. OM的甘氨酸水溶液中，25°C保溫2地，最后再用蒸馈水冲洗，得 到固定化重组面醇脱面酶。最后取样(〇.2g)测定固定化酶活力，酶活力测定方法同实施例 3.1。
[0062] 重组面醇脱面酶粗酶液的酶蛋白含量与环氧基树脂ES-103B的比例为5-150mg/g 树脂，优选10-20mg/g树脂。当与环氧基树脂反应的重组面醇脱面酶的量较低时，树脂表面 的环氧基不能被酶分子所饱和，随着酶浓度的增加，树脂表面基团逐渐被饱和，固定化酶的 单位酶活在逐渐增加，当酶蛋白含量和环氧基载体比例超过50mg/g时，固定化酶的单位酶 活上升速度变缓，而总酶活回收率已只有50%，并下降较快，运表明树脂已基本被酶分子饱 和。当酶蛋白含量和环氧基载体的比例为5mg/g时，蛋白固定率为91.74%，酶活回收率为 75.97%，固定化酶的单位酶活为239.2U/g树脂；当酶蛋白含量和环氧基载体的比例为 lOmg/g时，蛋白固定率为89.72 %，酶活回收率为72.66 %，固定化酶的单位酶活为456.6U/g 树脂；当酶蛋白含量和环氧基载体的比例为20mg/g时，蛋白固定率为86.27%，酶活回收率 为66.47%，固定化酶的单位酶活为835.4U/g树脂；当酶蛋白含量和环氧基载体的比例为 50mg/g时，蛋白固定率为70.28 %，酶活回收率为51.98 %，固定化酶的单位酶活为1633.2U/ g树脂；当酶蛋白含量和环氧基载体的比例为150mg/g时，蛋白固定率为40.28%，酶活回收 率为26.50%，固定化酶的单位酶活为2497.9U/g树脂；另一方面，随着酶量的增加，由于部 分酶分子未能牢固的共价在环氧基树脂表明上，无法形成刚性更好的多点共价形式，因此 导致稳定性的下降。因此优选酶蛋白含量和环氧基载体的比例为10-20mg/g树脂。
[0063] 3.3吸附时间对固定化酶的影响
[0064] 选择0. lM、pH = 7.0的憐酸钢缓冲液作为盐溶液，转速18化pm、溫度为25°C的条件 下，加入实施例2中获得的重组面醇脱面酶粗酶液IOmU W超声破碎前湿菌体重量计为 0.1 g/ml)，使终体积为200血，混匀静置IOmin后，加入20g ES-103B树脂，25°C下揽拌化、5h、 1011、1211、1511，获得吸附时间不同的固定化重组面醇脱面酶。取样(0.2邑)测定固定化酶活 力，酶活力测定方法同实施例3.1。随着吸附时间的增长(3h-10h)，酶活逐渐增加，但在IOh 后，酶活基本保持不变。因此优选吸附时间为1 Oh。
[0065] 3.4共价保溫时间对固定化酶稳定性的影响
[0066] 选择实施例3.3中吸附IOh后的载体20g，用蒸馈水冲洗后放入pH为8.5的IOOmM的 憐酸钢缓冲液200ml中，再加入甘油40ml (体积终浓度为20% )，平均分成4份，30°C下分别保 溫12h、2地、36h、48h，获得保溫时间不同的载体;保溫后的载体用蒸馈水冲洗后浸入P册.5， 3M的甘氨酸水溶液中，25°C保存2地，最后再用蒸馈水冲洗，得到固定化重组面醇脱面酶。取 样(〇.2g)测定固定化酶活力，酶活力测定方法同实施例3.1。不同的保溫时间对酶活影响不 大，保溫 1211、2地、3611、4她的酶活分别为111.561]/邑、116.661]/邑、108.131]/邑、105.891]/邑。但 固定化酶的稳定性在保溫12h-24h后都有提升;在保溫24h-4她后，固定化酶的热稳定提升 已并不明显。
[0067] 实施例4固定化重组面醇脱面酶与游离酶的最适溫度、抑W及热稳定性
[0068] 1)面醇脱面酶固定化步骤如下：
