一种藤仓赤霉菌及其转化丁香酚合成松柏醛的方法
【专利摘要】本发明公开了一种藤仓赤霉菌及其转化丁香酚合成松柏醛的方法，属生物技术领域。本发明以丁香酚为底物，筛选获得一株的能够降解丁香酚积累松柏醛的菌株，藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)ZH?34，已于2016年4月5日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC NO:M 2016171，保藏地址是中国武汉武汉大学。利用该菌株转化丁香酚合成松柏醛，在丁香酚浓度为1g/L时，可产0.96g/L松柏醛，摩尔产率94％；当分次添加丁香酚进行转化，总丁香酚浓度6g/L，可产3.76g/L松柏醛，1.35g/L松柏醇。本发明提供了一种生物法制备松柏醛的新方法。CCTCC NO: M 201617120160405
【专利说明】
-种藤仓赤霉菌及其转化T香齡合成松柏酵的方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种藤仓赤霉菌及其转化下香酪合成松柏醒的方法，属生物技术领 域。
【背景技术】
[0002] 香精香料在食品、饲料、化妆品、化学和医药领域有广泛的应用。市场上的许多香 料化合物仍然是通过化学法或从植物和动物来源中萃取生产的。目前市场上的香料物质主 要W化学合成法生产的为主，但随着人们对物质生产过程中的关注及欧洲国家和美国法律 对食品添加物质的要求，生物发酵法及酶法合成的香料物质，被认为是天然的香料物质，越 来越受到人们的关注。到2011年市场对天然香料物质的需求达到218亿美元。运些天然香料 物质主要通过生物合成、植物法提取、酶和微生物转化获得。几种不同的苯酪类物质，如下 香酪、异下香酪、阿魏酸都可W作为底物，通过微生物酶的作用来合成香料物质。其中，下香 酪是下香油的主要成分，从桃金娘科植物下香(Syzigium aromati州m)中提取获得，具有来 源较广价格便宜（目前市场价格是5$/Kg)、市场容易获得的特点，被认视为一种具有应用价 值的底物。
[0003] 松柏醒(coniferyl aldehyde),又称阿魏醒，4-径基-3-甲氧基肉桂醒，分子式为 Ci〇Hi〇〇3，不易溶于水，纯品为淡黄粉末状，存在于针叶植物树材木质素中，为生物合成木质 素的中间体，松柏醒可被用作调香剂，抗真菌剂;前列腺素合成抑制剂;化学合成法主要有 由香草醒(vanillin)与乙醒缩合或W酸或碱分解木质素而得，利用微生物转化下香酪合成 的松柏醒的方法还未见报道。
[0004] 早在1977年，人们就开始研究降解下香酪的微生物。日本学者化dasa发现一株棒 杆菌(Corynebacterium sp.)具有降解下香酪生成松柏醇、阿魏酸和香兰素的能力；1996 年，法国Rabenhorst利用假单胞菌(Pseudomonas sp.)采用分批培养的方法，获得了3.22g/ L的松柏醇，3.25g/L的香草酸，5.8g/L的阿魏酸。1999年，日本化rukawa等采用真菌纯黄丝 衣霉(Byssochlamys化lvaV107)利用下香酪作为底物进行转化获得21.7g/L的松柏醇，并有 少量的松柏醒、阿魏酸和香草酸的生成。2003年，日本化rukawa等筛选出巧光假单胞菌 (Pseudomonas j Iuorescens El 18)，该菌能利用下香酪生成6 . Ig/L阿魏酸；2010年，印度 Kadakol等筛选出一株蜡样芽抱杆菌(Bacillus cereus PN24)，添加下香酪转化后，转化体 系中能检测到愈创木酪、香兰素、香草酸、原儿茶酸中间代谢物;2011年，伊朗Ashengro曲等 经分离获得了食树脂假单胞菌（Pseudomonas resinovorans SPRl)菌株，可转化下香酪获 得0.24g/L的香兰素；2014年，立陶宛616(1'曰;[1716等分离到嗜热溶±壤芽抱杆菌 (Geobacillus sp.AY 946034)菌株，该菌具有降解下香酪生成松柏醇、阿魏酸、香兰素、香 草酸的能力。运些研究中设及下香酪降解的代谢产物有松柏醇、松柏醒、阿魏酸、香兰素、香 草酸、原儿茶酸等，并且研究多数集中于细菌对下香酪降解代谢途径的分析，对于真菌的报 道相对较少。
【发明内容】
[0005] 本发明首先提供了一株高产松柏醒的微生物菌株。
[0006] 所述微生物菌株是藤仓赤霉(G;Lbberella化jiku;roi)ZH-34,已于2016年4月5日， 保藏于中国典型培养物保藏中屯、，保藏编号是CCTCC N0:M 2016171，保藏地址是中国武汉 武汉大学。
