一种融合标签蛋白的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种融合标签蛋白，本发明的融合标签蛋白bff基于耐有机糖苷酶Fru6构建，为截断至耐有机糖苷酶Fru6N端前n个氨基酸截短体，所述n＜452。本发明还提供了基于本发明的融合标签蛋白构建的融合蛋白表达系统，并选择bff312，bff209，bff217，bff243，bff350作为本发明优选的融合标签蛋白，构建融合蛋白表达系统，验证本发明融合标签蛋白的效果。本发明通过融合标签的连接能有效提高后接蛋白的表达及蛋白折叠，有效提高可溶性蛋白量。
【专利说明】
一种融合标签蛋白
技术领域
[0001]本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及基于耐有机糖苷酶Fru6的新型的融合 标签蛋白，以及基于该融合标签的新型融合蛋白表达系统。
【背景技术】
[0002] 大肠杆菌因其背景清晰、生长快速、表达量大，易于操作等特点仍为最常用的宿 主，但是它也具有很多局限性，例如：一些异源蛋白在大肠杆菌体内表达时表达量很低，一 些蛋白表达后易于降解，或者表达的外源蛋白对宿主细胞具有毒性，导致细菌生长停滞或 死亡。或者因未能正确折叠而聚合在一起产生大量包涵体。事实上，大规模生产性状确切的 活性蛋白仍是重组蛋白技术中的瓶颈问题。重组蛋白质异源表达中有超过半数以上是以包 涵体形式存在的。对包涵体进行体外复性实验使其重新折叠的方法不仅复杂，而且难以保 证变复性后蛋白结构与正常生理状态下一致。
[0003] 融合标签的兴起为重组蛋白的生产带来了福音，融合标签技术在提高蛋白质的可 溶性表达中得到广泛应用。
[0004] 融合标签能增加重组蛋白表达量或在蛋白质折叠过程起作用，增强重组蛋白质的 可溶性表达，常被用作标签蛋白与目的蛋白融合在一起表达。此类标签蛋白被称为SETs (Solubility-Enhancing Tags)，这类蛋白主要有谷胱甘肽S-转移酶(GST)，麦芽糖结合蛋 白（MBP)，硫氧还蛋白A(TrxA)，转录终止抗终止因子(NusA)，蛋白二硫键折叠异构酶(DsbA) 等。但此类标签蛋白究竟如何帮助目的蛋白的表达和折叠，机理尚不明确，且这些SETs不能 帮助所有的蛋白质表达和折叠。不同蛋白和融合标签的匹配性不同，对于某种难以表达的 蛋白，我们可能需要尝试使用不同的SETs以找到合适的表达条件。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种融合标签蛋白bff以及基于此标签蛋白所构建的融合蛋 白表达系统。
[0006] 本发明所提供的融合签蛋白bff以耐有机糖苷酶Fru6为基础构建，耐有机糖苷酶 Fru6分子量约为55kDa，来源于耐有机糖苷酶Fru6产生菌Arthrobacter arilaitensis NJEM01(已公开于专利CN102732456B，保藏编号为CCTCC N0:M2012155)，其氨基酸序列如序 列表中SEQ ID No: 1所示，其中包括长度为53个氨基酸的信号肽。信号肽具有强分泌性介导 该酶分泌表达。本发明所述融合标签bff为截断至耐有机糖苷酶Fru6N端前η个氨基酸截短 体。
[0007] 本发明还涉及bff的编码基因，为耐有机糖苷酶Fru6N端η个氨基酸的编码基因，耐 有机糖苷酶Fru6编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示。
[0008] 截短体bff在大肠杆菌中表达时可溶表达量很高而且性质稳定，故可作为一种潜 在的具有增溶作用的标签蛋白。
[0009] 本发明根据修正后 Wilkinson 和 Harrison法（http: //www. biotech, ou. edu/)预测 不同长度的bff截短体可溶性，预测结果如图1所示，预测时要将信号肽去除后再预测，信号 肽去除前长度在452以上个的氨基酸的bff截短体均为不溶，因此上述n〈452。
[0010] 根据预测结果，本发明选择截短体bff209，bff 217，bff243，bff 312，bff350作为本 发明的优选融合标签蛋白，验证本发明的技术效果。所述bff209为n = 209的情形，即为截断 至耐有机糖苷酶Fru6N端前209个氨基酸截短体，其氨基酸序列和核苷酸序列如序列表中 SEQ ID吣：3-4所示。同理沁打217，匕打243沁打312，匕打350分别指11 = 217，11 = 243，11 = 312， η = 350的情形，其氨基酸序列分别对应序列表中SEQ ID No: 5-6、SEQ ID No: 7-8、SEQ ID N〇:9-10、SEQ ID No:ll-12。