[0069] (1)取实施例2所获得的粗酶液IOmU W破碎前湿菌体重量计，酶量为0.1 g/ml)加 入到200mL，pH=7.0的0.1 M的憐酸钢缓冲液中，混匀形成待固定酶液；
[0070] (2)将步骤（1)所得待固定酶液与20g环氧树脂ES-103B载体混合，25°C下揽拌lOh， 取出载体用蒸馈水冲洗后放入200ml、pH=8.5的0.1 M的憐酸钢缓冲液中，再加入甘油40ml (体积终浓度为20% )，30°C下保溫24h;
[0071] (3)取出步骤(2)所得载体用蒸馈水冲洗后浸入抑=8.5,3.OM的甘氨酸水溶液中， 25°C保溫2地，最后再用蒸馈水冲洗，得到固定化重组面醇脱面酶。
[0072] 2)最适溫度
[0073] 取步骤1)0.2g固定化重组面醇脱面酶和实施例2制备的15化L游离酶在不同溫度 (30、40、50、60、70、80°(：)下分别测定其活力。结果如图1所示：固定化酶的最适反应溫度比 游离酶高5°C。并且在75°C时，固定化酶的相对酶活仍可达到最高酶活的80% W上，而游离 酶的相对酶活只有60%左右。运表明固定化酶对溫度变化敏感度降低，有利于适应在不同 溫度下进行反应。
[0074] 3)最适抑
[0075] 取步骤1)0.2g固定化重组面醇脱面酶和实施例2制备的15化L游离酶分别在pH6、 6.5、7、7.5、8(憐酸氨钢缓冲）、抑8.5、9(棚酸钢缓冲)及抑9.5、10(化13-化細)的溶液中 测定游离酶和固定化酶的活力。结果如图2所示：游离酶和固定化酶的最适作用pH值均在 9.0左右。但固定化酶对抑值变化的敏感度明显下降，在抑=6.0-9.0范围内，固定化酶的相 对酶活都高于游离酶，运表明固定化酶有效地扩大酶的作用抑的范围。
[0076] 4)热稳定性
[0077] 取步骤1)0.2g固定化重组面醇脱面酶和实施例2制备的15化L游离酶在不同溫度 下(40、50、60°C)保溫，每隔一定时间取样测定固定化酶酶活和游离酶酶活，WO时刻的重组 面醇脱面酶酶活为100%，计算相对酶活。结果如图3所示：固定化酶的酶活在40-50°C范围 内保溫7天后，还仍有85%-95%，运表明固定化酶在该溫度范围内有着很好的热稳定性。在 40 °C、50 °C、60 °C下的半衰期分别为68.3d、26.5d、2. Od。而游离酶在40 °C、50 °C、60 °C下的半 衰期分别为8.6(1、5.2(1、0.4(1。固定化酶的溫度耐受性得到了大幅度的提高。
[0078] 实施例5固定化重组面醇脱面酶催化1,3-二氯-2-丙醇合成环氧氯丙烷
[0079] 按实施例4方法制备的固定化重组面醇脱面酶作为催化剂，1,3-二氯-2-丙醇为底 物，进行转化反应制备环氧氯丙烷。转化体系组成及转化操作如下：IOmUpH 9.0棚砂-棚酸 缓冲液中加入0.2g固定化酶和40mmol/L缓冲液的1，3-二氯-2-丙醇，40°C水浴摇床18化pm 条件下反应50min，用2倍体积乙酸乙醋进行萃取，用气相色谱分析测定底物转化率和产物 收率。1,3-二氯-2-丙醇的转化率达到96% W上，环氧氯丙烷的收率达到89%。
[0080] 在填充床（内径1.0畑1，高20(：111，外带水浴夹套;精密恒流蠕动累81300-21:保定兰 格恒流累有限公司）中测定固定化重组面醇脱面酶的操作稳定性。填充床条件为:高径比为 9:1，添加 6g的固定化酶，W1，3-二氯-2-丙醇为底物，底物溶液流速为8mL/min，底物溶液为 100mL、pH = 9.0的200mM的棚砂-棚酸缓冲液，其底物溶液中底物浓度为40mM。填充床和流入 填充床的底物溶液控制溫度为40°C。选择化作为一个反应批次，每批反应后用蒸馈水冲洗 5min。连续反应50批次后，环氧氯丙烷的相对收率(相对于第一批)仍然保持在90% W上，如 图4所示。运显示出本发明制备的固定化重组面醇脱面酶具有良好的操作稳定性。