[0007] 所述藤仓赤霉能够转化下香酪依次生成松柏醇、松柏醒、阿魏酸、香草醒，但积累 松柏醒最多。
[000引所述藤仓赤霉在察氏培养基上25~30°C，培养5~7d后，菌落表面呈白色毛绒状， 底部略显浅青色，菌落中央质地均匀致密呈锻绒状，菌落边沿稀疏，有稍微的青色;光学显 微镜下观察，菌体为菌丝体，营养菌丝有横隔，能够进行出芽生殖，分生抱子梗自菌丝顶端 生出短小，简单，顶端渐细，抱子单生，圆形，未见串生。
[0009] 本发明还提供应用所述藤仓赤霉生产松柏醒的方法，是W藤仓赤霉CCTCC NO: M2016171全细胞或其生产的酶为催化剂，W下香酪为底物，构建转化体系生产松柏醒。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，将藤仓赤霉菌体添加到下香酪溶液中，30~35°C，80 ~18化/min震荡转化24~60h。所述菌体可W是湿菌体或者菌体粉剂。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，将藤仓赤霉种子液按6~10%的接种量接入发酵培 养基，28~30°C，80~18化/min震荡培养18~2地，添加底物下香酪，30~35°C，80~18化/ min震荡转化24~60h。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，将藤仓赤霉种子液按6~10%的接种量接入发酵培 养基，28~30°C，80~18化/min震荡培养18~2地，一次性添加终浓度为0.5~1.5g/L的下香 酪，30~35°C，80~180r/min震荡转化24~60h。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，将藤仓赤霉种子液按6~10%的接种量接入发酵培 养基，28~30°C，80~18化/min震荡培养18~2地，先添加终浓度为0.5~1.5g/L的下香酪， 30~35°C，80~18化/min，转化6~化，之后每间隔6~化添加下香酪;下香酪共添加4~6次， 总添加量为2~9g/L。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述下香酪W下香酪乳浊液的形式添加到转化体系 中。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述下香酪W下香酪乳浊液的形式添加到转化体系 中，下香酪乳浊液的制备:0.5~Iml的吐溫-80加入到50~100mL水中，115~12rC灭菌20~ SOmin后，添加1~2ml的下香酪，80~15化/min震荡乳化4~12h，制备成乳白色的下香酪乳 浊液。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基含:葡萄糖5~20g/L，酵母膏2~Ig/ 1^，1(2册04 1~5邑/1，]\%504 7出0 0.2~1.0邑/1，尸6504*7出0 0.1~0.2111邑/1，6曰(：12*2出0 0.1 ~0.4mg/L，H3B03 0.1~0.3mg/L，CuS04?5&0 0.02~0.04mg/L，KI0.05~0.1mg/L， MnS〇4* 7出00.1 ~0.4mg/L，NaMo〇4. 2出0 0~0.2mg/L，抑 6.5~7.5，装液量为50~10〇1111/ 500ml 摇瓶，115 ~12rC，灭菌 20 ~30min。
[0017] 本发明通过筛选，获得了一株降解下香酪高产松柏醒的藤仓赤霉，转化下香酪生 产松柏醒的摩尔产率达到90% W上。本发明提供了一种生物法制备松柏醒的新方法。
[001引生物材料保藏
[0019] 藤仓赤霉(Gibberellafujiku;roi)ZH-34,已于2016年4月5日，保藏于中国典型培 养物保藏中屯、，保藏编号是CCTCC N0:M 2016171，保藏地址是中国武汉武汉大学。
【附图说明】
[0020] 图1发酵转化液的高效液相色谱；图A混合标样，a:香草酸;b:松柏醇;C:香草醒;d: 阿魏酸；e:松柏醒;f:下香酪，保留时间a: 11.37min;b: 14.32min;c: 15.27min;d: 16.31min; e: 22.86min; f: 26.41min;图B发酵转化液样品，b:松柏醇;C:香草醒;e:松柏醒;f:下香酪保 留时间b: 14.32min;c: 14.38min;e:22.85min;f :26.39min。