[0011] 为进一步方便目的蛋白的表达和纯化，本发明还提供了基于所述融合标签蛋白构 建的融合标签蛋白表达系统。改造表达载体pET-28a，构建含有融合标签的克隆及蛋白表达 质粒载体pET-28a-bff，为后续获得天然N端的目的蛋白，在基因后面加入肠激酶酶切位点 (DDDDK)，在表达融合蛋白后能够切除融合标签。
[0012] 本发明中应用四种药用蛋白来测试新型融合表达系统的效果，所用四种药用蛋白 为衣原体外膜蛋白抗原决定簇rabOmp、血管内皮生长因子(VEGF)与其相应的受体(VEGFR家 族）、社区获得性呼吸窘迫综合征毒素(MPE)蛋白和风疹病毒结构蛋白（Rub)蛋白。
[0013] 衣原体外膜蛋白抗原决定簇对于研究衣原体主要外膜蛋白的抗原表位对于免疫 防御和免疫诊断有重要意义。衣原体外膜蛋白抗原决定簇在大肠杆菌中通常以包涵体的形 式表达，要通过复杂的复性和纯化才能获得。衣原体外膜蛋白抗原决定簇的蛋白序列长为 216个氨基酸，分子量23.8kDa。
[0014] 血管内皮生长因子(VEGF)与其相应的受体(VEGFR家族)是调节血管生成的关键蛋 白，而VEGF/VEGFR信号通路抑制剂(如VEGF/VEGFR的抗体)对治疗病理性血管增生有较好疗 效。本研究中的血管内皮生长因子受体2 (VEGFR-2)是VEGFR家族中一员，蛋白序列长为275 个氨基酸，分子量30.9kDa。
[0015] 社区获得性呼吸窘迫综合征毒素是肺炎衣原体的致病因子，参与肺炎等疾病过 程，能造成宿主细胞空泡化从而导致细胞死亡。社区获得性呼吸窘迫综合征毒素(MPE)蛋白 序列长248个氨基酸，分子量为28. OkDa。
[0016] 风疹病毒抗原的酶联吸附法是目前用来诊断诊断风疹病毒常用方法之一，但是由 于酶联吸附法需要敏感性高、杭原性好的抗原。目前市场上生产的抗原多来源于细胞培养 抗原，但是细胞培养成本高，因此重组风疹病毒抗原在原核生物中的表达有重要的现实意 义。风疹病毒结构蛋白（Rub)蛋白序列长211个氨基酸，分子量为22.2kDa。
[0017] 本发明提供的融合标签蛋白bff312应用于在大肠杆菌中难以表达的水蛭素时，使 其获得了尚效分泌表达，总表达量大幅提尚，其中99%的融合蛋白可溶性表达，60%以上融 合蛋白分泌至培养基中，其中胞外蛋白经肠激酶切除前后，测得水蛭素生物活性分别为 13ATU/mL和21ATU/mL，可见融合截短体bfT312后水蛭素3得以正确折叠而具有生物活性;本 发明提供的融合标签bff312应用于单独以包涵体形式表达的血管内皮生长因子受体 VEGFR-2，实现了高效可溶性表达，可溶性蛋白比例高达93%，可溶性蛋白量是0.86g/L为单 独表达 VEGFR-2 时(0· 08g/L)的 11倍。
[0018] 本发明提供的bff209，bff217，bff243，bff350应用于衣原体外膜蛋白抗原决定簇 以13〇1]^，可溶性以13〇1]^蛋白总量均增加，优选的，融合标签匕€€209后可溶性蛋白比例达 81%，可溶性蛋白量为0.72g/L，比单独表达提高了6倍。相比较而言，融合常见的商用融合 标签麦芽糖结合蛋白（MBP)和谷胱甘肽S转移酶(GST)，可溶性融合蛋白比例和可溶性蛋白 量分别是25%，0.20g/L和24%，0.12g/L，融合本发明的中融合标签bff209的可溶性表达量 比其融合MBP和GST的可溶性表达量提高了 3.6倍和6倍。
[0019] 本发明的融合表达系统在表达数种自身难以可溶表达的蛋白如水蛭素3(HV3)，衣 原体外膜蛋白抗原决定簇(rabOmp)，血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)，社区获得性呼吸 窘迫综合征毒素(MPE)，风疹病毒结构蛋白（Rub)等抗原时均获得了很高的表达量，获得了 很好的表达效果。其中实现水蛭素胞外表达。
[0020] 本发明提供的融合标签蛋白bff扩展了融合标签库，为融合标签的选择提供了更 多的可能。
【附图说明】
[0021] 图1是不同长度的bff截短体可溶性预测结果图。
[0022] 图 2是BL21/pET-ff53bff 诱导表达的 SDS-PAGE 图谱。
[0023] 图3是截短体质粒的构建过程示意图。