[0081] 对比例1重组面醇脱面酶催化1,3-二氯-2-丙醇合成环氧氯丙烷
[0082] 按实施例1方法制备的重组面醇脱面酶菌体作为催化剂，1,3-二氯-2-丙醇为底 物，进行转化反应制备环氧氯丙烷。转化体系组成及转化操作如下：IOOmUpH 9.OJOOmM的 棚砂-棚酸缓冲液中加入0.5g面醇脱面酶湿菌体和40mmol/L缓冲液的1，3-二氯-2-丙醇，40 °(：水浴摇床18化pm条件下反应50min，用2倍体积乙酸乙醋进行萃取，用气相色谱分析测定 底物转化率和产物收率。1,3-二氯-2-丙醇的转化率达到96% W上，环氧氯丙烷的收率达到 89%。W上述过程作为一个反应批次，每批反应后将反应液离屯、，转速为9000化pm，时间 lOmin。倒出上清液，将底部菌体作为下一批的催化剂，重复上述反应过程。连续反应5批次 后，环氧氯丙烷的的相对收率(相对于第一批)低于50%。
[0083] 实施例6固定化重组面醇脱面酶催化1,3-二氯-2-丙醇合成(S)-环氧氯丙烷
[0084] 按实施例4方法制备的固定化重组面醇脱面酶作为催化剂，1,3-二氯-2-丙醇为底 物，进行转化反应制备手性环氧氯丙烷。转化体系组成及转化操作如下：IOmUpH 10.0甘氨 酸-NaOH缓冲液中加入0. Sg固定化酶和40mmol/L缓冲液的1，3-二氯-2-丙醇（W不加固定化 酶的反应作为对照，有〇.5mmol/L消旋的环氧氯丙烷生成），35°C水浴摇床18化pm条件下反 应15min，用等体积乙酸乙醋进行萃取，萃取两次，合并萃取液，用气相色谱分析测定底物转 化率，产物收率和ee值。1,3-二氯-2-丙醇的转化率达到93% W上，（S)-环氧氯丙烷的收率 达到85 %，ee值达到94 %。
[0085] 在填充床（内径1.0畑1，高20(：111，外带水浴夹套;精密恒流蠕动累81300-21:保定兰 格恒流累有限公司）中测定固定化重组面醇脱面酶的操作稳定性。填充床条件为:高径比为 15:1，添加 IOg的固定化酶，W1，3-二氯-2-丙醇为底物，底物溶液流速为12mL/min，底物溶 液为IOOmL、抑=10.0的IOOmM甘氨酸-化OH缓冲液，其底物溶液中底物浓度为40mM。填充床 和流入填充床的底物溶液控制溫度为35°C。选择20min作为一个反应批次，每批反应后用蒸 馈水冲洗5min。连续反应50批次后，环氧氯丙烷的相对收率（相对于第一批）仍然保持在 90%W 上。
[0086] 对比例2重组面醇脱面酶催化1,3-二氯-2-丙醇合成(S)-环氧氯丙烷
[0087] 按实施例1方法制备的重组面醇脱面酶菌体作为催化剂，1,3-二氯-2-丙醇为底 物，进行转化反应制备(S)-环氧氯丙烷。转化体系组成及转化操作如下：100mL、抑10.0甘 氨酸-NaOH缓冲液中加入0. Sg面醇脱面酶湿菌体和40mmol/L缓冲液的1，3-二氯-2-丙醇，35 °(：水浴摇床18化pm条件下反应15min，用等体积乙酸乙醋进行萃取，用气相色谱分析测定底 物转化率、产物收率和ee值。1,3-二氯-2-丙醇的转化率达到94% W上，（S)-环氧氯丙烷的 收率达到87 %，ee值达到98 %。W上述过程作为一个反应批次，每批反应后将反应液离屯、， 转速为9000化pm，时间IOmin。倒出上清液，将底部菌体作为下一批的催化剂，重复上述反应 过程。连续反应10批次后，（S)-环氧氯丙烷的的相对收率(相对于第一批)低于50%。
