一种烟嘧磺隆降解菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种烟嘧磺隆降解菌及其应用，所述烟嘧磺隆降解菌为假单胞菌Pseudomonas sp，保藏号为CGMCC NO.11523。所述烟嘧磺隆降解菌在受烟嘧磺隆污染土壤的微生物修复中的应用。本发明的烟嘧磺隆降解菌的降解效率较高，不依赖外加碳源的烟嘧磺隆降解菌。CGMCC No.1152320151021
【专利说明】
一种烟嘧磺隆降解菌及其应用
技术领域
[0001]本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种烟嘧磺隆降解菌及其应用。
【背景技术】
[0002]磺酰脲类除草剂是20世纪70年代由美国杜邦公司研发的一类新型除草剂，具有高活性、广谱、低毒等优点，其问世并成功应用标志着除草剂进入超高效时代。烟嘧磺隆是一种适用于玉米田的磺酰脲类除草剂，能够有效防除玉米田大多数一年生禾本科杂草及部分阔叶杂草、莎草科杂草。我国于90年代初期开始引进并推广烟嘧磺隆，商品名玉农乐。经过二十年的发展，其应用范围已遍及全国各地区，成为玉米田杂草防除的首选除草剂。然而，由于长期大规模施用这种长效除草剂，其有效成分在土壤中残留并不断积累，导致田间轮作中各种后茬敏感作物如大豆、小麦、烟草等减产甚至绝收。土壤对烟嘧磺隆的吸附作用较弱，容易导致该除草剂移动至地表水和地下水造成污染。因此，如何有效去除土壤烟嘧磺隆残留已成为当下亟待解决的问题。烟嘧磺隆在自然界中的降解方式主要有三种，分别为光降解、化学水解及微生物降解。光降解发生较为普遍，但反应启动慢，降解效率低;化学水解依赖土壤pH值，在碱性和中性环境下较难发生;而微生物降解能够在各种自然条件下发挥作用，是烟嘧磺隆最为重要的降解方式。目前国内外已报道的烟嘧磺隆降解微生物有曲霉菌、芽孢杆菌、红假单胞菌、沙雷氏菌、黄篮状菌菌属的几株菌株。但是，迄今为止国内外报道的甲醛降解菌仍然存在耐受浓度低，降解速度慢等缺点，限制了其实际应用。现有专利公开的一种高效降解烟嘧磺隆的枯草芽胞杆菌及其应用(申请号:201310557361.1)，需要加入额外的营养物质提供碳源供微生物生长，实际应用中遇到环境营养条件较差的情况难以发挥降解作用。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种烟嘧磺隆降解菌及其应用，旨在解决现有的高效降解烟嘧磺隆的枯草芽胞杆菌需要加入额外的营养物质提供碳源供微生物生长，实际应用中遇到环境营养条件较差的情况难以发挥降解作用的问题。
[0004]本发明是这样实现的，一种烟嘧磺隆降解菌，所述烟嘧磺隆降解菌为假单胞菌Pseudomonas sp0
[0005]本发明的另一目的在于提供一种所述烟嘧磺隆降解菌在受烟嘧磺隆污染土壤的微生物修复中的应用。
[0006]烟啼磺隆降解菌，其特征在于，所述烟啼磺隆降解菌为假单胞菌Pseudomonas sp,保藏号为CGMCC N0.11523。
[0007]进一步，所述烟嘧磺隆降解菌的筛选方法包括:
[0008]步骤一，菌源采自使用烟嘧磺隆的玉米田土壤，采集距表层2-6cm的土壤样品6份；
[0009]步骤二，称取1g土样加入到20ml无菌蒸馏水中，充分打散，静置后取5ml上清液接种于45ml含50mg/L烟嘧磺隆的MSM培养基(成分(g/L)NH3N030.5;K2HP04.3H20 1.0；KH2PO41-O5MgSO4.7H20 0.1；NaCl 0.2； CaCl2.6H2O 0.02,pH 7.0)中，于32°C、150rpm 培养7天;