[0024]图4是基因扩增结果图。
[0025] 图 5是121^^1'^^€513,81^1^^1'^^€430诱导表达的505^^^图谱。
[0026] 图 6 是BL21/pET-bff401，BL21/pET-bff312，BL21/pET-bff200诱导表达的SDS- pAGE图谱。
[0027]图7是重叠 PCR法扩增目的基因步骤图。
[0028] 图8是实施例2构建pET-bff312hv示意图。
[0029]图9a、图％、图9c是实施例2电泳结果图；图中箭头方向为bff截短体融合蛋白的位 置，图注为重组子所包含基因。
[0030] 图9d是实施例2中水蛭素3(HV3)，血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)单独表达以 及融合截短体bff312融合标签时表达情况，和可溶性蛋白质浓度比例图。
[0031] 图10是本发明所述新型融合标签蛋白重组载体pET-28a-bff209，pET-28a- bff217，pET-28a-bff243，pET-28a-bff350 构建示意图。
[0032] 图11是目的基因扩增结果图，Μ为2000bp长的Marker;泳道1-4分别为PCR产物 bff350，bff243，bff217，和bff219。
[0033] 图12是重组子菌落PCR鉴定结果图，Μ为2000bp长的Marker;泳道1-12 为含pET- bff350，pET-bff243，pET-bff 217 和 pET-bff 219 的三个重组子的菌落。
[0034] 图13是目的基因扩增结果图，Μ为2000bp长的Marker;泳道1-3为PCR产物vegfr (制61，乂11〇1);泳道4-5为？0?产物1^6(恥61，乂11〇1);泳道6-8分别为？0?产物抑13〇1^(制61， Xhol)，rabomp(NdeI，BamHI)和rabomp(BamHI，XhoI);泳道9为PCR产物rub(NdeI，XhoI) 〇
[0035] 图14a是rabOmp单独表达及融合蛋白标签bff 209，bff 217，bff 243，bff 350表达结 果对比图。
[0036] 图14b是rabOmp单独表达及融合蛋白标签bff 209，bff 217，bff 243，bff 350表达蛋 白含量可溶性蛋白浓度比例图。
[0037] 图14c是vegfr单独表达及融合蛋白标签bff209，bff 217，bff243，bff350表达结果 对比图。
[0038] 图14d是vegf r单独表达及融合蛋白标签bf f209，bf f 217，bf f243，bf f350表达蛋白 含量可溶性蛋白浓度比例图。
[0039] 图14e是mpe单独表达及融合蛋白标签bf f 209，bf f 217，bf f 243，bf f350表达结果对 比图。
[0040] 图14f是mpe单独表达及融合蛋白标签bf f 209，bf f 217，bf f 243，bf f350表达蛋白含 量可溶性蛋白浓度比例图。
[0041 ] 图14g是rub单独表达及融合蛋白标签bf f 209，bf f 217，bf f 243，bf f350表达结果对 比图。
[0042] 图14h是rub单独表达及融合蛋白标签bf f 209，bf f 217，bf f 243，bf f350表达蛋白含 量可溶性蛋白浓度比例图。
[0043]上述图中，Μ为蛋白Marker;C为发酵液上清，S为细胞裂解液上清，ib为细胞裂解液 沉淀。
【具体实施方式】
[0044] 下面结合附图，通过实施例具体说明本发明提供的新型融合标签蛋白的构建过程 以及新型融合标签表达系统的效果，但不以任何方式限制本发明的范围。
[0045] 实施例中，如实验具体条件未注明，请参照《分子克隆实验指南》（J.萨姆布鲁克 D.W拉塞尔著)所述常规实验，或者仪器、试剂供应商所提供的条件。常规质粒构建所涉及的 PCR、酶切、连接等实验，以及蛋白质表达所涉及的转化，细菌培养、诱导等实验为本领域研 究人员所熟悉，具体实验细节在本发明中不再做详细描述，亦可参照《分子克隆实验指南》。 [0046]实施例1:融合标签bff的偶然发现
[0047] 果糖苷酶Fru6分子量约为55kDa，其野生酶是一种胞外酶，能够高效合成黄酮类化 合物葛根素和芒果苷，并能催化低聚果糖的生成。在生物催化、医药中间体的合成中有着广 泛的应用价值。在研究糖苷酶Fru6表达模序时偶然发现，该酶有高度可溶性以及分泌性并 且性质稳定。将该酶的开放式阅读框(包括自身信号肽)克隆至大肠杆菌中，可实现高效的 胞外分泌表达，信号肽具有强分泌性介导该酶分泌表达，但不影响技术效果。
