一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的发酵方法
【专利摘要】本发明提供一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的发酵方法，通过斜面孢子的制备与保藏、摇瓶二级扩大培养、种子罐放大培养、发酵罐发酵得到。所用的海洋黑曲霉，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2010132，菌种名称为Aspergillus sp. ZJUBE 2010。通过本发明方法获得的耐盐纤维素酶，能广泛用于工业高盐环境，也为富含盐的纤维素资源提供一种新的利用途径。本发明方法所用培养基价廉，成本低，培养过程简单，易于控制与改进，调控生长阶段与产酶阶段的不同温度，使得纤维素酶活更高。本发明方法为耐盐纤维素酶的工厂化生产以及应用提供依据和基础。CCTCC NO：M201013220100602
【专利说明】
一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的发酵方法
技术领域
[0001]本发明属于海洋生物领域，涉及一种利用海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的发酵方法，通过温度分段式中试液体发酵完成。
【背景技术】
[0002]纤维素酶是由外切酶、内切酶和纤维二糖酶等三种酶组成的复合酶，它们通过一种协同作用使纤维素依次降解成纤维二糖和葡萄糖。因此纤维素酶用途极大，在纺织行业中能去除纺织物表面绒毛;在食品行业中的制酒、酱油酿造以及食品加工等方面有着重要的作用。而且在新能源以及环保方面也有着比较光明的前景。
[0003]但是随着工业的发展，普通纤维素酶越来越无法满足工业生产中的一些抗逆性需求，譬如，造纸厂黑液废水不仅纤维素含量高而且盐度高，普通纤维素酶无法适用于高盐度条件下。而由于海洋独特的环境，存在着多种耐受极端条件如耐高温、耐高盐、耐极端PH的菌种，这就为解决工业化生产中存在着高盐度、高温、极端PH环境而使纤维素酶活性降低乃至失活的问题提供一条新的思路以及途径。王玢等从黄海泥样中筛选出的海洋细菌所产生的酶的最适反应温度为35°C，明显低于普通纤维素酶的最适反应温度，而且其在10°C左右也含有较高的活性。Trivedi等从海藻中分离出的杆菌所产生的纤维素酶，既能在碱性环境也能在高盐度环境下保持高活性。综上所述，研究耐极端条件的纤维素酶产生菌有着极大的研究和应用价值。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的发酵方法，通过以下步骤实现:
(1)斜面孢子的制备与保藏:将海洋黑曲霉接种到PDA斜面培养基，28°C下培养96小时，得到斜面孢子，4°C下保存;所用菌种:由东海近海泥土中筛选得到的海洋黑曲霉，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2010132，保藏日期是2010年6月2日，菌种名称为Aspergillus sp.ZJUBE 2010；
(2)摇瓶二级扩大培养:配制300?400ml摇瓶种子培养基分装到IL锥形瓶中，121°C灭菌20min，利用灭菌的蒸馏水洗脱斜面获得黑曲霉孢子液，接种于摇瓶种子培养基中，接种量为5~7%，并于35?38°C，180?200r/min条件下培养24?36小时获得二级扩大种子液；
(3)种子罐放大培养:于50L种子发酵罐中配制35 L种子罐培养基，121°C灭菌20min，取摇瓶扩大的种子液接种到种子罐中，接种量为3~5%，发酵罐温度为35?38°C，通气比为IV/V.min，罐压为0.02?0.1 Mpa，转速180r/min，发酵48小时后获得种子罐放大种子液；
(4)500L发酵罐发酵:于500 L发酵罐中配制350 L发酵培养基，121°C灭菌20min，将种子罐的种子液接种到种子罐中，接种量为10%，消泡剂0.03%，通气比为0.5?2.5 V/V.min，罐压为0.02-0.1 Mpa，转速180r/min，温度36?40°C条件发酵36?60小时后，调节温度为26?30°C，继续发酵36?60小时后得到纤维素酶粗酶液，即为耐盐纤维素酶。
[0005]所述的TOA培养基组成为:200马铃薯经IL水煮沸20min后6层纱布过滤后的I L滤液，20g葡萄糖，pH自然。
[0006]所述的摇瓶种子培养基组成为:葡萄糖1%，玉米浆0.25%，氯化钠2%，磷酸二氢钾
0.3%，氯化钙0.03%，硫酸镁0.08%，硫酸亚铁0.005%，硫酸锰0.0016%，硫酸锌0.0014%，氯化钴0.0037%，Tween 80 0.2%o