[0088] 实施例7固定化重组面醇脱面酶催化1,3-二漠 -2-丙醇合成(S)-环氧漠丙烷
[0089] 按实施例4方法制备的固定化重组面醇脱面酶作为催化剂，1,3-二漠 -2-丙醇为底 物，进行转化反应制备(S)-环氧漠丙烷。转化体系组成及转化操作如下：10mL、pH 10.0甘氨 酸-NaOH缓冲液中加入0. Sg固定化酶和30mmol/L缓冲液的1，3-二漠-2-丙醇，35°C水浴摇床 ISOrpm条件下反应20min，用等体积乙酸乙醋进行萃取，萃取两次，合并萃取液，用气相色谱 分析测定底物转化率、产物收率和ee值。1,3-二漠-2-丙醇的转化率达到96% W上，（S)-环 氧漠丙烷的收率达到82%，ee值达到75.2%。
[0090] 在填充床（内径1.0畑1，高20(：111，外带水浴夹套;精密恒流蠕动累81300-21:保定兰 格恒流累有限公司）中测定固定化重组面醇脱面酶的操作稳定性。填充床条件为:高径比为 15:1，添加 IOg的固定化酶，W1，3-二漠-2-丙醇为底物，底物溶液流速为12mL/min，底物溶 液为IOOmL、抑=10.0的IOOmM甘氨酸-化OH缓冲液，其底物溶液中底物浓度为30mM。填充床 和流入填充床的底物溶液控制溫度为35°C。选择30min作为一个反应批次，每批反应后用蒸 馈水冲洗5min。连续反应31批次后，环氧氯丙烷的相对收率（相对于第一批）仍然保持在 90%W 上。
[0091] 对比例3重组面醇脱面酶催化1,3-二漠-2-丙醇合成(S)-环氧漠丙烷
[0092] 按实施例1方法制备的重组面醇脱面酶菌体作为催化剂，1,3-二漠-2-丙醇为底 物，进行转化反应制备(S)-环氧漠丙烷。转化体系组成及转化操作如下：100mL、抑10.0甘 氨酸-NaOH缓冲液中加入0. Sg面醇脱面酶湿菌体和40mmol/L缓冲液的1，3-二漠-2-丙醇，35 °(：水浴摇床18化pm条件下反应20min，用等体积乙酸乙醋进行萃取，萃取两次，合并萃取液， 用气相色谱分析测定底物转化率、产物收率和ee值。1，3-二漠-2-丙醇的转化率达到94% W 上，（S)-环氧漠丙烷的收率达到85%，ee值达到90.6%。W上述过程作为一个反应批次，每 批反应后将反应液离屯、，转速为9000化pm，时间lOmin。倒出上清液，将底部菌体作为下一批 的催化剂，重复上述反应过程。连续反应8批次后，（S)-环氧氯丙烷的的相对收率(相对于第 一批)低于50%。
[0093] 实施例8固定化重组面醇脱面酶催化(S)-4-氯-3-径基下酸乙醋脱面反应
[0094] 按实施例4方法制备的固定化重组面醇脱面酶作为催化剂，（S)-4-氯-3-径基下酸 乙醋为底物，进行转化反应制备(R)-4-氯基-3-径基下酸乙醋。转化体系组成及转化操作如 下：向IOOmL烧瓶中加入30mL IOOmM憐酸盐缓冲液(pH 8.0)，加入固定化酶1.5g和终浓度 300g/L(S)-4-氯-3-径基下酸乙醋，利用恒定pH/电位滴定仪流加化CN调节pH至8.0,在35 °C，反应lOh。取样，用两倍体积的乙酸乙醋萃取，气相检测(R)-4-氯基-3-径基下酸乙醋含 量和ee值。（S)-4-氯-3-径基下酸乙醋的转化率95%左右，（R)-4-氯基-3-径基下酸乙醋收 率为87.3 %，ee值大于99 %。