[0048] 如图2所示为耐有机糖苷酶Fru6重组子BL21/pET-ff53bff诱导表达的SDS-PAGE图 谱，显示出果糖苷酶Fru6的高效折叠能力和胞外分泌能力。
[0049]本发明所提供的新型融合签蛋白bff以耐有机糖苷酶Fru6为基础构建，来源于耐 有机糖苷酶Fru6产生菌Arthrobacter arilaitensis NJEM01(已公开于专利 CN102732456B，保藏编号为CCTCC N0:M2012155)。
[0050]本实施例考察了 bff及其截短体自身折叠及胞外分泌能力，基于原子经济性原则 以及期望获得高效有用的融合标签，随机选取了耐有机糖苷酶Fru6N端截短至513,430， 401，312,200位氨基酸的截短体。以耐有机糖苷酶Fru6基因 pET-ff53bff为模板，以PF，P200R， P312R，P4Q1R，P513R，P43QR为引物扩增，引物序列见表卜1，按照表卜2的PCR反应体系和表1-3的 PCR反应条件扩增片段，得到的PCR产物为bff截短体基因片段bff 513，bff430，bff401， bff312和bff200,如图3,得到两端分别带有Nco I和Xho I酶切位点的bff截短体基因片段。 经纯化后的基因片段bff513，bff430，bff401，bff312，bff200与载体pET-28a用限制性内切 酶Xho I和Nco I进行双酶切，37°C酶切8h。将这些片段通过酶切位点插入pET-28a载体中， 得到表达载体 pET-bff513，pET-bff430，pET-bff401，pET-bff312，pET-bff200。产物使用琼 脂糖凝胶电泳验证，结果如图4,分别在约153%?，129(^?，1203匕？，936匕？和60(^?处有明显 条带。
[0051 ] 表1-1引物序列
[0052]
[0053]
[0054]引物序列如表1-1所示，下划线处为Nco I和Xho I限制性酶切位点。[0055] 表1-2 PCR反应体系
[0056]
[0057]
[0058]
[0059] 经测序验证正确后，提取质粒转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞，得到重组子 BL21/pET-bfT513，BL21/pET-bff430，BL21/pET-bfT401，BL21/pET-bfT312，BL21/pET- bfT200。重组子经诱导表达6小时后进行SDS-PAGE，见图2，BL21/pET-bff513，BL21/pET- bff430，BL21 /pET-bf f 401，BL21 /pET-bf f 312，BL21 /pET-bf f200所表达 bf f 截短体的分子量 分别为 51.3,42.5,39.4,29.5，16.7kDa。
[0060] 图5显示，截短至513个和430个氨基酸时，分泌至培养基中的蛋白很少并且出现部 分包涵体，图6显示，截短至401个和312个氨基酸时胞外表达量增加，而截短至200个氨基酸 时总表达量很少，但仍有分泌。就目前几个截短体而言，截至312个氨基酸(截短体bfT312) 分泌至培养基中量较多，表达量也较高，能够正确折叠，并所表达的蛋白均已可溶形式表 达，甚至实现胞外分泌表达，并且没有不可溶的包涵体存在。
[0061] 鉴于该蛋白及其截短体的高分泌表达量和高度可溶，推测该蛋白截短体能够实现 一些小分子量蛋白的分泌表达和一些通常以包涵体形式表达的药物蛋白可溶性表达。并以 高效胞外分泌性的截短体bfT312为例，作为融合标签进行后续实验研究。
[0062] 实施例2:融合标签bff312融合水蛭素(HV3)和血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2) 质粒构建、表达和活性测定