[0007]所述的种子罐培养基组成为:麸皮5%，玉米浆1%，氯化钠2%，磷酸二氢钾0.3%，氯化钙0.03%，硫酸镁0.08%，硫酸亚铁0.005%，硫酸锰0.0016%，硫酸锌0.0014%，氯化钴0.0037%，Tween 80 0.2%。
[0008]所述的发酵培养基组成为:麸皮5%，玉米浆1%，氯化钠2%，磷酸二氢钾0.3%，氯化钙
0.03%，硫酸镁0.08%，硫酸亚铁0.005%，硫酸锰0.0016%，硫酸锌0.0014%，氯化钴0.0037%，Tween 80 0.2%。
[0009]以上培养基中％均为质量体积比。
[0010]本发明所采用是菌株是一种海洋黑曲霉，它能生产耐盐的纤维素酶，广泛用于高盐度的工业生产环境中。但是，对耐极端条件的纤维素酶的工业化生产及应用相关研究与资料并不多，因此，如何规模化生产及应用耐盐纤维素酶是一项迫切且有价值的工作。本发明所用的海洋黑曲霉能产生耐盐纤维素酶，能广泛用于工业高盐环境，也为富含盐的纤维素资源提供一种新的利用途径;方法所用培养基价廉，成本不高；本发明方法培养过程简单，易于控制与改进;调控生长阶段与产酶阶段的不同温度，使得纤维素酶活更高。本发明方法为耐盐纤维素酶的工厂化生产以及应用提供依据和基础。
【附图说明】
[0011]图1是实施例1黑曲霉生物量干重曲线。
[0012]图2是实施例2黑曲霉生物量干重曲线。
[0013]图3是实施例3黑曲霉生物量干重曲线。
[0014]图4的实施例4黑曲霉生物量干重曲线。
[0015]图5是实施例5黑曲霉生物量干重曲线。
【具体实施方式】
[0016]
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0017]以下实施例所采用的培养基与方法如下，所有培养基中％均为质量体积比。
[0018]所述的roA培养基组成为:200马铃薯经IL水煮沸20min后6层纱布过滤后的I L滤液，20g葡萄糖，pH自然。
[0019]所述的摇瓶种子培养基组成为:葡萄糖1%，玉米浆0.25%，氯化钠2%，磷酸二氢钾
0.3%，氯化钙0.03%，硫酸镁0.08%，硫酸亚铁0.005%，硫酸锰0.0016%，硫酸锌0.0014%，氯化钴0.0037%，Tween 80 0.2%o
[0020]所述的种子罐培养基组成为:麸皮5%，玉米浆1%，氯化钠2%，磷酸二氢钾0.3%，氯化钙0.03%，硫酸镁0.08%，硫酸亚铁0.005%，硫酸锰0.0016%，硫酸锌0.0014%，氯化钴0.0037%，Tween 80 0.2%o[0021 ]所述的发酵培养基组成为:麸皮5%，玉米浆1%，氯化钠2%，磷酸二氢钾0.3%，氯化钙
0.03%，硫酸镁0.08%，硫酸亚铁0.005%，硫酸锰0.0016%，硫酸锌0.0014%，氯化钴0.0037%，Tween 80 0.2%。
[0022]发酵罐参数测定:500L全自动气升式发酵罐装液量为350 L，以摇瓶试验得出的最佳液体培养基配方作为发酵培养基，在经过一系列灭菌后，将种子罐中的种子液接入到发酵罐中，调节发酵罐温度、通气比、搅拌转速、pH等各个参数后通入无菌空气开始控制发酵培养。
[0023]滤纸酶活的测定:取0.5 mL适当稀释的发酵液(对照样要先煮沸灭活)，加入到2.0mL pH 4.8梓檬酸钠-梓檬酸缓冲液中，加入约50 mg Whatman滤纸片(60 mmX 10 mm) ,50°C保温30 min，之后加入2.5 mLDNS试剂终止反应并沸水浴处理5 min，冷却后于540 nm波长比色。最后根据标准曲线(y= 0.5839x + 0.1687,R2 = 0.9999，式中1为光密度(六54—)，7为葡萄糖浓度)计算样品中的葡萄糖产生量，并利用公式(U=(0.5839x+ 0.1687)*1000/180/30)得到纤维素酶活。纤维素酶活力单位定义为每分钟水解生成I M1l葡萄糖的酶量为I个酶活力单位。
[0024]实施例1
斜面孢子的制备与保藏:海洋黑曲霉接种到roA斜面培养基，28°C下培养96小时，得到斜面孢子，4°C下保存。
[0025]摇瓶二级扩大培养:配制300ml摇瓶种子培养基分装到IL锥形瓶中，121°C灭菌20min，利用灭菌的蒸馏水洗脱斜面获得黑曲霉孢子液，接种于摇瓶种子培养基中，接种量为5%，并于35°C，180r/min条件下培养24小时获得二级扩大种子液。
[0026]种子罐放大培养:于50 L种子发酵罐中配制35 L种子罐培养基，121°C灭菌20min，取摇瓶扩大的种子液接种到种子罐中，接种量为3%，发酵罐温度为35°C，通气比为I V/V.min，罐压为0.02Mpa，转速180r/min，发酵48小时后获得种子罐放大种子液。