【具体实施方式】
[0021] 筛选菌种所用的薄层层析法:所用展开剂是正己烧、=氯甲烧、无水乙酸、乙酸乙 醋和冰醋酸(参照李永红等化C方法同时监测生物转化过程中的阿魏酸、香草酸和香草醒）， 该法能在较短的时间内，快速检测大批量的待筛菌株的转化液。
[0022] 分析菌种转化下香酪生成的产物的高效液相色谱法检测条件是:检测波长280~ 300皿，柱溫25~30°C，进样量10~20化，两种流动相A(乙腊），流动相B(0.1 %乙酸)进行梯 度洗脱，0~4minl0~15%A，85~90%的B，流速0.8~lml/min;4~20min 25~30%A，70~ 75%的B，流速0.8~lml/min;20~30min 70~80%A，20~30%B，流速0.8~lml/min;30~ 35minl0 ~15%A，85 ~90% 的 B，流速 0.8 ~Iml/min。
[0023] 分析菌种转化下香酪生成的产物的高效液相色谱和质谱联用法检测条件是:检测 波长200~600皿，柱溫40~45°C，进样量1~化L，两种流动A(乙腊），流动相B(0.1%甲酸)进 行梯度洗脱，0~17min 5~10%A，90~95%B，流速0.3~0.5ml/min;17~20min 60~70% 八，30~40%8，流速0.3~0.51111/111111;20~22111111，90~100%4,0~10%8，流速0.2~0.31111/ 111111;22~251111115~10%4,90~95%8，流速0.3~0.51111/111111。
[0024] 下香酪乳浊液的制备:0.5~Iml的吐溫-80加入到50~1 OOml水中，115~12 rC灭 菌20~30min后，添加1~2ml的下香酪，震荡（80~15化/min)乳化4~12h，制备成乳白色的 下香酪乳浊液。
[0025] 斜面培养：1~lOg/L的葡萄糖，马铃馨汁100~250g/L，琼脂20~25g/L，115~121 °C，灭菌20~30min，制成斜面接种，25~30°C，培养5~7d。
[0026] 种子的培养：1~lOg/L的葡萄糖，马铃馨汁100~250g/L，酵母膏1~5g/L，115~ 12rC，灭菌20~30min，接种后25~30°C，90~llOr/min，培养18~2地。
[0027] 发酵培养基：含葡萄糖5~20g/L，酵母膏2~lg/L，K2册〇4 1~5g/L，MgS〇4 7出0 0.2~1.0邑/1，尸6504*7此0 0.1~0.2111邑/1，6曰(：12*2出0 0.1~0.4111邑/1，出803 0.1~0.3111邑/ 1，加 504*5出00.02~0.04111邑/1，1(10.05~0.1111邑/1，]\111504*7肥0 0.1~0.4111邑/1，胞]\1〇04* 2此0 0~0.2mg/L，pH 6.5~7.5，装液量为50~1001111/5001111摇瓶，115~121°(：，灭菌20~ 30111111，按6~10%的接种量进行接种，25~30°(：，80~18化/111111，培养18~2411，加0.5~ 1.5g/L 的下香酪，30 ~35°C，80 ~180r/min，转化 24 ~72h。
[00%]选择培养基:硝酸锭1. Og/L，屯水硫酸儀0.5g/L，硫酸锭0.5g/L，憐酸二氨钟0.5g/ L，憐酸氨二钟1.5g/L，氯化钢0.5g/L，酵母膏2.0g/L，自然抑。
[0029] 富集培养基:5g/L酵母膏，lOg/L蛋白腺，lOg/L葡萄糖，自然抑。
[0030] 实施例1降解下香酪菌株的筛选与鉴定
[0031] 分别采集福建厦口、安微淮安、河南新乡、黑龙江抚远及江苏无锡5个地方不同地 点的3~IOcmi壤样品，采集的±样分别称3~6g加入到30~60ml，115~12rC灭菌的生理 盐水中，25~30°C，90~15化/min,震荡混匀15~30min。无菌条件下取3~61111上±样清液按 8~12%的接种量接种到含有下香酪乳浊液的选择培养基中，25~30°C，90~15化/min,选 择培养2~5d后，按4~10%的接种量接种到含有下香酪的富集培养基中进行富集培养，25 ~30°C，90~15化/min,培养2~5d，分别涂布到含有下香酪的细菌平板、高氏一号和蔡氏平 板培养基上，25~3(TC培养3~5d，观察有无菌落的生成。有菌落生成的，挑取生长良好的单 菌落，分别划线于含有下香酪的斜面培养基中，培养2~5d，转接到装有种子培养基的24孔 培养板中（实验室保存的霉菌斜面培养后直接接种子培养基），25~30°C，90~15化/min，培 养18~36h，然后加入终浓度为0.5~1.5g/L的下香酪乳浊液转化培养24~4她，转化结束 后，TLC法检测转化结果，共获得了 146株能降解下香酪的菌株，将运些菌株摇瓶进行复筛 后，高效液相色谱初步检测分析生成的产物，最后获得一株ZH-34菌，能转化下香酪依次生 成松柏醇、松柏醒、阿魏酸、香草醒，但能积累松柏醒。