[0063] 截短体基因 bf f 312可利用重叠 PCR法与HV3/VEGFR-2 (下文用hv/vegf r表述）融合。 设计重叠 PCR 引物 Pf，HVr，HVf，P312HV3R，vegf rR，vegf rF，P3i2vegf rR。融合bf f 312和hv:使用引物 Pf与HVr扩出bf f 312，使用引物HVf与P312HV3R扩出hv，使用引物Pf与P312HV3R扩出bf f 312hv。融合 bff312和 vegfr:使用引物Pf与 vegfrR 扩出bf f 312，使用引物vegfrF 与P3i2vegfrR 扩出 vegf r，使 用引物Pf与 P3i2vegfrR 扩出bff312vegfr，bff312hv 与 1^，匕€€312￥68；1^与￥68；1^之间有30个碱 基序列重叠，反应步骤如图7所示，图中F1为扩增bff312的上游引物Pf，R1为扩增bff312的 下游引物HVr/vegfrR，F2为扩增hv/vegf r的上游引物HVf/vegfrF，R2为扩增hv/vegf r的下游 引物 P312HV3R/P312vegfrR。获得 bff312hv/bff312vegfr 〇
[0064] 图 8 是构建 pET-bff312hv 示意图，pET-bff312vegfr 构建方式与 pET-bff312hv 相 同。其中得到的基因片段bff312hv上，bff312和hv之间设有能特异性识别氨基酸序列的蛋 白酶肠激酶酶切位点（DDDDK)编码基因（bff312vegfr基因片段在bff312和vegfr之间同样 设有DDDDK编码基因 ）。bf f 312hv和bf f 312vegf r与载体pET-28a用限制性内切酶Xho I和Nco I进行双酶切，37°C酶切8h。
[0065] 表2-1重叠 PCR引物
[0066]
[0067] 下划线处为Nco I和Xho I限制性酶切位点。
[0068] 表2-2 Over lap-PCR反应体系
[0069]
[0070] 表2-3 Over-lap PCR扩增条件
[0071]
[0072] 酶切产物切胶回收后连接，16°C连接过夜。转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞， 得到重组子 BL21 /pET-bf f 312hv 和 BL21 /pET-bf f 312 vegfr。
[0073] 将重组子接种至LBK培养基中（含50g/mL卡那霉素），37 °C，200rpm过夜培养，然后 以2%的接种量接种至30mL的LBK培养基中，37°C培养2~3h(0D6000.6~0.9)加 IPTG至终浓 度为ImM，30 °C诱导表达6h。取培养液lmL经过4°C，12000rpm离心1 Omin获得上清为发酵液上 清(C)，去除上清后的菌泥使用生理盐水重悬后进行超声破碎5min，离心得到的上清为可溶 性组分(S)，离心后沉淀使用生理盐水重悬为不溶性组分（ib)。
[0074] 经上述处理，电泳结果如图9a、图9b和图9c所示，根据图9a、图9b的SDS-PAGE图谱 灰度扫描获得可溶性组分比例如图9d所示。
[0075] 水蛭素3 (HV3)蛋白序列长为69个氨基酸，分子量为7.4kDa;融合bf f截短体bf f 312 后分子量为37.2kDa。结果显示，在大肠杆菌中难以表达的水蛭素 HV3融合含信号肽的bff截 短体bff312获得了高效的分泌表达，蛋白总表达量大幅增加，并且99%的融合蛋白以可溶 形式表达，60%以上的融合蛋白分泌在培养基中，不仅获得了高效的可溶性表达(0.8g/L的 可溶性蛋白），而且融合蛋白分泌至培养基，大大简化了蛋白的纯化。
[0076]本发明中将上诉融合标签bff312融合于水蛭素 N端，通过肠激酶切除标签后获得 真实的水蛭素 N端，并且融合表达后的大部分蛋白被分泌至胞外不易被水解。其中胞外蛋白 经肠激酶切除前后，测得水蛭素生物活性分别为13ATU/mL和21ATU/mL，可见融合截短体 bfT312后水蛭素3得以正确折叠而具有生物活性。
[0077]血管内皮生长因子(VEGF)与其相应的受体(VEGFR家族)是调节血管生成的关键蛋 白，而VEGF/VEGFR信号通路抑制剂(如VEGF/VEGFR的抗体)对治疗病理性血管增生有较好疗 效。血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)是VEGFR家族中一员，蛋白序列长275个氨基酸，分子 量为30.9kDa;融合bff截短bff312后分子量为60.4kDa。单独表达时通常以包涵体形式表 达，而融合bff截短体bff312后可溶性蛋白比例高达93%，可溶性蛋白量0.86g//L是单独表 达VEGFR-2可溶性蛋白量(0.08g/L)的11倍。
[0078] 实施例3:新型融合蛋白表达系统的构建以及测试