[00M]在填充床（内径1.0畑1，高20(：111，外带水浴夹套;精密恒流蠕动累81300-21:保定兰 格恒流累有限公司）中测定固定化重组面醇脱面酶的操作稳定性。填充床条件为:高径比为 12:1，添加 Sg的固定化酶，W(S)-4-氯-3-径基下酸乙醋为底物，底物溶液流速为8mL/min， 底物溶液为IOOmUpH=S. 0的IOOmM憐酸盐缓冲液，其底物溶液中底物浓度为300g/L。并利 用恒定抑/电位滴定仪流加化CN调节抑至8.0，填充床和流入填充床的底物溶液控制溫度为 35°C。选择IOh作为一个反应批次，每批反应后用蒸馈水冲洗5min。连续反应15批次后，环氧 氯丙烷的相对收率(相对于第一批)仍然保持在90% W上。
[0096] 对比例4重组面醇脱面酶催化(S)-4-氯-3-径基下酸乙醋脱面反应
[0097] 按实施例1方法制备的固定化重组面醇脱面酶菌体作为催化剂，（S)-4-氯-3-径基 下酸乙醋为底物，进行转化反应制备(R)-4-氯基-3-?基下酸乙醋。转化体系组成及转化操 作如下：向IOOmL烧瓶中加入30mL IOOmM憐酸盐缓冲液(pH 8.0)，加入0.6g面醇脱面酶湿菌 体和终浓度300g/L(S)-4-氯-3-径基下酸乙醋，利用恒定抑/电位滴定仪流加 NaCN调节抑至 8.0,在35°C，反应化。取样，用两倍体积的乙酸乙醋萃取，气相检测(R)-4-氯基-3-径基下酸 乙醋含量和ee值。（S)-4-氯-3-径基下酸乙醋的转化率96%左右，（R)-4-氯基-3-径基下酸 乙醋收率为89.3 %，ee值大于99%。W上述过程作为一个反应批次，每批反应后将反应液离 屯、，转速为9000化pm，时间lOmin。倒出上清液，将底部菌体作为下一批的催化剂，重复上述 反应过程。连续反应5批次后，（R)-4-氯基-3-径基下酸乙醋的相对收率(相对于第一批)低 于50%。
[0098] 实施例9固定化重组面醇脱面酶催化环氧氯丙烷的拆分合成(R)-环氧氯丙烷
[0099] 按实施例4方法制备的固定化重组面醇脱面酶作为催化剂，（R，S)-环氧氯丙烷为 底物，进行转化反应制备(R)-环氧氯丙烷。转化体系组成及转化操作如下：IOmUpH 7.0的 200mM憐酸盐缓冲液中加入0.8g固定化酶、40mmol/L缓冲液的(R，S)-环氧氯丙烷和SOmmol/ L缓冲液的化N02，35°C水浴摇床18化pm条件下反应30min，用两倍体积的乙酸乙醋萃取，萃 取两次，合并萃取液，用气相色谱分析测定底物收率和ee值。（R)-环氧氯丙烷的收率为 26.4%，ee值大于99%。
[0100] 在填充床（内径1.0畑1，高20(：111，外带水浴夹套;精密恒流蠕动累81300-21:保定兰 格恒流累有限公司）中测定固定化重组面醇脱面酶的操作稳定性。填充床条件为:高径比为 15:1，添加 IOg的固定化酶，W (R，S)-环氧氯丙烷为底物，底物溶液流速为6mL/min，底物溶 液为lOOmL、抑= 7.0的200mM憐酸盐缓冲液，其底物溶液中底物浓度为40mM，并再添加50mM 的化N02。填充床和流入填充床的底物溶液控制溫度为35°C。选择40min作为一个反应批次， 每批反应后用蒸馈水冲洗5min。连续反应40批次后，环氧氯丙烷的相对收率(相对于第一 批)仍然保持在90% W上。
[0101] 对比例5重组面醇脱面酶催化环氧氯丙烷的拆分合成(R)-环氧氯丙烷