[0032] 菌株ZH-34进行形态鉴定:在察氏培养基上25~30°C，培养5~7d后，菌落表面呈白 色毛绒状，底部略显浅青色，菌落中央质地均匀致密呈锻绒状，菌落边沿稀疏，有稍微的青 色，光学显微镜下观察，菌体为菌丝体，营养菌丝有横隔，能够进行出芽生殖，分生抱子梗自 菌丝顶端生出短小，简单，顶端渐细，抱子单生，圆形，未见串生。
[0033] 将菌体涂布到固体平板培养基上，3(TC培养5-7d，后，按照真菌基因组快速抽提试 剂盒进行真菌基因组的提取。选择真核生物ITS通用扩增引物（上游引物ITSl :5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ；下游引物ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），PCR扩增ITS区 域，1 %的琼脂糖凝胶电泳检测后。测序结果在GeneBank进行Blast序列比对。该菌经形态学 和分子生物学鉴定为藤仓赤霉菌(GibberelIafujikuroi)。
[0034] 实施例2利用G比berella化jikuroi ZH-34转化下香酪生成松柏醒
[0035] 将菌株ZH-34转接到斜面培养基中，25~30°C培养5~7d，转接到种子培养基中，25 ~30°C，90~11化/min,培养18~2地，按6%~8%的接种量转接到发酵培养基，25~30°C， 90~1 lOr/min，培养18~24h后，分别加入终浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5g/L的下香酪（W 浓度20g/L的下香酪乳浊液的形式添加），30~35°C，90~11化/min,转化50h;处理后进行 HPLC检测结果如下表1，其中1 .Og/L下香酪条件下的摩尔产率为94%。
[0036] 表1底物浓度对G.fuj化uroi ZH-34转化下香酪产松柏醒的影响 「00371 LUUdUJ 乂/Jtli |7。〇恤戍八」/ T么T口 6王口'J尿夕H鬥
[0039]将菌株ZH-34转接到斜面培养基中，25~30°C培养5~7d，转接到种子培养基中，25 ~30°C，90~11化/min,培养18~2地，按6%~8%的接种量转接到发酵培养基，25~30°C， 90~llOr/min，培养18~24h后，加入终浓度为l.Og/L的下香酪m浓度20g/L的下香酪乳浊 液的形式添加），分别在溫度为25°C、30°C、35°C、40°C、45°C条件下，90~11化/min，转化 50h;处理后进行HPLC检测结果如下表2,其中35°C条件下，1.0g/L的摩尔产率为92%。
[0040] 表2溫度对G.fuj化Uroi ZH-34转化下香酪产松柏醒的影响
[0042] 实施例4利用G比berella化jikuroi ZH-34间歇添加下香酪生成松柏醒
[0043] 将菌株ZH-34转接到斜面培养基中，25~30°C培养5~7d，转接到种子培养基中，25 ~30°C，90~11化/min,培养18~2地，按6%~8%的接种量转接到发酵培养基，25~30°C， 90~11化/min,培养18~24h后，加入终浓度为0.5~1.5g/L的下香酪（W浓度20g/L的下香 酪乳浊液的形式添加），30~35°C，90~11化/min,转化6~化，之后每间隔6~8h添加下香酪 乳浊液用于转化，共添加4~6次，下香酪总添加量为2~9g/L，转化结束能获得1.2~3.75g/ L的松柏醒，松柏醒的摩尔产率为38.2 %~55 %。
[0044] 实施例5