[0079] 在本实施例中，四种不同的蛋白被用来测试新型融合蛋白表达系统的效果。
[0080] (1)新型融合蛋白表达系统 pET-bff350，pET-bff243，pET-bff217和pET-bff209的 构建。
[0081 ] 图10是本发明所述新型融合标签蛋白重组载体pET-28a-bff209，pET-28a- bff217，pET-28a-bff243，pET-28a-bff350构建示意图。pET-bff350，pET-bff243，pET- bfT217和pET-bff209的构建同实施例1中截短体载体构建方法。其中选择的酶切位点为Nde I和Nco I，并且匕€€350沁€€243 4€€217和匕€€209的反向引物上设有编码00001(的核苷酸序 列，以便以后融合目的蛋白后使用特异性识别DDDDK的肠激酶切除融合标签。以Fru6基因 pET-ff 53bff为模板为模板，用表3-1中引物?卩、？35(*、？2431?、？217[?、？2議分别扩增匕€；1^截短体基 因片段bff350，bff243，bff 217，bff 209，琼脂糖凝胶电泳验证结果如图11所示，分别在约 1065bp，744bp，666bp，和642bp处有明显条带，与各截短体基因长度相符。将基因片段和载 体pET-28a经过双酶切后，连接后获得重组质粒pET-bfT350，pET-bff243，pET-bff 217和pET- bff2090
[0082] 表3-1引物序列表
[0083]
[0084] 将重组质粒pET-bf f 35Q，pET_bf f 243，pET-bf f 217和pET-bf f 209转化至感受态细胞，挑 选得到的重组子使用相应的引物进行菌落PCR，PCR产物使用琼脂糖凝胶电泳验证，结果如 图 12 所示，泳道 1-12 分别为含 pET-bff350，pET-bff 243，pET-bff 217 和 pET-bf f209 的三个重 组子的菌落PCR验证，与各截短体基因长度相符。菌落PCR验证的重组子经测序后表明目的 基因己成功连接于载体。
[0085] (2)目的蛋白衣原体外膜蛋白rabOmp，风疹病毒结构蛋白Rub，社区获得性呼吸窘 迫综合征毒素 Mpe，血管内皮生长因子受体2Vegfr-2的可溶性表达。
[0086] 分别以pET-rabomp，pET-vegf r，pET-mpe，pET-rub为模板，用引物分别扩增基因片 段vegfr(Nde I，Xho I)，mpe(Nde I，Xho I)，rub(Nde I，Xho I)，rabomp(Nde I，Xho I)， rabomp(Nde I，BamH I)和rabomp(BamH I，Xho I)，对应引物序列见表3-1，产物使用琼脂糖 凝胶电泳验证，结果见图13，图中泳道1-3为PCR产物vegfr(NdeI，XhoI);泳道4-5为PCR产物 mpe (Ndel，XhoI);泳道6-8分别为PCR产物rabomp(NdeI，XhoI)，rabomp(NdeI，BamHI)和 rabomp(BamHI，XhoI);泳道9为PCR产物rub(NdeI，XhoI)。分别在约825bp，744bp，633bp， 648bp，648bp，和648bp处有明显条带，与各目的基因长度相符。
[0087] 按照上述方法扩增得到的基因片段rabomp(Nde I，Xho I)，vegfr(Nde I，Xho I)， rub(Nde I，Xho I)，mpe(Nde I，Xho I)。将经纯化后的PCR产物及载体pET-bff350，pET- bff243，pET-bff217和pET-bff209用限制性内切酶Xho I和Nde I，37 °C 酶切8h。
[0088] 酶切产物切胶回收后连接，16°C连接过夜。转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞， 得到重组子 BL21/pET-bff209rabomp，BL21/pET-bff217rabomp，BL21/pET-bff243rabomp， BL21/pET-bff350rabomp,BL21/pET-bff209vegfr,BL21/pET-bff217vegfr,BL21/pET- bff243vegfr,BL21/pET-bff350vegfr,BL21/pET-bff209mpe,BL21/pET-bff217mpe,BL21/ pET-bff243mpe,BL21/pET-bff350mpe,BL21/pET-bff209rub,BL21/pET-bff217rub,BL21/ pET-bff243rub，BL21/pET-bff350rub。