[0102] 按实施例1方法制备的固定化重组面醇脱面酶菌体作为催化剂，（R，S)-环氧氯丙 烧为底物，进行转化反应制备（R)-环氧氯丙烷。转化体系组成及转化操作如下= IOmUpH 7.0的200mM憐酸盐缓冲液中加入0.2g面醇脱面酶湿菌体、40mmo 1/L缓冲液的(R，S)-环氧氯 丙烷和50mmol/L缓冲液的化N02,35°C水浴摇床18化pm条件下反应20min，用两倍体积的乙 酸乙醋萃取，萃取两次，合并萃取液，用气相色谱分析测定底物收率和ee值。（R)-环氧氯丙 烧的收率为39.5 %，ee值大于99%。W上述过程作为一个反应批次，每批反应后将反应液离 屯、，转速为9000化pm，时间lOmin。倒出上清液，将底部菌体作为下一批的催化剂，重复上述 反应过程。连续反应10批次后，（R)-环氧氯丙烷的相对收率(相对于第一批)低于50%。
[0103] 实施例10固定化重组面醇脱面酶催化2,3-二氯-1-丙醇的拆分合成(S)-2,3-二 氯-1-丙醇
[0104] 按实施例4方法制备的固定化重组面醇脱面酶作为催化剂，（R，S)-2,3-二氯-1-丙 醇为底物，进行转化反应制备(S)-2,3-二氯-1-丙醇。转化体系组成及转化操作如下：10mL、 pH 8.0的200mM憐酸盐缓冲液中加入0.Sg固定化酶、30mmol/L缓冲液的(R，S)-2，3-二氯-1-丙醇，35°C水浴摇床18化pm条件下反应lOh，用等体积乙酸乙醋进行萃取，萃取两次，合并萃 取液，用气相色谱分析测定底物收率和ee值。（S)-2,3-二氯-1-丙醇的收率为38.6%，ee值 大于99%。
[0105] 在填充床（内径1.0cm，高20cm，外带水浴夹套;精密恒流蠕动累BT300-2J:保定兰 格恒流累有限公司）中测定固定化重组面醇脱面酶的操作稳定性。填充床条件为:高径比为 15:1，添加 IOg的固定化酶，W (R，S)-2，3-二氯-1-丙醇为底物，底物溶液流速为2mL/min，底 物溶液为1 OOmL、抑=8.0的200mM憐酸盐缓冲液，其底物溶液中底物浓度为30mM。填充床和 流入填充床的底物溶液控制溫度为35°C。选择IOh作为一个反应批次，每批反应后用蒸馈水 冲洗5min。连续反应22批次后，环氧氯丙烷的相对收率(相对于第一批)仍然保持在80 %左 -?" O
[0106] 对比例6重组面醇脱面酶催化2,3-二氯-1-丙醇的拆分合成(S)-2,3-二氯-1-丙醇
[0107] 按实施例1方法制备的固定化重组面醇脱面酶菌体作为催化剂，（R，S)-2,3-二氯-1-丙醇为底物，进行转化反应制备(S)-2,3-二氯-1-丙醇。转化体系组成及转化操作如下： IOmUpH 8.0的200mM憐酸盐缓冲液中加入0.5g面醇脱面酶湿菌体、30mmol/L缓冲液的（R, S)-2,3-二氯-1-丙醇，35°C水浴摇床18化pm条件下反应化，用等体积乙酸乙醋进行萃取，萃 取两次，合并萃取液，用气相色谱分析测定底物收率和ee值。（S)-2,3-二氯-1-丙醇的收率 为43.6 %，ee值大于99 %。W上述过程作为一个反应批次，每批反应后将反应液离屯、，转速 为9000化pm，时间lOmin。倒出上清液，将底部菌体作为下一批的催化剂，重复上述反应过 程。连续反应10批次后，（S)-2,3-二氯-1-丙醇的相对收率(相对于第一批)低于50%。