[0010]步骤三，取培养液5ml转接至新鲜MSM培养基中，烟嘧磺隆浓度提高至100mg/L，同样条件下培养7天，然后取5mL培养液转移至新鲜MSM培养基中，如此反复6次，其中烟嘧磺隆浓度分别为50、100、150、200、250、3001^/1;将含烟嘧磺隆30011^/1的培养液按不同比例梯度稀释，分别涂布于含烟嘧磺隆50mg/L的MSM平板上，32°C培养5天，挑取边缘清晰的菌落，经反复平板划线纯化直到获得单菌落，并分别进行烟嘧磺隆降解能力测试；
[0011]步骤四，确定各菌株降解能力后，以牛肉膏蛋白胨培养基斜面保藏降解性能优良的菌株；
[0012]步骤五，菌株的鉴定。
[0013]进一步，所述菌株的鉴定具体包括:
[0014]第一步，烟嘧磺隆降解菌NSA02的菌落形态特征及生理生化特征:将已充分活化的菌株NSA02接种到LB培养基平板上，生长48h后观察菌落呈圆形，乳白色，较粘稠，表面光滑，中心突起，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》等方法进行鉴定，该菌为革兰氏阴性杆菌，无芽孢，单极生鞭毛，具运动性，专性好氧；
[0015]第二步，菌株NSA02的16s rDNA鉴定:
[0016]序列扩增采用正向引物5-厶6厶61'11^了0^6(:1^6-3’，
[0017]反向引物5 ’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ’，以细菌总DNA为模板，PCR反应程序如下:95°C 变性 51^11，951€308，531€308，721€908，共35个循环；72°(:10111丨11，4°(:保存，将得到的163rRNA序列登录GenBank，进行Blast同源比对并构建进化树。经比对发现，菌株NSA02的16SrRNA基因与假单胞菌属基因序列同源性最高，与Pseudomonas nitroreducens R5-758同源性达98%，结合形态、生理生化指标和16S rRNA基因序列分析，初步鉴定菌株NSA02为假单胞菌Pseudomonas spD
[0018]本发明提供的烟嘧磺隆降解菌及其应用，烟嘧磺隆降解菌的降解效率较高，不依赖外加碳源的烟嘧磺隆降解菌，菌株NSA02在含50mg/kg烟嘧磺隆的土壤中培养96h，烟嘧磺隆降解率达到90.44 %。
【附图说明】
[0019]图1是本发明实施例提供的烟嘧磺隆降解菌筛选流程图。
[0020]图2是本发明实施例提供的菌株NSA02降解不同浓度烟嘧磺隆的示意图。
[0021]图3是本发明实施例提供的菌株NSA02降解土壤中烟嘧磺隆的示意图。
【具体实施方式】
[0022]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0023]下面结合附图对本发明的应用原理作进一步描述。
[0024]本发明的烟嘧磺隆降解菌的菌株分离、筛选、鉴定、降解效率评估。
[0025]本发明的烟嘧磺隆降解菌7天左右能完全降解400mg//L烟嘧磺隆，采用假单胞菌Pseudomonas sp.，不需要添加额外营养物质就能达到这个效率，试验使用基础培养基，只含无机盐离子。
