一株冬虫夏草菌株及冬虫夏草菌丝体粉的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种冬虫夏草菌株（Ophiocordyceps sinensis）以及冬虫夏草菌丝体粉的制备方法。利用新分离得到的冬虫夏草菌株在米培养基上生长，模拟冬虫夏草自然生长培养物，获得具有高虫草酸含量的虫草菌丝，实现冬虫夏草的固体发酵，对替代日趋减少的冬虫夏草野生资源和保护西部地区逐步恶化的生态环境具有不可估量的社会和经济效益。CCTCC：M 201604120160118
【专利说明】
一株冬虫夏草菌株及冬虫夏草菌丝体粉的制备方法
技术领域
[0001 ]本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株生长良好的冬虫夏草新菌株，并将其 接种到米培养基上，生长产生类似于野生虫草的表面菌丝覆膜，具有较高的虫草酸含量。
【背景技术】
[0002] 冬虫夏草，寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，属于可食用 的真菌。冬虫夏草是我国一种传统的名贵滋补中药材，有调节免疫系统功能、抗肿瘤、抗疲 劳等多重功效。冬虫夏草中含量最高的活性物质是冬虫夏草多糖，因其可以抗氧化、抗肿瘤 和增强免疫力等功效而受广大人群青睐。虫草酸(D-甘露醇)是虫草的一个重要质量指标， 它不是虫草特有的酸，而是甘露醇(C6H1406)，也是冬虫夏草多糖（由甘露糖、半乳糖、阿拉伯 糖、葡萄糖、岩藻糖等组成的多聚糖）的主要组分之一，具有抗自由基、抗氧化的作用，其在 治疗脑血栓、脑栓塞、血管痉挛、脑溢血、排除毒索、肾功能衰竭、促进新陈代谢等方面具有 疗效。冬虫夏草中的另一主要活性成分是虫草素，其有调节免疫系统功能、抗肿瘤、抗疲劳 等多种功效。
[0003] 冬虫夏草由于分布地区狭窄、自然寄生率低、对生活环境条件要求苛刻，所以本身 资源比较有限。近年来又由于冬虫夏草主产地生态环境遭到人为严重破坏，大量盲目不合 理采挖致使资源日趋减少，产量逐年下降。保护和合理利用冬虫夏草资源，寻求通过人为干 预促进其生存繁衍的新途径，以满足不断增长的保健与药用的需求，已经成为迫在眉睫的 任务。
【发明内容】
[0004]本发明利用分离得到一株新的冬虫夏草(0. sinensis)菌株在米培养基上生长，模 拟冬虫夏草自然生长培养物，获得高虫草酸含量的虫草菌丝，实现冬虫夏草的固体发酵，对 替代日趋减少的冬虫夏草野生资源和保护西部地区逐步恶化的生态环境具有不可估量的 社会和经济效益。
[0005] 本发明的一个目的提供一种冬虫夏草菌株，该菌株于2016年1月18日保藏于中国 典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为：CCTCC:M 2016041，菌株名称为冬虫夏草菌株 2013HY(0phiocordyceps sinensis 2013HY)，保藏地址：中国武汉武汉大学。菌落呈浅黄 色，菌落与培养基结合不紧密，用接种针易挑起，表面光滑，湿润，较粘稠，易挑取，质地均 匀。
[0006] 所述冬虫夏草菌株的18s rRNA的序列包括以下SEQ.N0.1序列：
[0007] TTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACTGGAGGGTGTGGTGGTT TCACGGCGTGACCGCCTCCGCGCTCCCGGTGCGAGGTTCTCAGCGAGCTACTGCGCAGGGGAGCCGCGGCGGGGTCG CCACTGCGTTTAGGGGGCGGCGCGGGGCCGTGACCCCCAAGGCCGGGCCCCGCCGCCGCGAGGCGGGGGGCTCGAGG GTTGAGATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAGTGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGGTTCA CTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTT GAAAGTTTTGATTCATTTGCTTGCTTCTTGACTGAGAGATGCCACTGCGACAGGAGGGTCTGGGGGTCCTCCGGCGG GCGCCCTGGTCCGGGCCCTGGGGCGCCGGGGCGGTCCCGCCGAGGCAACTGCTGTGGTGTTCGCAGGGGGTTTGGGA GTGGTGACTCGATAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGATTTTTACTTCCA
[0008] 本发明的第二个目的是提供冬虫夏草菌丝体粉的制备方法，包括以下步骤：
[0009] (1)提供一株冬虫夏草菌株;所述虫草菌株的保藏号为CCTCC:M 2016041;
[0010] (2)接种入固体培养基，黑暗条件下20°C下培养5~10天；
[0011] (3)接种至液体培养基，20°C发酵培养6~8天得虫草菌液；
[0012 ] (4)将步骤(3)中的虫草菌液接种到米培养基中，25 °C下，24h光照培养7天，得菌丝 体，菌丝体经抽滤、烘干粉碎后得冬虫夏草菌丝体粉。
[0013] 进一步地，步骤2固体培养基按葡萄糖:酵母粉:蛋白胨:琼脂为4:1:1:1~1.5的重 量比例配制，菌种接种量为1~5%。
[0014] 步骤3液体培养基为SDB液体培养基，含葡萄糖4%、酵母粉1 %、蛋白胨1 %，余量为 水。
[0015] 本发明通过虫草菌在米培养基上的生长情况，对影响其生长的因素进行了最优筛 选，结果得到，本菌种在米培养基上的最适生长条件为24h光照，培养温度25°C。
[0016]步骤4中米培养基的制备方法为：取稻米加入足量沸水浸泡30min;用水冲洗4~5 次，沥干；12?Γ、15π?η灭菌处理后冷却至室温，将已灭菌的大米加入SDB培养液，搅拌后将 大米均匀的铺在培养皿中。
[0017]虫草菌液接种方法包括:取干燥洁净的15mL离心管，加入培养所获得的虫草菌液， 7000rpm离心3min，去上清，加入10mL无菌水混勾清洗，7000rpm离心5min后再次去除上清， 向沉淀菌体中加入0.01 % Tween80溶液，轻轻混勾成悬池状态待喷雾用，取制作好的米培养 基，使喷雾器的喷头与培养基表面呈90°角垂直喷洒，虫草菌液与米培养基的体积重量比为 1:1〇
[0018]冬虫夏草虫草酸、虫草素活性物质的含量分别采用下述方法测定:Nash试剂法测 定虫草酸(D-甘露醇)含量;液相色谱法测定虫草素含量。
[0019] 本发明的有益效果：本发明利用分离得到一株新的冬虫夏草菌株（CCTCC Μ 2016041)在米培养基上生长，模拟冬虫夏草自然生长培养物，获得具有高虫草酸含量的虫 草菌丝，可实现冬虫夏草的固体发酵。在米培养基中生长得到的虫草菌株的甘露醇含量为 8.42±0.45mg/g，显著高于各类虫草产品（甘露醇含量一般在1.1~1.3mg/g)，取得了意料 不到的技术效果。说明本发明所筛选得到的虫草菌株在米基础培养基上仍保有较高的虫草 酸含量，为进一步制备冬虫夏草系列产品的提供保障，对替代日趋减少的冬虫夏草野生资 源和保护西部地区逐步恶化的生态环境具有不可估量的社会和经济效益。
【附图说明】
[0020] 图1是测定虫草菌米培养第三天、第六天、第九天的菌增重量示意图。
【具体实施方式】
[0021] 本发明所述冬虫夏草菌株的保藏说明：保藏菌株名称为冬虫夏草菌株2013HY (Ophiocordyceps sinensis 2013HY)，该菌株已于2016年1月18日保藏于中国典型培养物 保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学。保藏编号为:CCTCC:Μ 2016041。
[0022]实施例1冬虫夏草菌的分离
[0023] 其菌种的分离采用组织分离法采集未成熟的新鲜冬虫夏草。洗净，用无菌水多次 冲洗，放入0.1%升汞溶液中消毒5分钟，用灭菌蒸馏水洗去升汞。在无菌条件下，切去外皮， 避开肠道，切取白净组织，剪碎，接于分离培养基表面，至于5~20°C温度条件下培养。上述 方法使用的分离培养基的配方为SDB液体培养基。所述SDB液体培养基包括葡萄糖4 %、酵母 粉1 %、蛋白胨1 %。
[0024] 实施例2冬虫夏草的新菌株的纯化鉴定
[0025]中国冬虫夏草真菌菌种的鉴定，发现菌落斑、形态、大小一致，并通过显微镜对菌 丝进行镜检，菌种单纯无杂菌污染。菌落呈浅黄色，菌落与培养基结合不紧密，用接种针易 挑起，表面光滑，湿润，较粘稠，易挑取，质地均匀。可采用液体发酵方法加快菌丝的培养，获 得的人工虫草菌丝经分子生物学18s rRNA鉴定为Ophiocordyceps sinensis。
[0026] 本发明所述人工冬虫夏草真菌菌株(CCTCC:M 2016041)的18s rRNA的序列包括以 下序列（SEQ.N0.1):