[0045] 将菌株ZH-34转接到斜面培养基中，25~30°C培养5~7d，转接到种子培养基中，25 ~30 °C，90~11化/min，培养18~2地，8000巧m低溫离屯、收集菌体，用pH7.0的憐酸盐缓冲 液，将收集得到的菌体按质量分数50 %制备菌悬液。取50ml菌悬液，添加30化1 (6g/L)下香 酪乳浊液同时加入15化1吐溫-80，1^巧111，30°(：震荡摇床培养化后，再加入20化1(4旨/1)的 下香酪乳浊液，继续转化4她后。将转化液10倍稀释后进行HPLC检测，结果显示，游离细胞转 化下香酪生成4.77g/L的松柏醒和21mg/L的香草醒。此时转化体系中还有2g/L的下香酪剩 余，松柏醒的摩尔转化率为56.3%。
[0046] 虽然本发明已W较佳实施例公开如上，但其并非用W限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该W权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)ZH_34,已于2016年4月5日，保藏于中国典型 培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC NO:M 2016171，保藏地址是中国武汉武汉大学。2. -种应用权利要求1所述藤仓赤霉生产松柏醛的方法，其特征在于，是以藤仓赤霉 CCTCC NO:M 2016171全细胞或其生产的酶为催化剂，以丁香酚为底物，构建转化体系生产 松柏醛。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将藤仓赤霉菌体添加到丁香酚溶液中，30 ~35°C，80~180r/min震荡转化24~60h。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将藤仓赤霉种子液按6~10%的接种量接 入发酵培养基，28~30°C，80~180r/min震荡培养18~24h，添加底物丁香酚，30~35°C，80 ~180r/min震荡转化24~60h。5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将藤仓赤霉种子液按6~10%的接种量接 入发酵培养基，28~30°C，80~180r/min震荡培养18~24h，一次性添加终浓度为0.5~ 1.5g/L 的丁香酚，30 ~35°C，80 ~180r/min 震荡转化 24 ~60h。6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将藤仓赤霉种子液按6~10%的接种量接 入发酵培养基，28~30°C，80~180r/min震荡培养18~24h，先添加终浓度为0.5~1.5g/L的 丁香酚，30~35°C，80~180r/min，转化6~8h，之后每间隔6~8h添加丁香酚;丁香酚共添加 4~6次，总添加量为2~9g/L。7. 根据权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于，所述丁香酚以丁香酚乳浊液的形式 添加到转化体系中。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述丁香酚乳浊液的制备:0.5~lml的吐 温-80加入到50~100ml水中，115~121 °C灭菌20~30min后，添加1~2ml的丁香酸，80~ 150r/min震荡乳化4~12h，制备成乳白色的丁香酸乳池液。9. 根据权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含:葡萄糖5~20g/ 1^，酵母膏2~18/1，1(2册〇4 1~58/1，]\%5〇4 7!12〇0.2~1.(^/1，卩65〇4*7!12〇0.1~0.211^/1， GaCl2.2H20 0.1~0.4mg/L，H3B03 0.1~0.3mg/L，CuS04*5H20 0.02~0.04mg/L，KI0.05 ~0.111^/1，]\111504.7!120 0.1~0.411^/1，恥]\1〇04.2!120 0~0.211^/1印!16.5~7.5，装液量 为50~100ml/500ml摇瓶，115~121 °C，灭菌20~30min。10. 权利要求1所述藤仓赤霉的应用，其特征在于，所述应用的领域包括食品、饲料、化 妆品、化学和医药领域，用于生产包括松柏醛、松柏醇、阿魏酸、香草醛在内的化合物。
【文档编号】C12N1/14GK105838626SQ201610296678
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】郑璞, 陈鹏程, 张慧
【申请人】江南大学