[0026]本发明烟嘧磺隆降解菌，其为采自中江县苍山镇长期使用烟嘧磺隆的玉米田土壤中分离得到的新菌株。该菌株已于2015年10月21日在中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址:北京市朝阳区，中国科学院微生物研究所，邮编:100101)保藏，分类命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)NSA02，保藏号为CGMCC N0.11523。
[0027]本发明烟嘧磺隆降解菌为革兰氏阴性菌，其菌落在LB培养基上呈圆形，乳白色，表面光滑湿润，中心突起。本发明烟嘧磺隆降解菌经16S rDNA序列测序，结果在NCBI数据库中进行同源性比对，菌株与Pseudomonas nitroreducens R5-758亲缘关系最近，同源性达98%以上。菌株的16S rDNA序列如Seq ID NOl所示。
[0028]如图1所示，本发明甲醛降解菌可以通过下述方法筛选得到:
[0029]SlOl:菌源采自中江县苍山镇长期使用烟嘧磺隆的玉米田土壤，采集距表层2-6cm的土壤样品6份；
[0030]S102:称取1g土样加入到20ml无菌蒸馏水中，充分打散，静置后取5ml上清液接种于45ml含50mg/L烟嘧磺隆的MSM培养基(成分(g/L)NH3N030.5;K2HP04.3H20 1.0；KH2PO41-O5MgSO4.7H20 0.1；NaCl 0.2； CaCl2.6H2O 0.02,pH 7.0)中，于32°C、150rpm 培养7天；
[0031]S103:取培养液5ml转接至新鲜MSM培养基中，烟嘧磺隆浓度提高至100mg/L，同样条件下培养7天，然后取5mL培养液转移至新鲜MSM培养基中，如此反复6次，其中烟嘧磺隆浓度分别为50、100、150、200、250、30011^/1;将含烟嘧磺隆3001^/1的培养液按不同比例梯度稀释，分别涂布于含烟嘧磺隆50mg/L的MSM平板上，32°C培养5天。挑取边缘清晰的菌落，经反复平板划线纯化直到获得单菌落，并分别进行烟嘧磺隆降解能力测试；
[0032]S104:确定各菌株降解能力后，以牛肉膏蛋白胨培养基斜面保藏降解性能优良的菌株。
[0033]S105:菌株的鉴定
[0034]I)烟嘧磺隆降解菌NSA02的菌落形态特征及生理生化特征:将已充分活化的菌株NSA02接种到LB培养基平板上，生长48h后观察菌落呈圆形，乳白色，较粘稠，表面光滑，中心突起。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》等方法进行鉴定，该菌为革兰氏阴性杆菌，无芽孢，单极生鞭毛，具运动性，专性好氧。
[0035]2)菌株NSA02的16s rDNA鉴定:序列扩增采用正向引物5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ’，反向引物5 ’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ’，以细菌总DNA为模板，PCR反应程序如下:95°C变性5!!^11，951€308，531€308，721€908，共35个循环;72°(:101^11，4°(:保存。？0?产物测序由深圳华大基因科技服务有限公司完成。将得到的16S rRNA序列登录GenBank，进行Blast同源比对并构建进化树。经比对发现，菌株NSA02的16S rRNA基因与假单胞菌属基因序列同源性最高，与Pseudomonas nitroreducens R5-758同源性达98%。结合形态、生理生化指标和16SrRNA基因序列分析，初步鉴定菌株NSA02为假单胞菌Pseudomonas sp.