[0027] TTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACTGGAGGGTGTGGTGGTT TCACGGCGTGACCGCCTCCGCGCTCCCGGTGCGAGGTTCTCAGCGAGCTACTGCGCAGGGGAGCCGCGGCGGGGTCG CCACTGCGTTTAGGGGGCGGCGCGGGGCCGTGACCCCCAAGGCCGGGCCCCGCCGCCGCGAGGCGGGGGGCTCGAGG GTTGAGATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAGTGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGGTTCA CTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTT GAAAGTTTTGATTCATTTGCTTGCTTCTTGACTGAGAGATGCCACTGCGACAGGAGGGTCTGGGGGTCCTCCGGCGG GCGCCCTGGTCCGGGCCCTGGGGCGCCGGGGCGGTCCCGCCGAGGCAACTGCTGTGGTGTTCGCAGGGGGTTTGGGA GTGGTGACTCGATAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGATTTTTACTTCCA。
[0028]实施例3液体菌丝的发酵
[0029] 将实施例2中鉴定得到的菌种Ophiocordyceps sinensis(菌种保藏编号为CCTCC: M2016041)接种入固体培养基，黑暗条件下20°C下培养5~10天后转接种到SDB液体培养基 (葡萄糖4%、酵母粉1%、蛋白胨1%)上，装量为100ml/250ml三角瓶，培养温度20°C， 150rpm。培养6~8天。
[0030] 实施例4米培养基培养
[0031] (1)米培养基的制作
[0032]称取200g大米放入烧杯中，加入足量的沸水，搅匀，浸泡30min后用水冲洗4~5遍， 用纱布彻底滤干后放入60 °C烘箱中烘干15~30min。取出后用锡箱封好放入高压灭菌锅121 °C，15min灭菌。将已灭菌的大米均匀分开后加入上述SDB培养液15mL，充分搅拌使得培养液 和大米混匀。再将大米均匀的铺在9cm培养皿中，每个培养基加10g灭过菌的大米。
[0033] (2)米基虫草菌株的接种方法
[0034] 取3支干燥洁净的15mL离心管，依次加入5mL，10mL，15mL上述培养所获得的虫草菌 液，7000rpm离心3min，去上清，加入10mL无菌水混勾清洗，7000rpm离心5min后再次去除上 清，向沉淀菌体中加入13mL 0.01 %TWeen80溶液，用枪头轻轻混匀成悬浊状态待喷雾用。取 制作好的上述米培养基，使喷雾器的喷头与培养基表面呈90°角垂直喷洒，每个培养基喷洒 1.5mL，每一种浓度处理9重复。
[0035]米虫草菌生长最优条件筛选的正交试验设计见表1。
[0036] 表1正交试验设计表
[0037]
[0038]图1显示了测定虫草菌米培养第三天、第六天、第九天的菌增重量结果。由表2可 知，极差分析结果可得就第三天的增重量数据正交分析的试验号5与其余几组有明显差异， 试验号为5的培养条件为24h光照，培养温度25 °C，10mL的菌接种量。第六天的菌增重量，以 试验号5，6，9的数据显著性差异最多。到第九天时虫草菌几乎覆盖米表面，各组实验所得的 菌增重量都没有显著性的差异。所以可得出结论，培养虫草菌的最是条件为24h光照，培养 温度25°C和10mL的菌接种量，即1:1 (mL: g)的菌米接种体积重量比。
[0039]表2各因素在第三天，第六天及第九天所得的极差值比较：
[0040]
[0041]实施例5米培养基虫草菌虫草酸(D-甘露醇)的含量测定 [0042] (1)甘露醇标准曲线的测定
[0043]称取lg的甘露醇于大烧杯中，量取1L去离子水配制成lmg/mL的甘露醇溶液，取6支 试管分别编号为1~6,向其中加入0. lmL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL的lmg/mL的甘露醇溶 液，再加入去离子水，使格试管中的甘露醇浓度分别为10yg/mL、20yg/mL、30yg/mL、40yg/ mL、50yg/mL、0yg/mL。将配置得到的溶液分别取lmL至新的试管，试管对应标记1~6。再向各 试管中加入lmL高碘酸钠溶液，室温放置lOmirulOmin后向其中加入2mL0.01%L-鼠李酸，最 后加入1 mL的Na s h试剂，5 3 °C水浴加热15m i η。
[0044] (2)虫草甘露醇含量的测定