[0108] 本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可W在权利要求书所概述的范围内 根据本发明的精神做各种改变。运些改变均在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种固定化重组卤醇脱卤酶，其特征在于所述酶按如下方法制备： (1) 将含重组卤醇脱卤酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的发酵液离心， 去除上清液，将菌体沉淀用pH= 7.0、O. IM的磷酸钠缓冲液悬浮后进行破碎、离心，取破碎上 清液;所述重组卤醇脱卤酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示； (2) 取步骤（1)中的破碎上清液为酶源，向酶源中加入pH = 7.0、0 . IM的磷酸钠缓冲液， 混匀，形成待固定酶液，将待固定酶液与载体混合，在25°C下搅拌5h-20h，取出载体用蒸馏 水冲洗后，放入pH值8.5、0.1 M的磷酸钠缓冲液中，再加入甘油，25-30 °C下保温1-3天，获得 保温后的载体;所述酶源的含酶量以破碎前湿菌体重量计为〇.lg/ml，所述待固定酶液中酶 源的体积终浓度为〇 . 1 %~8 % ;所述载体质量以待固定酶液中缓冲液的体积用量计为 0.01-lg/ml;所述甘油体积终浓度为20% ;所述载体为环氧树脂； (3) 将步骤(2)保温后的载体浸入pH = 8 · 5，1 · 0-3 · OM的甘氨酸水溶液中，25 °C保温24h， 最后再用蒸馏水冲洗，得到固定化重组卤醇脱卤酶。2. 如权利要求1所述固定化重组齒醇脱齒酶，其特征在于所述载体为环氧树脂 Eupc丨·git_?·C、.环氧树脂SpebeadsEC-EP、环氧树脂LX-1000EP、环氧树脂ES-l、环氧树脂ES-105或环氧树脂ES-103B。3. 如权利要求1所述固定化重组卤醇脱卤酶，其特征在于所述重组基因工程菌构建方 法为：将SEQ ID NO. 1所示重组卤醇脱卤酶基因HHDH与PGEM-T载体连接后导入E.coli JM109中，提取连接质粒并与质粒pET28b( + )-Nit进行双酶切后，连接过夜，将连接产物导入 宿主E. Co I i BL21 (DE3)中，获得重组大肠杆菌E. Co I i BL21 (DE3) /pET28b (+) -HHDH。4. 如权利要求1所述固定化重组卤醇脱卤酶，其特征在于所述酶源按如下步骤获得： (1) 斜面培养:将含重组卤醇脱卤酶编码基因的基因工程菌接种至含终浓度50μg/ml卡 那霉素的斜面培养基，37 °C培养12h，获得斜面菌体;斜面培养基终浓度组成为:蛋白胨IOg/ L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，pH自然，溶剂为水； (2) 种子培养:挑取斜面菌种接入含终浓度50μg/ml的卡那霉素的种子培养基，装液量 为50mL，37 °C、150rpm培养8-10小时，获得种子液;种子培养基终浓度组成为:蛋白胨10g/L， 酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH自然，溶剂为水； (3) 发酵培养:按体积浓度2 %的接种量，将种子液接入装有IOOmL含终浓度50μg/ml的 卡那霉素的发酵培养基的500mL三角瓶中，37°C、150rpm培养2h，然后加入10g/L乳糖诱导 剂，28 °C，150rpm条件下诱导12h，将发酵液离心，收集菌体沉淀，将菌体沉淀用pH= 7.0、 0.1 M的磷酸钠缓冲液悬浮后进行破碎、离心，然后取破碎上清液，即获得酶源;发酵培养基 终浓度组成为:蛋白胨I〇g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH自然，溶剂为水。