[0036]本发明还提供了上述的烟嘧磺隆降解菌用于降解烟嘧磺隆的用途。
[0037]附图2为菌株NSA02降解不同浓度烟嘧磺隆的过程。
[0038]下面结合试验对本发明的应用效果作进一步的说明。
[0039]试验I烟嘧磺隆降解菌NSA02的降解特性
[°04°]将菌种接种于牛肉膏蛋白胨培养基振荡培养18h，取培养液于4000rpm离心lOmin，以0.2M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤2次，配置为菌悬液，以1.0 X 108CFU/mL接种量接种到含烟嘧磺隆50-400mg/L的MSM培养基中，在最适条件下摇瓶培养，连续测定培养液中烟嘧磺隆残留量，其结果如附图所示。菌株NSA02可在48h内完全降解50mg/L烟嘧磺隆，随着烟嘧磺隆浓度提高，完全降解所需时间也不断延长，完全降解100、200、300、400mg/L烟嘧磺隆分别需时60、84、120、144h。
[0041]本发明还提供了上述的烟嘧磺隆降解菌用于烟嘧磺隆污染土壤的微生物修复用途。
[0042]附图3为菌株NSA02降解土壤中烟嘧磺隆的过程。
[0043]下面结合试验对本发明的应用效果作进一步的说明。
[0044]试验2烟嘧磺隆降解菌NSA02对土壤中烟嘧磺隆的降解
[0045]本实验使用的土壤采集自四川省农业科学院植物保护研究所内一处空地，土质为壤土，pH值7.4，此前5年内未使用任何农药。土壤样品经灭菌后，加入烟嘧磺隆使土壤中烟嘧磺隆含量为50mg/kg。将菌种接种于牛肉膏蛋白胨培养基活化18h后，以1.0 X 108CFU/g接种量加入到含烟嘧磺隆的土壤中，于黑暗条件下静置培养，试验期间土壤湿度控制在35-40%wt/wt，连续测定培养液中烟嘧磺隆残留量，其结果如附图所示。菌株NSA02在含50mg/kg烟嘧磺隆的土壤中培养96h，烟嘧磺隆降解率达到90.44%。
[0046]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种烟啼磺隆降解菌，其特征在于，所述烟啼磺隆降解菌为假单胞菌Pseudomonassp，保藏号为CGMCC N0.11523。2.—种如权利要求1所述烟嘧磺隆降解菌在受烟嘧磺隆污染土壤的微生物修复中的应用。3.如权利要求1所述的烟嘧磺隆降解菌，其特征在于，所述烟嘧磺隆降解菌的筛选方法包括:步骤一，菌源采自使用烟嘧磺隆的玉米田土壤，采集距表层2-6cm的土壤样品6份；步骤二，称取1g土样加入到20ml无菌蒸馏水中，充分打散，静置后取5ml上清液接种于45ml含50mg/L烟嘧磺隆的MSM培养基中，于32°C、150rpm培养7天；MSM培养基成分(g/L)NH3NO30.5；K2HPO4.3H20 1.05KH2PO41.05MgSO4.7H20 0.1；NaCl 0.2；CaCl2.6H2O 0.02,pH7.0； 步骤三，取培养液5ml转接至新鲜MSM培养基中，烟嘧磺隆浓度提高至100mg/L，同样条件下培养7天，然后取5mL培养液转移至新鲜MSM培养基中，如此反复6次，其中烟嘧磺隆浓度分别为50、100、150、200、250、3001^/1;将含烟嘧磺隆30011^/1的培养液按不同比例梯度稀释，分别涂布于含烟嘧磺隆50mg/L的MSM平板上，32°C培养5天，挑取边缘清晰的菌落，经反复平板划线纯化直到获得单菌落，并分别进行烟嘧磺隆降解能力测试； 步骤四，确定各菌株降解能力后，以牛肉膏蛋白胨培养基斜面保藏降解性能优良的菌株； 步骤五，菌株的鉴定。4.如权利要求3所述的烟嘧磺隆降解菌，其特征在于，所述菌株的鉴定具体包括: 第一步，烟嘧磺隆降解菌NSA02的菌落形态特征及生理生化特征:将已充分活化的菌株NSA02接种到LB培养基平板上，生长48h后观察菌落呈圆形，乳白色，较粘稠，表面光滑，中心关起； 第二步，菌株NSA02的16s rDNA鉴定:序列扩增采用正向引物5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，，反向引物5 ’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ’，以细菌总DNA为模板，PCR反应程序如下:95°(:变性5111丨11，951€308，531€308，721€908，共35个循环；72°(:10111丨11，41€保存，将得到的16S rRNA序列登录GenBank，进行Blast同源比对并构建进化树，初步鉴定菌株NSA02为假单胞菌Pseudomonas spD
【文档编号】B09C1/10GK105838638SQ201610022181
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年1月13日
【发明人】赵浩宇, 周小刚, 高菡, 朱建义, 刘胜男
【申请人】四川省农业科学院植物保护研究所