[0027]500 L发酵罐发酵:于500 L发酵罐中配制350 L发酵培养基，121°C灭菌20min，将种子罐的种子液接种到种子罐中，接种量为10%，消泡剂0.03%，通气比为1.5 V/V.min，罐压为0.02Mpa，转速180r/min，温度36°C等条件发酵96小时后，调节温度为28°C，继续发酵48小时后得到纤维素酶粗酶液，测定其滤纸酶活为0.76 U/ml，干重曲线结果见图1，在96小时达到最高值。
[0028]实施例2
斜面孢子的制备与保藏:海洋黑曲霉接种到roA斜面培养基，28°C下培养96小时，得到斜面孢子，4°C下保存。
[0029]摇瓶二级扩大培养:配制300ml摇瓶种子培养基分装到IL锥形瓶中，121°C灭菌20min，利用灭菌的蒸馏水洗脱斜面获得黑曲霉孢子液，接种于摇瓶种子培养基中，接种量为7%，并于38°C，200r/min条件下培养36小时获得二级扩大种子液。
[0030]种子罐放大培养:于50 L种子发酵罐中配制35 L种子罐培养基，121°C灭菌20min，取摇瓶扩大的种子液接种到种子罐中，接种量为5%，发酵罐温度为38°C，通气比为I V/V.min，罐压为0.1 Mpa，转速180r/min，发酵48小时后获得种子罐放大种子液。
[0031]500 L发酵罐发酵:于500 L发酵罐中配制350 L发酵培养基，121°C灭菌20min，将种子罐的种子液接种到种子罐中，接种量为10%，消泡剂0.03%，通气比为1.5 V/V.min，罐压为0.1 Mpa，转速180r/min，温度38°C条件发酵84小时后，调节温度为30°C，继续发酵60小时后得到纤维素酶粗酶液，测定其滤纸酶活为0.85 U/ml，干重曲线结果见图2，，在96小时达到最高值。
[0032]实施例3
斜面孢子的制备与保藏:海洋黑曲霉接种到roA斜面培养基，28°C下培养96小时，得到斜面孢子，4°C下保存。
[0033]摇瓶二级扩大培养:配制300ml摇瓶种子培养基分装到IL锥形瓶中，121°C灭菌20min，利用灭菌的蒸馏水洗脱斜面获得黑曲霉孢子液，接种于摇瓶种子培养基中，接种量为6%，并于35°C，180r/min条件下培养36小时获得二级扩大种子液。
[0034]种子罐放大培养:于50 L种子发酵罐中配制35 L种子罐培养基，121°C灭菌20min，取摇瓶扩大的种子液接种到种子罐中，接种量为5%，发酵罐温度为36°C，通气比为I V/V.min，罐压为0.06 Mpa，转速180r/min，发酵48小时后获得种子罐放大种子液。
[0035]500 L发酵罐发酵:于500 L发酵罐中配制350 L发酵培养基，121°C灭菌20min，将种子罐的种子液接种到种子罐中，接种量为10%，消泡剂0.03%，通气比为1.5 V/V.min，罐压为0.07Mpa，转速180r/min，温度38°C条件发酵72小时后，调节温度为28°C，继续发酵72小时后得到纤维素酶粗酶液，测定其滤纸酶活为0.89 U/ml，干重曲线结果见图3，，在84小时达到最高值。
[0036]实施例4
斜面孢子的制备与保藏:海洋黑曲霉接种到roA斜面培养基，28°C下培养96小时，得到斜面孢子，4°C下保存。
[0037]摇瓶二级扩大培养:配制400ml摇瓶种子培养基分装到IL锥形瓶中，121°C灭菌20min，利用灭菌的蒸馏水洗脱斜面获得黑曲霉孢子液，接种于摇瓶种子培养基中，接种量为5%，并于35?38°C，180?200r/min条件下培养24?36小时获得二级扩大种子液。
[0038]种子罐放大培养:于50 L种子发酵罐中配制35 L种子罐培养基，121°C灭菌20min，取摇瓶扩大的种子液接种到种子罐中，接种量为5%，发酵罐温度为38°C，通气比为I V/V.min，罐压为0.07 Mpa，转速180r/min，发酵48小时后获得种子罐放大种子液。
[0039]500 L发酵罐发酵:于500 L发酵罐中配制350 L发酵培养基，121°C灭菌20min，将种子罐的种子液接种到种子罐中，接种量为10%，消泡剂0.03%，通气比为1.5 V/V.min，罐压为0.07Mpa，转速180r/min，温度38°C条件发酵60小时后，调节温度为28°C，继续发酵84小时后得到纤维素酶粗酶液，测定其滤纸酶活为0.88 U/ml，干重曲线结果见图4，，在96小时达到最高值。
[0040]实施例5
斜面孢子的制备与保藏:海洋黑曲霉接种到roA斜面培养基，28°C下培养96小时，得到斜面孢子，4°C下保存。
[0041 ]摇瓶二级扩大培养:配制400ml摇瓶种子培养基分装到I L锥形瓶中，121°C灭菌20min，利用灭菌的蒸馏水洗脱斜面获得黑曲霉孢子液，接种于摇瓶种子培养基中，接种量为5%，并于35°C，180?200r/min条件下培养24?36小时获得二级扩大种子液。