[0045] 取培养完全的固体培养基上的虫草菌置于一个干燥的灭过菌的培养皿中，放在60 °C的烘箱中烘干过夜。称取烘干后的虫草菌0.5g置于一个50mL的离心管中超声15min，离心 取上清，再次离心后取上清置于一个5mL的离心管中，加入一定量的去离子水定容至5mL即 0.18/!1114寺用。取6支试管分别编号为1~6，向其中加入0.11^、0.21^、0.31^、0.41^、0.51^的 0. lg/mL的虫草液，再加入去离子水，使各试管中的虫草液浓度分别为lmg/mL、2mg/mL、3mg/ mL、4mg/mL、5mg/mL、Omg/mL。将配置得到的溶液分别取lmL至新的试管，试管对应标记1~6。 再向各试管中加入lmL高碘酸钠溶液，室温放置lOmin。lOmin后向其中加入2mL 0.01 %L-鼠 李酸，最后加入1 mL的Na s h试剂，5 3 °C水浴加热15m i η。
[0046] 实验得甘露醇含量的标准曲线，其回归方程为y = 66.367χ+0.0641，R2 = 0.9982在 将实验得到的虫草菌的样品中测得的0D值带入到回归方程中，甘露醇在本发明中的米基虫 草菌株中的含量为8.42±0.45mg/g。
[0047] 实施例6米培养基虫草菌虫草素的含量测定
[0048] 采用液相色谱法进行虫草素的测定，色谱柱为incrtsilS〇DS-3(4.6mmX 250mm, 5μ m)，柱温30°C。检测器为二极管阵列紫外检测器，检测波长260nm。流动相乙腈:水= 80:20， 流速 0 · 8ml/min〇
[0049] 实施例7对液体发酵和米基固体培养菌丝体粉的虫草酸和虫草素与天然冬虫夏草 进行了比对，如下表3。
[0050] 表 3
[0051]
[0052]在本发明涉及的虫草菌株CS141020,在米培养基中生长得到的虫草菌株的甘露醇 含量为8.42±0.45mg/g，显著高于各类虫草产品（甘露醇含量一般在1.1~1.3mg/g)。
[0053]测定上述实施例液体培养的菌丝体粉的虫草素含量为20.13±3.61(yg/g)和 19.85±4.95(yg/g);天然冬虫夏草中虫草素的含量为21.05±6.39(yg/g)，菌丝体粉比天 然冬虫夏草中虫草素含量差异不显著。
【主权项】
1. 一种冬虫夏草菌株，其特征在于，所述冬虫夏草菌株保藏于中国典型培养物保藏中 心，菌种保藏编号为CCTCC:M 2016041。2. 根据权利要求1所述的冬虫夏草菌株，其特征在于，所述冬虫夏草菌株的18s rRNA的 序列包括SEQ. N0.1序列。3. -种冬虫夏草菌丝体粉的制备方法，包括以下步骤： (1) 提供一株冬虫夏草菌株;所述虫草菌株的保藏号为CCTCC: Μ 2016041; (2) 接种入固体培养基，黑暗条件下20°C下培养5~10天； (3) 接种至液体培养基，20°C发酵培养6~8天得虫草菌液； (4 )将步骤(3 )中的虫草菌液接种到米培养基中，25 °C下，24h光照培养7天，得菌丝体， 菌丝体经抽滤、烘干粉碎后得冬虫夏草菌丝体粉。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2固体培养基按葡萄糖:酵母粉： 蛋白胨:琼脂为4:1:1: 1~1.5的重量比例配制，菌种接种量为1~5%。5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3液体培养基为SDB液体培养基， 含葡萄糖4%、酵母粉1%、蛋白胨1%，余量为水。6. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤4中米培养基的制备方法为:取稻 米加入足量沸水浸泡30min;用水冲洗4~5次，沥干；121°C、15min灭菌处理后冷却至室温， 将已灭菌的大米加入SDB培养液，搅拌后将大米均匀的铺在培养皿中。7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤4虫草菌液接种方法包括:取干燥 洁净的15mL离心管，加入培养所获得的虫草菌液，7000rpm离心3min，去上清，加入10mL无菌 水混勾清洗，7000rpm离心5min后再次去除上清，向沉淀菌体中加入0.01% Tween80溶液，轻 轻混匀成悬浊状态待喷雾用，取制作好的米培养基，使喷雾器的喷头与培养基表面呈90°角 垂直喷洒，虫草菌液与米培养基的体积重量比为1:1。
【文档编号】C12N1/14GK105838625SQ201610279820
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】陈春, 章树桃, 谢昕, 顾菲丹
【申请人】中国计量大学