[0089] 经测序验证正确后，将重组子接种于含50g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C， 200rpm过夜培养，然后接种至新鲜的含50g/mL卡那霉素的LB培养基中，接种量为2%，37°C 培养2~3h(0D6000.6~0.9)，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)至终浓度为ImM，30°C诱导表 达6h。取培养液lmL经过4°C，12000rpm离心10min获得上清为发酵液上清(C)，去除上清后的 菌泥使用生理盐水重悬后进行超声破碎5min，离心得到的上清为可溶性组分(S)，离心后沉 淀使用生理盐水重悬为不溶性组分（ib)。
[0090] 利用SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分析各融合蛋白的表达情况，结果如图14a-h所示。融 合bf f截短体bf f209，bf f 217，bf f243，bf f350后，融合蛋白成熟肽分子量分别为41.8，42.6， 45.5,57.5kDa。为探究最佳长度的bff截短体融合标签，将不同长度的bff截短体标签 bff209，bf f 217，bf f243，bf f350 分别融合 rabOmp，vegf r_2，mpe，rub 进行表达，其可溶性表 达量显著增加，不同截短体融合标签应用于1^13〇11^1，￥68；^-2，11^16，1'1113的总结见表3-2。
[0091] 表3-2截短体标签用于蛋白表达总结
[0092]
LUUVJ」 米源tw有机椐甘職Kru6的截妞怀称签对一些通芾以蚀涵怀形瓦衣込的蛍日有 显著的增溶左右，并对一些短肽类蛋白可能具有帮助其分泌至培养基的作用。标签的长度 可能会带来效果的差异，对于不同的目的蛋白，融合标签可能会不同。本发明所述的新型融 合标签蛋白bff对在大肠杆菌中表达异源蛋白及后续纯化有着重要意义。
【主权项】
1. 一种融合标签蛋白，其特征在于，所述融合标签蛋白基于耐有机糖苷酶Fru6构建，为 截断至耐有机糖苷酶Fru6N端前η个氨基酸截短体，所述η <452，所述耐有机糖苷酶Fru6氨 基酸序列如序列表中SEQ ID No: 1所示。2. 根据权利要求1所述融合标签蛋白，其特征在于，所述融合标签蛋白为截断至耐有机 糖苷酶Fru6N端前209个氨基酸截短体，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:4所示。3. 根据权利要求1所述融合标签蛋白，其特征在于，所述融合标签蛋白为截断至耐有机 糖苷酶Fru6N端前217个氨基酸截短体，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:6所示。4. 根据权利要求1所述融合标签蛋白，其特征在于，所述融合标签蛋白为截断至耐有机 糖苷酶Fru6N端前243个氨基酸截短体，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:8所示。5. 根据权利要求1所述融合标签蛋白，其特征在于，所述融合标签蛋白为截断至耐有机 糖苷酶Fru6N端前312个氨基酸截短体，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No: 10所示。6. 根据权利要求1所述融合标签蛋白，其特征在于，所述融合标签蛋白为截断至耐有机 糖苷酶Fru6N端前350个氨基酸截短体，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No: 12所示。7. 如权利要求1-6任一项所述融合标签蛋白的编码基因，以及含有该编码基因的重组 载体，表达盒，转基因细胞系或重组菌。8. 如权利要求1-6任一项所述融合标签蛋白构建的融合蛋白表达系统。
【文档编号】C12N9/24GK105838694SQ201610331686
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】何冰芳, 成骋, 吴珊珊, 吴斌, 崔禄鹏, 储建林
【申请人】南京工业大学