[0042]种子罐放大培养:于50 L种子发酵罐中配制35 L种子罐培养基，121°C灭菌20min，取摇瓶扩大的种子液接种到种子罐中，接种量为3%，发酵罐温度为37°C，通气比为I V/V.min，罐压为0.02~0.1 Mpa，转速180r/min，发酵48小时后获得种子罐放大种子液。
[0043]500 L发酵罐发酵:于500 L发酵罐中配制350 L发酵培养基，121°C灭菌20min，将种子罐的种子液接种到种子罐中，接种量为10%，消泡剂0.03%，通气比为2.5 V/V.min，罐压为0.09Mpa，转速180r/min，温度38°C条件分别发酵48小时后，调节温度为28°C，继续发酵96小时后得到纤维素酶粗酶液，测定其滤纸酶活为0.90 U/ml，干重曲线结果见图5，在108小时达到最高值。
【主权项】
1.一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的发酵方法，其特征在于，通过以下步骤实现: (1)斜面孢子的制备与保藏:将外购的海洋黑曲霉接种到PDA斜面培养基，28°C下培养96小时，得到斜面孢子，4 °C下保存； (2)摇瓶二级扩大培养:配制300?400ml摇瓶种子培养基分装到锥形瓶中，121°C灭菌，利用灭菌的蒸馏水洗脱斜面获得黑曲霉孢子液，接种于摇瓶种子培养基中，并于35?38°C，180?200r/min条件下培养24?36小时获得二级扩大种子液； (3)种子罐放大培养:在种子发酵罐中配制35L种子罐培养基，121°C灭菌，取摇瓶扩大的种子液接种到种子罐中，发酵罐温度为35?38°C，通气比为I V/V.min，罐压为0.02?0.1Mpa，转速180r/min，发酵48小时后获得种子罐放大种子液； (4)500L发酵罐发酵:在发酵罐中配制350 L发酵培养基，121°C灭菌，将种子罐的种子液接种到种子罐中，消泡剂0.03%，通气比为0.5?2.5 V/V.min，罐压为0.02?0.1 Mpa，转速180r/min，温度36?40°C条件发酵36?60小时后，调节温度为26?30°C，继续发酵36?60小时后得到纤维素酶粗酶液，即为所述耐盐纤维素酶。2.根据权利要求1所述的一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的发酵方法，其特征在于，步骤(I)所述的PDA培养基组成为:200马铃薯经I L水煮沸20min后6层纱布过滤后的I L滤液，20g葡萄糖，pH自然。3.根据权利要求1所述的一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的发酵方法，其特征在于，步骤(2)所述的摇瓶种子培养基组成为:葡萄糖1%，玉米浆0.25%，氯化钠2%，磷酸二氢钾0.3%，氯化钙0.03%，硫酸镁0.08%，硫酸亚铁0.005%，硫酸锰0.0016%，硫酸锌0.0014%，氯化钴0.0037%，Tween 80 0.2%o4.根据权利要求1所述的一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的发酵方法，其特征在于，步骤(3)所述的种子罐培养基组成为:麸皮5%，玉米浆1%，氯化钠2%，磷酸二氢钾0.3%，氯化钙0.03%，硫酸镁0.08%，硫酸亚铁0.005%，硫酸锰0.0016%，硫酸锌0.0014%，氯化钴0.0037%，Tween 80 0.2%o5.根据权利要求1所述的一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的发酵方法，其特征在于，步骤(4)所述的发酵培养基组成为:麸皮5%，玉米浆1%，氯化钠2%，磷酸二氢钾0.3%，氯化钙0.03%，硫酸镁0.08%，硫酸亚铁0.005%，硫酸锰0.0016%，硫酸锌0.0014%，氯化钴0.0037%，Tween 80 0.2%。6.根据权利要求1所述的一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的发酵方法，其特征在于，步骤(I)所用的海洋黑曲霉，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC N0:M2010132，保藏日期是2010年6月2日，菌种名称为Aspergillussp.ZJUBE 2010。
【文档编号】C12N9/42GK105838697SQ201610279104
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月3日
【发明人】郑刚, 陈作国, 陈逸文, 曲丽丽, 杨志坚, 薛栋升, 姚善泾
【申请人】浙江大学舟山海洋研究中心