5. -种权利要求1所述固定化重组卤醇脱卤酶在制备环氧化物中的应用，其特征在于 所述的应用为：以固定化重组卤醇脱卤酶为催化剂，以卤代醇为底物，在pH值为8.0-10.0硼 砂-硼酸缓冲液中，于30_40°C、ISOrpm条件下反应完全后，获得含环氧化物混合液，将混合 液分离纯化，获得所述环氧化物;所述底物终浓度为10-50mmol/L缓冲液，所述催化剂的添 加终浓度为l〇-l〇〇g/L缓冲液。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于所述底物为1，3-二氯-2-丙醇、1，3-二溴-2-丙 醇、2-氯-1-苯乙醇或2，3-二溴-1-丙醇。7. -种权利要求1所述固定化重组卤醇脱卤酶在制备手性环氧化物中的应用，其特征 在于所述的应用为：以固定化重组卤醇脱卤酶为催化剂，以卤代醇为底物，在pH值为8-10甘 氨酸-NaOH缓冲液中，于35°C、ISOrpm条件下反应完全后，获得含手性环氧化物的混合液，将 混合液分离纯化，获得所述手性环氧化物;所述底物浓度为10-50mmol/L缓冲液，所述催化 剂的添加终浓度为50-100g/L缓冲液;所述底物为1，3-二氯-2-丙醇、1，3-二溴-2-丙醇、2-氯-1-苯乙醇或2，3-二溴-1-丙醇。8. -种权利要求1所述固定化重组卤醇脱卤酶在催化卤代羟基丁酸乙酯脱卤中的应 用，其特征在于所述的应用为：以固定化重组卤醇脱卤酶为催化剂，以卤代羟基丁酸乙酯为 底物，在pH值为7-10的缓冲液中，于35°C、180rpm条件下反应完全后，获得含(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的混合液，将混合液分离纯化，获得所述(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯；所述 卤代羟基丁酸乙酯为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，所述底物终浓度为100-400g/L缓冲液，所 述催化剂的添加终浓度为50-120g/L缓冲液。9. 一种权利要求1所述固定化重组卤醇脱卤酶在拆分环氧化物制备手性环氧化物中的 应用，其特征在于所述的应用为：以固定化重组卤醇脱卤酶为催化剂，以环氧化物为底物， 加入亲核试剂，在pH值为4.0-7.0的缓冲液中，于35°C、180rpm条件下反应完全后，获得含手 性环氧化物的混合液，将混合液分离纯化，获得所述手性环氧化物;所述环氧化物为苯基环 氧乙烷或环氧氯丙烷，所述底物终浓度为lO-lOOmmol/L缓冲液，所述亲核试剂为NaN 3, NaNO2 或NaCN，所述亲核试剂的加入量为20-200mmol/L缓冲液，所述催化剂的添加终浓度为50-l〇〇g/L缓冲液。10. -种权利要求1所述固定化重组卤醇脱卤酶在拆分2,3_二氯-1-丙醇制备(S)-2,3-二氯-1-丙醇中的应用，其特征在于所述的应用为：以固定化重组卤醇脱卤酶为催化剂，以 2，3-二氯-1-丙醇为底物，在pH值为8.0-9.0、200mM磷酸盐缓冲液中，于35 °C、180rpm条件下 反应完全后，获得含(S)-2,3-二氯-1-丙醇的混合液，将混合液分离纯化，获得所述(S)-2， 3-二氯-1-丙醇;所述底物终浓度为10-40mmol/L缓冲液，所述催化剂的添加终浓度为50-l〇〇g/L缓冲液。
【文档编号】C12N9/88GK105838700SQ201610177359
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月25日
【发明人】郑裕国, 邹树平, 顾恺, 薛亚平
【申请人】浙江工业大学